Способ получения протеолитического комплекса, предназначенного для применения в зоотехнике

 

Изобретение относится к биотехнологии и предназначено для применения в зоотехнике . Цель изобретения - повышение общей протеолитической активности за счет преобладания в комплексе протеаз типа I и обеспечения ускорения роста животных в процессе кормления или в период беременности . Способ получения протеолитического комплекса заключается в культивировании штамма Streptomyces fradiae ATCC 10745, поддерживая рН культуральной среды 7-7.5, фильтрации в присутствии осветляющего агента, после этого ультрафильтрации через специфическую мембрану на основе полисульфона, имеющей порог разделения от 2 до 12000, распылительной сушке. Полученный протеолитический комплекс при его применении в зоотехнике стимулирует активность поджелудочной железы. 2 з.п ф-лы

COI03 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ipse t

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

С Ю (21) 4355551/13 (86) РСТ/FP 87/00233 19.06.87 (22) 19.02.88 (31) 86/08940 (32) 20,06,86 (33) FR (46) 23.12.91, Бюл. N. 47 (71) Мишель Ореман, Доминик Ореман, Дени Ореман, Жан-Ноэль Ореман и Эрве Ореман (FR) (72) Мишель Ореман (FR) (53) 577. 15(088,8) (56) Патент Франции ¹ 22003344555599, кл. А 61 К

19/00. опублик. 1973.

Патент СССР N 334720, кл. С 12 N 9/52. опублик. 1970. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА, ПРЕДНАЗНАЧЕННОГО ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ЗООТЕХНИКЕ

Изобретение относится к биотехнологии и предназначено для применения в зоотехнике, Цель изобретения — повышение общей протеолитической активности за счет преобладания в комплексе протеаз типа И и обеспечения ускорения роста животных в процессе кормления или в период беременности.

Способ заключается в следующем.

Ферментация. Используют штамм

Streptomyces fred(ac, типовой штамм

WAKSMAN 3535, хранящийся в американском собрании типов культур ATCC под номером 10.745, Этот штамм может быть периодически регенерирован классически<в> Ы и> 1701 1 13 3АЗ (я)5 С 12 N 9/52 // А 23 К 1/165 (С 12 и 9/52; С 12 R 1:54) (57) Изобретение относится к биотехнологии и предназначено для применения в зоотехнике. Цель изобретения — повышение общей пратеолитической активности за счет преобладания в комплексе протеаз типа ll u обеспечения ускорения роста животных в процессе кормления или в период беременности. Способ получения протеолитического комплекса заключается в культивировании штамма Streptomyces

fradiae АТСС 10745, поддерживая рН культуральной среды 7 — 75, фильтрации в присутствии осветляющего агента, после этого ультрафильтрации через специфическую мембрану на основе полисульфона, имеющей порог разделения от 2 до 12000, распылительной сушке. Полученный протеолитический комплекс при его применении в зоотехнике стимулирует активность поджелудочной железы, 2 з.п, ф-лы. ми способами диссоциации на агаровой среде для удаления возможных спонтанных мутантов со слабой протеолитической активностью, Этот штаммм может быть также улучшен классическими способами мутации, вызываемой с целью получения повышения протеолитической активности.

Готовят предкультуру этого штамма сначала в колбах с перемешиванием, затем в промежуточном ферментере, затем осуществляют прививку в ферментере промышленного производства, Продуцирующая среда может иметь следующий состав, г/л; соевая мука 15, глюкоза 30. дикалийфосфат

1; карбонат кальция 10. После стерилизации ее рН близко к 7,0, температуру ферментации поддерживают при 28 С и аэрацию—

1701 I 13

55 при 0,3 обьема стерильного воздуха на 1 объем среды в 1 мин.

Значение рН среды, первоначально близкое к 7,0, начинает снижаться и спустя около 10 ч времени ферментации достигает

6,5, затем оно быстро повышается и спустя примерно 20 ч времени ферментации достигает 7,5, затем продолжает более медленно повышаться до достижения окончательно значения 8,2.

Важно поддерживать рН равным 75—

7,0 путем автоматического добавления кислотного раствора (3 н.соляной кислоты), что позволяет избежать фрагментации мицелия и выделения в среду некоторых вторичных метаболитов, протеаз типа,l, 1ь и пептидаз (эти вторичные метаболиты и эти ферменты также остаются внутриклеточными), увеличивать продуцирование протеаз типа 11, ill, И, каторые представляют собой в основном внеклеточные ферменты, значительно увеличить продуцирование протеазы типа 11

Продолжительность ферментации может изменяться от 72 до 96 ч и конечный титр среды может составить около 15000

0.А./мл, что намного превышает известный титр (3000 U.À./мл), Единица Апзоп1сокращенно U.À,) здесь определяется как количество фермента, которое, инкубированное в течение 10 мин при 25 С и при рН 7,5 в присутствии денатурированного гемаглобина, выделяет из этого субстрата эквивалент 1 ug тироэина, on редел яемый спектрофотометрической абсорбцией при 280 нм на фильтрате, не осаждаемом трихлоуксусной кислотой, Экстракция, Мицелий отделяют от продуцирующей среды путем осветляющей фильтрации, Комплекс вместо того, чтобы его экстрагировать классическими методами выделения ферментов (последовательное осаждение. пропускание через колонку), экстрагируют методом ультрафильтрации.

Мембраны для ультрафильтрации, которые имеют порог разделения, соответствующий молекулярной массе 30000, непригодны, поскольку они могут пропускать более 50% комплекса, Мембраны, которые имеют порог разделения, соответствующий молекулярной массе

1000, также непригодны, поскольку они не позволяют отделять от комплекса некоторые вторичные метаболиты с незначительной молекулярной массой. Целесообразно использовать мембраны, которые имеют порог разделения, соответствующий молекулярной массе 2000 — 12000, используя полисульфоновую мембрану, выпускаемую в продажу фирмой МИЛЛИПОР под названием PTGC, которая имеет порог разделения, соответствующий молекулярной массе

10000.

Полученный путем ультрафильтрации концентрат затем подвергают распылению.

Получают комплекс протеолитических ферментов в форме порошка светло-бежевого цвета, имеющий титр по крайней мере

2000 U.À./ìã, не учитывая инертные основы, например высушенный крахмал. в известных случаях добавленные до или после распыления.

Общий выход в виде протеолитической активности, который составляет около 70%, выше такового, который будет получаться в промышленности последовательными осаждениями или пропусканиями через колонки, Характеристика нового комплекса: наличие (определенное ферментоэлектрофорезом) протеаз типа II, ill, IV npu исключении протеаэ типа 4, Ib и пептидаз; — преобладание протеазы типа 11, которая означает по крайней мере 40% общей протеолитической активности, причем протеазы типа ill или IV обозначают каждая самое большее 30% этой общей активности.

Характеристики основных протеаз комплекса, Протеаза типа 11. Молекулярная масса близка к 18000; изоэлектрическая точка близка с 9,0; путем электрофореза при рН

8,0 перемещение к катоду с относительно слабой скоростью.

Протеаза типа Ill. Молекулярная масса близка к 14,000; изоэлектрическая точка близка к 9; путем электрофореза при рН 8 0 перемещение к катоду со средней скоростью.

Протеаза типа 1 /, Молекулярная масса близка к 16500; изоэлектрическая точка близка к 9,0; путем электрофореза при рН

8,0 перемещение к катоду с относительно большой скоростью, fl р и м е р. Культивируют штамм S.

fradiae АТСС 10745, осуществляя первую инокуляцию в ферменторе общим объемом

2 м, полезный обьем которого 1 мз. Полз ученный инокулят используют для культивирования в промышленном ферменторе емкостью ЗО м и полезной емкостью 20 м, з

Ферментационная среда имеет следующий состав для емкости 20 м, кг:

Соевая мука 300

Глюкоза 600

Дикалийфосфат 20

Карбонат кальция 200

Вода Остальное

1701113

Перед ферментацией среду стерилизуют, ее рН доводят до 7,0, температуру ферментации устанавливают на 28 1 С, Среду в процессе ферментации аэрируют путем циркуляции 0,3 объема стерильного воздуха на 1 объем среды в 1 мин. Ферментацию осуществляют в течение около 72 ч при поддержании рН 7,0-7,5 путем систематического добавления 3 н,соляной кислоты.

После 72 ч концентрация протеолитического комплекса в среде составляет 15000

U,À./ìë.

Экстракция. Культуральную среду фильтруют через кларгель на классическом пресс-фильтре с фильтруюшей поверхностью 10 м .

Мицелий промывают на пресс-фильтре три раза водой, Ультрафильтрация. Промывные воды соединяют с фильтратом и все вместе направляют на ультрафильтрационное устройство, имеющее фильтрующую поверхность с порогом раздлеления 10006, Скорость прохождения через фильтр около 1 м на i м фильтрующей поверхности в 1 ч, а конечная концентрация твердого продукта, полученного после фильтрации, составляет 100 кг/м, Концентрированный раствор распыляют и получают порошок с концентрацией не менее 2000 U.À./ìã, как правило, 3000 U.А„ содержащий про-еазы типа ii, tll и И (эа исключением протеаз типа i>, la и пептидаз) с преобладанием прогеаэы типа Il, которая представляет по меньшей мере 40% общей протеолитической активности.

Полученный порошок бежевого цвета соединяют с крахмалом для промышленного использования.

Используемое ультрафильтрационное устройство является наиболее крупным торговым аппаратом марки UFP 10, выпускаемым фирмой Рон-Пуленк.

Подача на ультрафильтрующее устройство осуществляется с помощью нагнетающего насоса и регулируется открытием выходного клапана., который оебспечивает заданное давление, причем оптимум подачи составляет 1000 л/м ч.

Применение в зоотехнике предлагаемого комплекса приводит к наилуч ним результатам, когда они осуществляются согласно следующим условиям.

Использование кормов с повышенным содержанием сырых белков, Констатировано, что комплекс стимулирует рост животных, отдавая предпочтение протеиногеназам по отношению к лалипогеназе, Например, наблюдалось, что скеле- . ты обработанных телят и свиней иногда

40 лучше классифицируются, поскольку они более мускулистые и менее жировые, но эти улучшения были нерегулярными.

Тенденция комплекса стимулировать протеиновый анаболизм может IlofIHOGTbe выражаться только в случае, если используемый корм имеет достаточное содержание сырых белков, Эксперимент эффективно подтвердил, что для достижения регулярной значительной стимуляции протеинового анабализма необходимым условием является использование относительно обогащенного сырыми белками корма, т.е. имеющего высокое содержание общего азотсодержащего сырья (сокращенно M.À.Т.).

Например, это содержание M.À.Т. должно быть: 23% для кормов, предназначенных для цыплят; 22% для кормов при искусственном вскармливании, предназначенных для телят или ягнят; 20% для кормов при отнятии от груди, предназначенных для беременных и кормящих свиноматок, Использование таких кормов не соответствует, обычно, текущей практике, потому что животные не всегда способны полностью усваивать корм, имеющий повышенное содержание M.À.Т. В этом случае непереваренные белки могут привести к нарушению равновесия в кишечной флоре за счет черезмерного развития протеолитических бактерий и к увеличению частоты диарей (поносов), Использование комплекса как оаз и позволяет устранить эти явления, так как он придает животным способность эффективно усваивать корма, имеющие повышенное содержание М.А,Т.

Кроме того, корма с повышенным содержанием M,А.Т. имеют стоимость выше таковой обычных кормов и добавление в них комплекса еще более удорожает их. Однако это удорожание может быть компенсировано тем фактом, что с комплексом можно использовать корма менее энергоемкие, чем обычные корма, Во всяком случае ввиду значительного зоотехнического эффекта общий экономический выигрыш от использования комплекса остается высоким.

Использование кормов, предназначенных для млекопитающих в период беременности, кормления и отнятия от груди, Предлагаемый комплекс стимулирует экзокринную активность поджелудочной железы.

Это стимулирование подтверждается, в частности, экспериментами на крысе и выражается в значительном увеличении внутрипанкреатической концентрации всех ферментов, которые выделяются панкреатическим каналом. Это увеличение может достигать 50% для амилазы, 70 % для трип1701113 слногена и химотрипслногена, 80% для липазы.

Наличи эффекта стимуляции экзокриннси активности поджелудочнои железы

3«рад!полагает, что комплекс буде.г Особенно эф<})ак тивен в случае !<Огда и соя вляется Нецсстаточ«-!Ость под>калудсчнОЙ железы (у самок в конце беременности) лли когда нужно интенс««фицирсвать 88 деятельность при

Воспроизводстве(у самок, кормящих грудью многочисленное г!Отомство) или при ацаптации (у молодых млекопитающлх в период

«)т««ят«!я их QT груди). Следу!О«д!Иа примсры

««одтверждают сказанное.

Недостаточность деятельности поджеiI",ДО «г!Ой желаЗЫ, IBCTO ВС ГР8 «а«СГЦаяСЯ с"-мок в конце беременности, объясняется з««ачиталь««ым расширением объема матки, ., Оторая давит на вса пищевари ельнь«е of)ганы.,!!ОбавланиB комплекса к корму, стпуcI<66мо««у этим самкам, позволяет восстановить хорсшу}О работу поджал .до-!-! Ой железы и впоследствии г«случить увелиЧB}-«! «8»; а рО)! .да}ощегося пр!л плода.

Нас"":fr!6}), С ПОМощЬЮ ТОЛЬКО СдНОГО корм,ля бара :;8«!!«ь х свиней или кормяЩи)< ГO" ftъ«О г ВИНай, ИМBIQ«Ц8ГО СОД8РЖЭНИЕ

}!/} А =-. 6% добавление ко, «и !BI

i20 У,А. на 1 Г корма позволяет достигать !.вели ения Н, «7 j0 васа рожденного приплода, 15 кг GMGGTQ 12,8 кг (10,7 поросят по

1,4!if ВмаСто . <},2 поросят пс 1,25 кг).

:-жадневное потребленис пищи самкаМи, корм-";щими грудью многочисленное по1 ОМСТВО, ДОЛ)КНО ОЫСТРС ВОЗРаСТаТЬ: МЕ)КДУ

«:онцом баремен}«ости и вссмым днем кормла}«ия грудь«о QHC Должно возрасти в 2,5 раза (Около 45 г вместо 18 г для:<рыс, 350 г вмсстО 140 Г длЯ кроликов, 6 кГ вместс 2,4 кГ для cвинeй), Г1од>«<елудсч,-«ая железа у самок в Г«ери— од кормления, следовательно, должна соВершать значительну}О допслнитBльную работу и именно в этот период активность комплскса Оказывается наибол!86 } лагстворной.

}-«::«пР««г«ео С ПОМОЩЬir» 6!gNIICТTВВН O! 0

«:Ор",«а для 66} iBNGH!!i.f)< С! >,Най ИЛИ IrOOðäftщих грудью свиней, име!Ощего содержание

М.А.Т. = 17 р,, Дсбааланйе f

I1OBbll!ir«!«! = IB,) !% BCCG ОТНЯТОГО OT ГРУДИ приплода На 21-й день; 54 кг вместо 43 кг (9,4 поросят пс 5,7 кг вместо 9,1 порссенка

flQ 4,7 Кг).

В другом опыта, осуществленном в близких условиЯх, нс с ОтнЯтиBм QT rpi«ди на

28-й День вместо 21-:;-.о дня, увеличение веса приплода также порядка величины, боль«оа«! на 25% 52 к!. вместо 41 кг Для 21-Го дня

30 лг

1 5 (9,7 поросят по 5,4 кг вместо 8.5 поросят по

4,8 кг) и 69 кг вместо 55 кг при отнятии от грудл спустя 28 дней (9,7 поросят по 7,1 кг вместо 8,5 поросят по 6,5 кг), Это повышение веса приплода происходит одновременно со снижением пищевого потребления, необходимого для поддержания свиней в хорошем состоянии, уменьшение которого в расчете на совокупность в течение года составляет порядка 10;4 (около

1000 кг вместо 1100 кг), В период отнятия от груди молодые млекопитающие должны «ерейти от материнского молока к потреблению составных кормов и их поджелудочная железа должна бь!стро адаптироваться K 3TQA значительной перемене. Добавление комплекса в зти составленные корма тогда позволяет облег !ать эту адаптацию. Например, с кормом при отнятии от груди для поросят весом по

5 и 10 кг, имеющим содержание М.А.Т. =

23 f,, добавление комплекса в дозе 120 U,À.

На 1 г корма позволяет достигать повышения на 15% среднего ежедневного прироста (2}6 r вместо 188 r) л сниженле на 15% показателя потребления (1,59 вместо 1,83).

}ак и в случае поросят, воздействие комплекса в момент отнятия от груди может быть значительным в случае крольчат и молодых жвачных животных (козлят, ягнят, телят). Для этих )кивотных увеличение прироста среднего ежедневного веса под действием комплекса должно достигать

40% (47 г вместо ЗЗ " в течение недели, следующей за отнятием от груди пятинедельных кроликов, 797 г вместо 573 r в течение месяца после отнятия от груди двухмесячных поросят).

««пределение используемых предельных доз. Для получения воспроизводимых высоких результатов комплекс должен использоваться в дозе, находящейся в относительно уз!<ом интервале, т.е, в дозе 40-160

U.A. í3 г корма.

В случае питания кормящих грудью свиней лспользуемая доза составляет 120 U,À, на 1 г корма и увеличение веса приплода поросят при отнятии от груди на 21-л день составляет 25%. Если установить дозу в 200

}.},А,/ri то увеличение веса происходит не более чемна 4 7: 49 кг вместо 47 кг (8,2 поросят весом пс 6;0 кг вместо 8,4 поросят по 5,6 кг).

Для питания поросят используемая доза составляет 120 U,À./ã и улучшение зоотехнических результатов составляет }5%.

Если эта доза зафиксирована на 200 U,À./ã, то улучшение результатов становится нерегуляоным, в лучшем случае она остается равной 15% спустя 3 неделя Опыта, но

1701113

Составитель И, Привалова

Техред М,Моргентал Корректор M. Максимишинец

Редактор С. Пекарь

Заказ 4480 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина. 101 становится равной нулю .спустя 5 недель

on ыта.

Введение комплекса в корм животных в период беременности (например, свиноматкам или овцам) в дозе 200 — 400 г на 1 т корма 5 позволяет увеличить приплоды (9,5 поросят в среднем вместо 9), а вес молодняка становится более регулярным (5,3 кг в среднем), Так, эксперимент, проведенный на ферме с двумя группами из 500 беременных свино- 10 маток, одна группа которых (обработанная) получала энзиматический комплекс с кормом, показал, что: группа обработанных животных при опоросе дала 450 живых новорожденных вместо 335 у необработанных 15 животных; в обработанной группе поросята в момент рождения весили на 10 6 больше, чем поросята от необработанных животных, а в конце месячного возраста их рост и состояние здоровья было лучше, чем у необра- 20 ботанных животных, Формула изобретения

1. Способ получения протеолитического комплекса, предназначенного для примене- 25 ния в зоотехнике, предусматривающий культивирование Spteptomyces fradlae на питательной среде, содержащей соевую муку, глюкозу, двузамещенную соль фосфорной кислоты, карбонат кальция и воду. до достижения заданной активности при 28 С и аэрации из расчета 0,3 объема воздуха на

1 объем среды в 1 мин и оптимальном значении рН среды с последующим выделением целевого продукта фильтрованием, концентрированием и сушкой. о т л и ч а ющи и с я тем, что, с целью повышения общей протеолитической активности эа счет преобладания в комплексе протеаз типа 11 и обеспечения ускорения роста животных в процессе кормления или в период беременности, в качестве продуцента используют штамм Streptomyces fradlae ATCC 10745, концентрирование фильтрата ведут ультрафильтрацией с использованием мембраны на основе полисульфона, имеющей порог разделения 2 — 12000, а сушку проводят распылением.

2. Способ по и. 1, о тл и ч а ю щи и с я тем, что рН среды поддерживают между 7 и

7,5.

3. Способ по и, 1, отличающийся тем, что процесс фильтрации ведут с использованием осветляющего агента.