Штамм клубеньковых бактерий вrаdyrнizовiuм sp. (аsтrаgаlus) для производства бактериального удобрения под астрагал

 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии , в частности к получению микробиологических средств повышения урожайности бобовых культур (астрагала ) . Цель изобретения - получение штамма клубеньковых бактерий Bradyrhizobium sp. для производства бактериального удобрения под астрагал. Штамм клубеньковых бактерий Bradyrhizobium sp. (Astragalus) выделен из клубеньков астрагала болотного, депонирован во ВНИИСХМ иод № 0206. Штамм позволяет увеличить урожай зеленой млссы астра ала на 10,8 ц/га

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТ0РСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (2 1) 4686599/ 13 (22) 03.05.89 (46) 23. 12.91. Бюл. К - 47 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии (72) А.Т.Новикова, В.Л.Князева, А.П.Кожемяков и Н.Г.Орищенко .(53) 631.847.211(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

В 1036718, кл. С 05 Е 11/08, 1982. (54) ЕТЫМИ КЛУБЕНЪКОВЫХ БАКТЕРИЙ

BRADYRHIZ0BIUH SP ° (ASTRACALUS) ДЛЯ

ПРОИЗВОДСТВА БАКТЕРИАЛЪНОГО УДОБРЕНИЯ ПОД АСТРАГАЛ (57) Изобретение относится к сельскоИзобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, в частности к получению микробиологических средств повышения урожайности бобовых культур, а именно астрагала.

Целью изобретения является получение нового штамма клубеньковых бактерий Bradyrhizobium sp. для производства бактериального уцобрения под астрагал.

Штамм Вгас!у«:Ьхzobium sp. (Astragalus) выделен из клубеньков астрагала болотного дикой популяции.

Идентифицирован по определителю бактерий Берги.

Штамм Bradyrhizobium.sp. (Astragalus) депонировал и хранится в коллекции клубеньковых бактерий ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под номером 0206.

„,ЯЦ„„169999О А 1 (g))g С 05 F 11/08, С 12 N 1/20

2 хозяйственной микробиологии и биотехнологии, в час ности к получению микробиологических средств повышения урожайности бобовых культур (астрагала). Цель изобретения — получение штамма клубеньковых бактерий Bradyrhizobium sp. для производства бактериального удобрения под астрагал.

Штамм клубеньковых бактерий Bradyrhizabium sp. (Astragalus) выделен из клубеньков астрагала болотного, депонирован во ВНИИСЯ! под Ф 0206.

Штамм позволяет увеличить урожай зеленой массы астрагала на 10,8 ц/га (43,07), содержание белка в растениях увеличиваечся на ",9R. 5 табл.

Культурно-морфоло.и-råñêèå признаки.

Штамм 0206 растет на питательных средах следующего сос-.aíà:

Гороховый агар, г/л: горох

100,0, сахароза 20,0; агар 2; рН сре ды 6,8-7, О.

2. !ан-.житно-црожжевой агар, г/л: маннит 10,О; К НРО4. 0,5, И880ф х .х 7Н О О, ; МаС". 0,1; дрожжевой экстракт О,-"., агар 15,0, рН среды

6,8-7,0.

3. !"!а«ннитно-дрожжевой агар с бромтимол син-.лм, г/л. маннит 10,,0, К<НРО

0,5, ИМБО х 7H„0 0,2; Na01 0,1, дрожжевой экстракт 0,4; агар 15,0, брсмтимол синий 5 мл 0,5Х-íîãñ спиртового pañòâîða, рН среды 6,8-7,0.

Бактерии штамма 0206 имеют форму ко отких толстых и;почек, по 72 ч

IIopçHæHû, монотрихи, грамотрицатель1699990 ные. Величина клеток 5-тисуточной культуры на маннитно-дрожжевом агаре

1,8-2,4х10,0-1,1 мкм. Бактероиды имеют ветвистую. форму. Медленно растущая

5 культура.

При культивировании штамма на гороховом агаре при 26-28 С рост о обильный, колонии появляются на

7-е сутки, беловатые, слизистые, стекающие, круглые, выпуклые, размером 5-6 мм.

На маннитно-дрожжевом агаре штрих обильный, бесцветный, слизистый, сильно стекающий, плоский. Колонии появляются на 7-е сутки, однотипные, беловатые, круглые, выпуклые, расте- . .кающиеся, 5-6 мм.

На,маннитно-дрожжевом агаре с бромтимол синим признаки штамма 0206 аналогичны росту на маннитно-дрожжевом arape, но культура окрашивается; в желтоватый цвет, а среда — в зеленоватый, Параметры температуры и рН. как на гороховом агаре, 25

Физиолого-биохимические признаки.

Молоко с лакмусом не пептониэирует, на 3-е сутки интенсивно подщелачивает с образованием слизистой

30 .зоны (через 15 суток — 7 мм) на по. верхности, Белатину не разжижает.

Аэроб оптимум температуры 26-28 С, 0

Ф о ,Рост при 10-40 С, рН вЂ” 5,0-7,,5.

Отношение к углеводам.

Растет на многих углеводах с подкислением среды. Активно усваивает глюкозу, галактозу, сахарозу,, ксило;эу, маннит, сорбит, слабее — рамно зу, мальтозу, лактоэу, декстрин.

:Клетчатку и крахмал не усваивает.

Отношение к источникам азота.

Хорошо растет на средах с азотнокислым натрием, аммонийными солями, тирозином, на мясо-пептонном агаре не растет, Признаки штамма устойчивы. Штамм не патогенен.

Штамм 0206 хранится на гороховом агаре при 4 С, рН 6,8-7,0 и пересевается один раз в 6 месяцев.

Оценку симбиотических свойств штамма 0206 — вирулентности, азотфиксирующей активности и эффективности симбиоза — проводят в условиях

Микровегетационного и вегетационного опытов ° 55

Вирулентность определяют по количеству и морфологии клубеньков, образованных при инокуляции астрагала клубеньковыми бактериями. Аэотфикси рующую активность штаммов определяют по величине активности нитрогеназы— ключевого фермента в процессе связы- вания молекулярного азота. В свою очередь, нитрогенаэную активность измеряют ацетиленовым методом (по ре дукции ацетилена) на интактных растениях. Эффективность симбиотической аэотфиксации определяют по общему накоплению азота растениями на сосуд, а также по величине урожая зеленой массы астрагала и содержанию в ней азота, который определяют с помощью системы Кьельтек-ауто Текатор.

Пример 1. Оценки симбиотических свойств штамма 0206.

Микровегетационный опыт.

В большие пробирки с 5 г стерильного вермукулита добавляют 11 мл среды Красильникова-Кореняко, стерилизируют в автоклаве. Семена астрагала серпоплодного, видообразца из

ВИРа скарифицируют, затем стерилиэуют

;сулемой в течение 1 мин, промывают стерильной водой и раскладывают на увлажненные стерильной водой бумажные фильтры в чашках Петри для прорастания. Через 3-е суток проростки в асептических условиях раскладывают в пробирки со средой (по 2 проростка) . Опыты ставят в 10-кратной повторности. Клубеньковые бактерии для инокуляции растений выращивают на косом гороховом агаре в пробирках в течение 5 суток при 28 С и суспендируют в растворе микроэлементов (по прописи Федорова) . Через двое суток после посева семян в каждую пробирку вносят 1 мл инокулята, имеющего концентрацию 10 клеток. Растения выращивают в фитотроне при 22-24 С, о

Через 63 дня пробирки герметично закрывают и вводят шприцем ацетилен до концентрации 107. по объему. Количество этилена, образовавшегося в ,результате восстановления ацетилена .1. нитрогеназой клубеньковых бактерий, определяют через 24 ч на газовом хроматографе. Величину нитрогеназной активности клубеньков, которая характеризует азотфиксирующую активность штаммов, выражают в микромолях

С<Я< за 24 ч на сосуд. Результаты представлены в табл.

Данные табл. 1 показывают, что бактерии предлагаемого штамма 0206

1699990 вирулентны на астрагале, они образуют на его корнях типичные для этого растения клубеньки, бактерии штамма

282 — не вирулентны.

Штамм 0206 является активным азот5 фиксирующим симбионтом астрагала, нитрогеназная активность клубеньков, образованных бактериями этого штамма на растении — хозяине, на 3 порядка выше, чем контрольных растений и растений, инокулированных штаммом 282.

Результаты микровегетационного опыта по определению общего накопления азота растениями астрагала, бакте- 5 ризованными вышеупомянутыми штаммами, цредставлеHbl в табл. 2, Как показывают данные табл. 2, в результате активной симбиотической фиксации атмосферного азота клубеньковыми бактериями штамма 0206 общее накопление азота растениями, бактеризованными .этим штаммом, было вдвое больше, чем при использовании штамма 282. При этом урожай зеленой мас- 25 сы растений, инокулированных предлагаемым штаммом 0206, повысился на

40, а содержание в нем азота — на

0, 92 .

В варианте, где применялся штамм

282, клубеньки на растениях отсутствовали, следовательно, симбиотически связанного азота из воздуха в растения не поступало, в результате продуктивность астрагала не повышалась.

Результаты исследований видоспеци- 3 фичности клубеньковых бактерий по отношению к астрагалу приведены в табл. 3, Как показывает табл. 3, ни один

40 из испытанных штаммов, кроме штамма

0206, не показал положительных результатов на астрагале, в том числе и штамм из группы Bradyrhizobium sp.—

Bradyrh. sp . (1,otu s) 4 76 . Клубенько45 вые бактерии клевера ш-,àììà 348а образуют ка астрагале неактивные клубеньки и симбиотическая аэотфиксация в данном случае также не наблюдалась.

Лишь на варианте с инокуляцией астрагала бактериями штамма- Bradyrhizobium sp. (pstrs8stus) 0206 образовались активные клубеньки, где отмече на высокая азотфиксирующая активность, в результате чего увеличивался урожай зеленой массы растений и повышалось содержание в ней белка, Приведенные ма-:ериалы свидетельствуют о высокой избирательности астраглла к микросимбиоптам и дают основание сделать вывод о там, что активную симбиотическую азотфиксацию у астрагала можно получить лишь при инокуляцпи специфичными для него штаммами клубеньковых бактерий. Ввиду этого в дальнейшие опыты штамм 282 не включен, Пример 2, Использование штамма 0206 для получения препарата бактериального удобрения.

Посевную культуру выращивают на качалке в колбах или пятилитровых бутылях в течение 3-х суток на среде следующего состава (мас. ): гороховый отвар — 10,0; сахар (пищевой) — 1 О; (NH4)

КН ГОф — 0,05; KzHP04 3HzO — 0,05;

NgSO4 7НΠ— 0,02; СаСО> — 0,1; вода водопроводная — до 100,0, рН после стерилизации (1,0 ати, 30 мин)—

6,8-7,0. Титр клеток 4-5 млрд/мл, Посевную культуру используют для приготовления жидкой рабочей культуры. Ее готовят в 5-литровых бутыпях или ферментаторах на среде следующего состава (мас. 1: кукурузный экстракт — 1, О, меласса — 2, О, {NH4)> 804

1,0, КНгРО1 — 0,025, К НРО1 ЗНгО

0,025, Ед& „. ° 7Н О вЂ” 0,02, СаСО y—

0 „1, вода вс ",oïðoâoäíàÿ — до 100, О, рН после стерилизации 6,8-7,0.

Буты.-.:. и ферментеры засевают посевной культурой клубеньковьгх бактерий в количестве 5,, Вчтылп встряхивают на качалке в †.ечечие 6-72 ч. В ферментерах бактерии выращивают

36-48 ч при аэрации 0„7-; 5 об/мин под избыточнь.:м даглеп .ем 0,3-0,5 ати при 28-30 С. Титр 4-5 млрд/мл. После микробиологического кс".-:троля культуралькую жидкость из бут-гней или ферментаторов — инокулюм — используют для смеш 1вания с торфом.

Подг"."ò;oâêà торфа. Размолотый низинный торф, нейтрализованный мелом до рН 6,8-7,0, с влажностью 30-40% в полиэтиленовых пакетах по 200 †4 r стерилиз.::э.т грамма-облучением при дозе ",5 Мрад. Стерильный торф в пакетах инокулируют инъекцией смеси: культуральная жидкость + меласса (6ь) из расчета исходного ..итра бак— терий в торфе 0,3-0,5 млгдlг торфа и влажности 45-602. Затем пакеты загружают в специальные смес п ели, при врашекии которых переме ппвается их содержимое. Культуру в торфе под-

1699990

Вирулентность и азотфнксирующая активность втаима

Rradyrhizobium sp. (Astragalus) 0206 и известного втамма 282

Варианты

4нокуляции

Азотфиксирукнцая активВирулентность ность

Нитрогеназнан активность, ", икмоль С Н, сосуд/24 ч

Характеристика клубеньков

Количество клубеньков нз одно растение, шт.

Без инокуляцин

Штамм 0206 !

О, 002 нет

Средине, цилиндрические, розоватые, 2-3 мм, но всей корневой системе

6,650

0,003

Штамм 262 ! нет ращивают, выдерживая пакеты 3-5 су ток при 15-20 С, Ризоторфин хранят о при 3-8 С в темном сухом помещении отдельно от ядохимикатов.

Характеристика готового продукта.

Ризоторфин для астрагала на предлагаемом штамме представляет по внешнему виду увлажненную сыпучую массу темного цвета, без запаха, нераство- 1р римую в воде. Влажность готового препарата 50-557.. Ризоторфин содержит 3-4 млрд. клубеньковых бактерий на 1.часть торфа. Срок годности препарата — 6 месяцев со дня изготовления, Расход препарата 200 r на гектарную

Норму семян.

Пример 3. Применение бактериального удобрения под астрагал.

Вегетационный опыт проводят в сосудах с 6 кг дерново-подзолистой почвы с внесением солей по прописи

1 рянишникова, но без азота. ПовторНость опыта 4-кратная. Используют семена астрагала серпоплодного. 25

Для инокуляции семян чистую кульа уру бактерий выращивают на скошенНом картофельном агаре. Культуру в пробирках с титром 4-5 млрд. смывают водопроводной водой, затем суспензию

11аносят на семена астрагала, разложенные в лунки, сделанные в почве

Каждого сосуда. В сосуд вносят

10 клеток.

Ъ

Данные по влиянию инокуляции астрагала штаммом 0206 на его продуктив-

Ность представлены в табл. 4.

Из табл. 4 следует, что штамм 0206 является активным азотфиксирующим симХ - статистическая обработка>

P - 4,0X НСР, — 0,54 мкмоль/сосуд, 1 бионтом астрагала и благодаря этому свойству способен повышать урожай зеленой массы растения-хозяина на

82,4% и увеличивать содержание белка в растениях на 12,9Х.

Пример 4. Полевой опыт.

Штамм 0206 применяют в виде торфяного. препарата. Почва дерновоподзолистая, площадь делянки 5 м, повторность 4-кратная, используют семена астрагала болотного дикого видообразца.

Способ внесения препарата: 200 r риэоторфина разводят в 1,0 л водопроводной воды и, не давая суспенэии отстаиваться, наносят ее на гектарную норму семян, Затем семена тщательно перемешивают для равномерного распределения препарата. Обработанные ризоторфином семена высевают в тот же день во влажную почву.

Результаты опыта приведены в табл. 5.

Прибавка урожая зеленой массы растений от инокуляции штаммом 0206 составляе1 10,8 ц/га (43,07), содержание. белка в растениях увеличивается на 3,9Х, как показывает табл. 1.

Таким образом, штамм 0206 существенно увеличивает азотфиксирующую активность астрагала, повышает его продуктивность, что указывает .на то, что штамм 0206 является активным азотАиксирующим симбионтом астрагала.

Формула изобретения

Штамм клубеньковых бактерий Bradyrhizobium sp. (Astragalus) ВНИИСХМ0206 для производства бактериального удобрения под астрагал, таблица 1

1699990

Таблица 2 врианты нокуляции

Урожай сухой массы растений, мг/сос.*

Накопление азота на сосуд, мг Х к контролю

Содержание аэоПрибавка урожая, мг/сос, та в растениях ° Х

es инокуяции

1Итамм 0206

15,6

21,9

16,4

1>84 0>29 100 О

40,4 2,76 0,60 206,9

5,1 1 92 0,31 106,9

6,3

0>8 тамм 282

* — статистическая обработка;

P — 4,6Х, НСРо - 2,3 мг/сосуд, Таблица 3

Специфичность взаимодействия астрагала с клубеньковыми бактериямн разных видов Клубень1 ковые бактерии

Содержание белка, Х

Прибавка урожая, мг/сос., X.

Название вида Штамм

Ризобиум

Симбиотические свойства урожай мг/сос,е** аэотфиксирукнцая активность*е вирулентность*

11,5

15,6

0,003 нет

6,3

0,4

21,4

16,0

40,4 12,2

2,6 12,0

0206 7

476 нет

6,650

0,003

12,0

10,5

О, 003

0,003

16,4

16,5

0,8 5,1

0,9 6,8

282 нет

425а нет

О, 6 10,>5

15,5

348а 14

0,003

0,003,козлятника

12,1

-0,3

0702 нет

15 3

П р и м е ч а н и я, * среднее количество клубеньков на одно растение, штук; ** мкмоль С Н /сосуд/24 ч; *** статистнче-..— кая обработка: р — 4,6Х, НСР с- 2,3 мг/сосуд, Т а б л л ц в 4

Варианты

Урожай сухой массы растений> г/сос, Содержание белка в

Прибавка урожая, г/сос ° Х

Статистическая обработка растениях, НСРо6> г/сосуд

Контроль (беэ инокуляции)

Штамм 0206

1, 7

3,1

8,6

21,5

4,2

0,2

82,4

1,4

:Контроль ! (без ино куляции) астрагала !

1 лядвенца

;донника люцерны клевера

Эффективность симбиотической аэотфнксации штамма

Brsdyrhizobium sp. (Astragalus) 0206 и известного шТамма 282

Bradyrhizobium sp. (Astragalus)

Bradyrhizobium sp. (Lotus)

Р. meliloti

R, meliloti

R. lezumiposarum

bv. frifolii

Rhizobium

sp. (4alegaj

Эффективность симбиоза штамма 0206 с астрагалом

Таблица 5

Эффективность штамма клубеньковьас бактерий астрагала 0206 в полевом опыте прибавка урокая

Содержание белка, 3

Вариант инокуляции

Г ц/га

Bee инокуляции (контроль) 25, 1

И1тамм 0206 35,9 10,8

Ъ .Р 4,0Х, НСР б 5,1 ц/га..

4З„0

11,1

15,6

Редактор Н.Козлова

Производственно-издательский комбинат "Патент", Г. Ужгород, ул. Гагарина, 101

Урояай эеленой массы, ц/re

Заказ 4440

ВНИИПИ Государственного

113035, Составитель С.Левин

Текред JI.Îëèéíûê Корректор А Обруяар

Тираж Подписное комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5