Штамм дрожжей rноdотоrulа ruвrа (dемме) lodder, используемый в качестве тест-организма для выявления и оценки действия гиполипидемических средств

 

Изобретение относится к мэкробиологической и медицинской отраслям промышленности и касается штамма, используемого в качестве тест-организма для выявления и оценки действия гиполипидемических лечебных средств. Целью изобретения является получение штамма дрожжей, высокочувствительного к гиполипидемическим лекарственным препаратам и используемого для определения наличия и оценки эффективности ингибиторов биосинтеза иэопреноидов, в том числе холестерина . Получен штамм Rhodotorula rub га ВКПМ Ґ-1337(438), рост которого подавляется в присутствии ловастатина в концентрациях 0,05-2,0 мкг/мл за 20 ч. что позволяет определять ингибиторы синтеза изопреноидов в биологических жидкостях и чистых препаратах. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИгенетика 8.02.90 г. под номером ВКЛМ Y-1337. 2 табл. ел с

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ KOMVITET

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОЫУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4796366/13 (22) 27.02.90 (46) 15.01.92.Бюл. М 2 (71) МГУ им. М.В.Ломоносова (72) Н.С.Егоров, H.С,Ландау. Н,А.Баранова, В.Г.Крейер, С.Н.Выборных, Л,И.Буяк, И.П.Бабьева и И.С.Решетова (53) 582.282,23 (088.8) (56) 1. М,S. Brown et al, 1978, The Journal of

Biological Chemistry, ч. 253. N 4, р. 11211128.

2. M.Kuroda et а). I. blochem and blophys.

acta, ч. 486, р. 70-81. 1977.

3. R. Ikeura, et al. The lournal of

Antibiotic, ч 41, N 8, р. 1148-1150. (54) ШТАММ ДРОЖЖЕЙ RHODOTORULA

RUBRA (ОЕММЕ) LODDER, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ ТЕСТ-ОРГАНИЗМА ДЛЯ

ВЫЯВЛЕНИЯ И ОЦЕНКИ ДЕЙСТВИЯ ГИПОЛИПИДЕМИЧ ЕСКИХ СРЕДСТВ

Изобретение относится к микробиологической и медицинской отраслям промышленности и представляет собой новый штамм дрожжей, используемый в качестве тест-организма для выявления и оценки действия гиполипидемических средств.

Основным методом, используемым в настоящев время для определения действия гиполипидемических факторов, является включение (14c)-ацетата в (14c}-холестерин интактными клетками фибропластов кожи человека. Культуру фибропластов получают биопсией иэ кожи нормальных людей, растят в виде монослоя и используют между

5-20 пассажами. Культуру клеток поддерживают и выращивают в специальном увлаж„„SU 1705346 А1 тч)э С 12 Р 17/06, А 61 К 31/44 (57) Изобретение относится к макробиологической и медицинской отраслям промышленности и касается штамма, используемого в качестве тест-организма для выявления и оценки действия гиполипидемических лечебных средств. Целью изобретения является получение штамма дрожжей, высокочувствительного к гиполипидемическим лекарственным препаратам и используемого для определения наличия и оценки эффективности ингибиторов биосинтеза иэопреноидов, в том числе холестерина. Получен штамм Rhodotorula rubra

ВКПМ Y-1337(438). рост которого подавляется в присутствии ловастатина в концентрациях 0,05 — 2,0 мкг!мл 3а 20 ч, что позволяет определять ингибиторы синтеза иэопреноидов в биологических жидкостях и чистых препаратах. Штамм депонирован во

Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов В НИИгенетика 8.02,90 г. под номером BQlM Y-1337. 2 табл. ненном СО2-инкубаторе, в специальных флаконах на среде Игла с добавлением антибиотиков, аминокислот и телячьей сыворотки. Монослои фибропластов после нескольких пассажей инкубируют с (14с}ацетатом в среде А, содержащей 10 -ный липопротеин — дефицитной сыворотки. (14c)-холестерин экстрагируют иэ клеток петролейным эфиром. проводят тонкослойную хроматографию и определяют (14c)-õîлестерин в расчете на МГ белка. Недостатки данного метода: длительность определения ингибиторной активности (9 — 11 сут); использование дорогостоящих импортных реактивов и сред;

1705346 дерново-подзопнс ои очуле уренной почве се необходимость использования специального импортного оборудования (специальные флаконы. СО2-инкубатор, микроскоп инвертированный).

Существует также способ определения и оценки активности ингибиторов синтеза холестерина в бесклеточных экстрактах животных клеток. Сущность метода заключается в определении способности гиполипидемических факторов ингибировать активность ключевого фермента начальных этапов синтеза холестерина

3-гидрокси 3-метилглутарил КоА-редуктазы (ГМГ-КоА-редуктаэы). Определение проводят в реакционной смеси, содержащей DL14

С-3-гидрокси З-метилглутарил-КоА, К-фосфатный буфер рН 7.4, ЭДТА, дитиотриэтол, НАДФН и микросомальный белок.

Смесь инкубируют при 37 С 30 мин, проводят тонкослойную хроматографию на пластинках F-254 (Merck) и на хроматограмме определяют радиоактивность лактона мевалоновой кислоты.

Недостатки способа: сложность и длительность получения микросомального белка из клеток животных; использование дорогостоящих импортных реактивов (DL- С-ГМГ-КоА, пластинки

F-254 производства фирмы Merck); наличие специального импортного оборудования (скоростные центрифуги, счетчики радиоактивности).

Наиболее близким по достигаемому результату к предлагаемому штамму является метод, по которому добавляют в специальную питательную среду 0.1-2 мкг/мл компактина или его аналогов, ингибирует рост

4-х штаммов дрожжей: Rhodotoruta glutinls

Н 3-9-1, Sporobolomyces salmonlcolor WF

188, Aessosporon salmonicolor IFO 1845, Cltегоmyces matritensls IFO 0095 U.

Недостатки метода: высокая минимальная ингибирующая концентрация компактина (0,1 мкг в мл); длительность культивирования дрожжей с компактином для достижения эффекта ингибирования (4 сут).

Целью изобретения является штамм дрожжей высокочувствительный к гиполипидемическим лекарственным препаратам и используемый для определения наличия и оценки эффективности новых ингибиторов биосинтеза изопреноидов, в том числе холестерина.

Предлагаемый штамм выделен на кафедре биологии почв МГУ им. М.В.Ломоносова из риэосферы сахарной свеклы на

55 и определен как Rhodotorula rubra (Demme)

Lodder ВКПМ-У-1337 (438). Штамм депонирован в ВКПМ под коллекционным номером

У/ — 1337, Характеристика штамма. Морфологические, культуральные и физиологические особенности, Рост в жидком сусле. Через 5 сут при

26 С в среде слабая муть, небольшой розовый осадок и тонкое розовое пристеночное кольцо. Клетки в жидкости овальные, удлиненные, одиночные с полярными почками, образуют конгломераты, пучки. Размеры (2,0-5,5)х(4,5-12,0) мкм. Встречаются длинные нити псевдомицелия, которые слагают кольцо. Длина клеток псевдомицелия до 15 мкм и более. Через месяц кольцо хорошо выражено и обильный осадок, Рост на сусло-агаре. Морфология клеток сходна с описанной выше, но псевдомицелиальные структуры преобладают, При рассеве штамм расщепляется на гладкий и складчатый варианты. Колонии складчатого варианта вновь выщепляют гладкие, которые со временем приобретают складчатый фенотип. Почти все клетки собраны в нити псевдомицелия. Брожение: отсутствует, Ассимиляция источников углерода: утилиэирует D-глюкозу, D-галактоэу, L-сорбоэу, сахароэу, мал ьтоэу, трегэлозу, целлобиоэу, салицин, арбутин, раффиноэу. мелецитоэу, инулин, сорбит, маннит, 2-кетоглютонат, янтарную, лимонную, яблочную кислоты. Слабо утилизирует: 1=рибозу. 0арабинозу, L-рамнозу, 1-метил-D-глюкозид, глицерин, рибит. этанол, Не утилиэирует:

О-ксилозу, L-арабинозу, мелибиоэу, лактоэу. крахмал, эритрит, дульцит. инозит. 5-кето-глюконат, глюкуроновую и молочную кислоты.

Ассимиляция нитратов: не ассимилирует.

В среде без витаминов не растет, нуждается в тиамине (В1).

Рост при 37 С: отсутствует.

Образование крахмала: нет, Расщепление арбутина: есть.

Уреазная активность: присутствует.

Проведение испытаний чувствительности различных видов дрожжей к одному из эффективных лечебных гиполипидемических препаратов — ловастатину. показало, что рост предлагаемого штамма Rhodotorula

rubra ВКПМ Y-1337 (438) ингибируется ловастатином в концентрации 0,05 мкг/мл через

20 ч от начала испытаний (табл. 1). В то же время штаммы прототипа чувствительны к ловастатину в концентрациях 0,1-2,0 мкг/мл и ингибирующий эффект достигаетчерез 96 ч культивирования.

1705346

Таблица 1

Чувствительность предлагаемого штамма и штаммов прототипа к гиполипидемическим факторам.

Данные табл, 1 показывают, что преимуществами предлагаемого штамма по срэвнению со штаммами прототипа является, во-первых, более низкая минимэльнэя ингибирующая концентрация (0,05-0,2 5 мкг/мл) против 0,1-1,0 мкгlмл в прототипе) и меньшее время достижения ингибирующего эффекта (20 вместо 96 часов в прототипе).

Приведенные характеристики штамма 10 позволяют использовать его в качестве тест-организма при определении ингибирующей активности гиполипидемических средств в биологических жидкостях и в чистых препаратах. Кроме того, предлагаемый 15 штамм может быть использован при изыскании новых лекарственных средств для лечения атеросклероза, в частности, таких, кэк ингибиторы синтеза холестерина; ловастатин, компактин и их аналоги и др. 20

Пример 1. Посевной материал

Rhodotorula rubra ВКПМ Y-1337 (438) выращивают на скошенной среде, содержащей

0,67ь Bacto yeast nitrogen base фирмы

Dlfco, 0,5 глюкозы и 1,57, агар-агэрэ, рН 25

5,3 при комнатной температуре в течение 48

Ч.

Клетки смывают стерильной жидкой средой описанного состава и вносят в опытные среды того же состава из расчета 1 10 30 кл/мл. Выращивание проводят глубинным способом, нэ качалке, при 25 C. В опытные варианты вносят 0,05 мкг/мл ловэстэтина в форме Na соли соответствующей оксикислоты. Ингибирование роста клеток ловэстати- 35 ном оценивают по оптической плотности при 610 нм по сравнению с контролем (рост дрожжей без ловастэтина).

Кэк показано в табл. 2 0,05 мкг/мл является минимальной ингибирующей концент- 40 рацией ловастатинэ для Rhodotorula rubra

ВКПМ У-1337. Эффект ингибирования отмечается уже через 16 — 20 ч от начала культивировэния дрожжей с ловэстэтином и прослеживается вплоть до 40 ч.

Примвр2, Подготовку посевного материала и культивирование Rhodotorula rubra ВКПМ Y1337 (438) проводят также, как в примере 1.

Отличие заключается в том. что ловастатин в опытные вэрианты вносят в количестве 0.1 мкгlмл, Данные табл. 2 показывают, что повышение концентрации ловэстэтина увеличивает его ингибирующий эффект на рост предлагаемого штамма нэ протяжении всего периода наблюдаемого времени.

Пример 3.

Подготовку посевного мэтериэла и культивирование штамма Rhodotorula rubra

ВКПМ Y-1337 (438) проводят также, как и в примере 1. Отличие заключается в том. что ловастатин в опытные варианты вносят в концентрации 0,5 мкг/мл. Пятикратное увеличение гиполипидемического фактора усиливает торможение роста тест-объекта, при этом прирост количества дрожжей отсутствует после 20 ч инкубации (табл. 2), Пример 4.

Подготовку посевного материала и культивирование Rhodotorula rubra ВКПМ Y1337 (438) проводят также, как в примере 1.

Отличие заключается в том, что ловэстэтин в опытные варианты вносят в концентрации

2,0 мкгlмл. Высокие концентрации ловэстэтина (в частности 2,0 мкг/мл) приводят к

50 -ному торможению роста штамма тесторгэниама, Прирост количества дрожжей практически отсутствует после 16 ч инкубэции (табл, 2).

Формула изобретения

Штамм дрожжей Rhodotorula rubra (Demme) Lodder В КПМ Y-1337 (438), используемый в качестве тест-организма для выявления и оценки действия гиполипидемических средств.

1705346

Таблица 2

Ингибирование роста Rhodotorula rubra BK0M Y - 1337 (438) ловастатином в различных концентрациях.

Составитель Н.Баранова

Редактор М.Васильева Техред М.Моргентал Корректор М.Максимишинец

Заказ 170 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государс1венного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва. Ж-35, Раушская нэб., 4/5

Производс1вев <о и брательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101