Штамм бактерий еsснеriснiа coli, предназначенный для получения 2ъ-дезоксиаденозина

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству биологически активных соединений . Целью изобретения является повышение активности штамма. Штамм Escherlchla coll получен из музейного тиминзависимого штамма путем отбора наиболее активных вариантов при последовательном выращивании на агаризованной среде Адамса с тимином (1 мкг/мл), затем с тиминарабинозидом (5 мкг/мл) в качестве источника тимина и на среде, содержащей тимин (1 мкг/мл) и инозин (1 мг/мл) в качестве единственного источника углерода. Штамм E.coll БМТ-2Д/1А депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов под коллекционным номером В КМ СВ-319Д и характеризуется тем. что его покоящиеся клетки способны осуществлять трансформацию аденина в 2 -деэоксиаденоэин, используя в качестве доноров углеводной части молекулы целевого продукта 2 -дезоксинуклеозиды, образующиеся при гидролизе ДНК. Активность клеток при 60°С и рН 7,0 составляет 1.2 мкмоль продукта (мин) мг клеток (в расчете на сухую массу). 1 табл. ё

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)з С 12 P 19/40

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

k (21) 4780738/13 (22) 09,01,90 (46) 15.01.92. Бюл. М 2 (71) Институт микробиологии АН БССР (72) А.И.Зинченко. В.Н,Барай, Н.В.Дудчик, С, Б. Бокуть и И,А, Михайлопуло (53) 577.2/048 (088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР

М 986102, кл, С 12 P 19/38. 1981.

2. Авторское свидетельство СССР

М 1258079, кл. С 12 P 19/40, 1984, 3. Авторское свидетельство СССР

М 1398399, кл. С 12 P 19/40, 1988. (54) ШТАММ БАКТЕРИИ ESCHERICHIA

C0Ll, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ 2 -ДЕЗОКСИАДЕНОЗИНА (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству биологически активных соединений. Целью изобретения является повышение активности штамма. Штамм

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству биологически активных соединений.

Способы получения 2 -дезоксиаденозина основываются на ферментативном гидролизе его природного источника — ДНК до смеси четырех 2 -дезоксинуклеозидов с последующим выделением целевого продукта тем или иным хроматографическим методом. Общий недостаток этих способов заключается в относительно низком выходе

2 -дезоксиаденозина. Это обусловлено тем, что он является лишь одним из четырех нуклеозидных компонентов ДНК. Например, согласно способа (1), предусматривающего

„„SU „„1705347 А1

Escherlchla coll получен из музейного тиминэависимого штамма путем отбора наиболее активных вариантов при последовательном выращивании на агариэованной среде Адамса с тимином (1 мкг/мл), затем с тиминарабинозидом (5 мкг/мл) в качестве источника тимина и на среде, содержащей тимин (1 мкг/мл) и инозин (1 мг/мл) в качестве единственного источника углерода. Штамм Е,coll 6МТ-2Д/1А депонирован во Всосоюзной коллекции микроорганизмов под коллекционным номером В KM CR-319Д и характеризуется тем. что его покоящиеся клетки способны осуществлять трансформацию аденина в 2 -дезоксиаденоэин, используя в качестве доноров углеводной части молекулы целевого продукта 2 -дезоксинуклеоэиды, образующиеся при гидролизе ДНК. Активность клеток при

60 С и рН 7.0 составляет 1.2 мкмоль и родукта (мин) мг клеток (в расчете на сухую массу).

1 табл. гидролиз ДНК ферментным препаратом, полученным иэ Асбпотусез coelicolor, в гидролизате методом жидкостной хроматографии обнаруживается 2 -дезоксиаденозин в количестве 15,5 от массы исходной ДНК.

При гидролизе ДНК сырой биомассой гриба Splcarla vlolacea БМ-205 (2) в гидролизате обнаруживают 20$ 2 -дезоксиаденоэина по массе от взятой в реакцию ДНК.

Известен способ получения 2 -деэоксиаденозина, позволяющий резко (до 54,97ь) повысить выход целевого продукта из ДНК.

Он заключается в применении штамма бактерий Erwinla herblcota ЦМПМ В-3275 (3), клетки которого при инкубации их с гидролизатом ДНК и аденином при 55-60 С и рН

1705347

55 роста набаюдаетса прн рН среды 7,0-7,5, ра

6,75-7,25 трансформируют нуклеозиды

ДНК вЂ” 2 - деэоксигуанозин, 2 - дезоксицитидин и 2 - деэокситимидин в 2 -дезоксиаденозин, что обеспечивает более полную утилизацию взятой в реакцию ДНК и, таким образом, более высокий выход целевого продукта.

Недостатком известного штамма Erw.

herblcola ЦМПМ В-3275 является сравнительно низкая активность его клеток в реакции синтеза 2 -дезоксиаденозинэ из аденина и гидролиэата ДНК, составляющая

0,4 мкмоль/мин/мг клеток, Это приводит к затрате 3,63 r клеток на получение 1 r целевого продукта.

Целью изобретения является повышение активности штамма, Штамм Е. coll 2Д/1А получен из музейного тиминзависимого штамма Е. со!!

W3110 путем отбора наиболее активных вариантов при последовательном выращивании на агаризовэнной среде Адамса с тимином (1 мкг/MR), затем с тиминарабинозидом (5 мкг I мл) в качестве источника тимина и на среде, содержащей тимин (1 мкг/мл) и иноэин (1 мг/мл) в качестве единственного источника углерода.

Штамм Е. coll БМТ-2Д/1А депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов под коллекционным номером ВКМ CR.319Д и характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Под микроскопом клетки имеют вид епрямых палочек с закругленными концами (1,1 — 1,5)х(2.0-6,0) мкм. Встречаются отдельно или парами. Спор и капсул не образуют.

Клетки обладают подвижностью. По типу движения перитрихи. Грамотрицатепьные, В бульоне Хоттингера к 24 ч (37 С) рост выражен в виде легкою помутнения. На дне пробирок образуется комковатый осадок, который полностью взмучивается при встряхивании (S-форма).

На мясо-пептонном агаре и агаризованной среде Адамса (37 С, 3 сут) колонии гладкие, слабо выпуклые, легко сливающиеся.

Консистенция вязкая. Цвет колоний сероватый. Поверхность блестящая. рельеф однородный. Края колоний слегка волнистые, На агариэованной дифференциальной среде Эндо штамм растет в виде полупрозрачных колоний без изменения цвета среды.

Диапазон температуры роста 7 — 40 С.

Оптимальная температура 36-37 С.

Диапазон рН роста 5,5-8,5. Оптимум

Физиолого-биохимические признаки.

Факультативный анаэроб, В процессе роста сбраживает до кислоты с незначительным выделением газа глюкозу, арабинозу, трегалозу, мапьтозу, маннит, глицерин. Не усваивает сахароэу. лактозу, рафинозу. сорбит, дупьцит.

В качестве единственного источника углерода может использовать ацетвт, но не цитрат и инозит.

Желатину не разжижает.

Крахмал не гидролизует.

Молоко не свертывает.

Гидролизует РНК, Гемолитическими свойствами не обладает. Не токсичен и не патогенен для теплокровных животных.

Усваивает аммонийный и нитратный азот. Наиболее активный рост биомассы обеспечивают органические источники азота (пептон, дрожжевой и кукурузный экстракты, ферментапизат БВК).

Продуцирует индол и катвпаэу, Не образует уреазу и оксидаэу.

Содержание Г+Ц в составе ДНК

50,3 +. 0,5 моль.$ (определено оптическим методом).

Штамм сохраняет жизнеспособность не менее года при хранении в холодильнике (+4 С) на полноценной агариэовэнной среде (МПА, среда Хоттингера) под слоем ввзелинового масла, а также в лиофильно-высушенном состоянии.

Интактные клетки Е.coll БМТ-2Д/1А обладают способностью трэнсгликозилировать аденин до 2 -деэоксиэденоэинв с использованием в качестве доноров углеводного фрагмента 2 -дезоксинуклеозиды

ДНК с эффективностью 1,2 мкмоль 2 -деэоксиаденозина/мин/мг клеток (в расчете на сухую массу).

Активность клеток измеряют путем прямого определения количества 2 -дезоксиаденозина, образующегося при инкубации сырой биомассы клеток со смесью аденина с гидролиэатом ДНК. С этой целью реакционную смесь (1,0 мл), содержащую 13,5 мг аденина, 0,37 мл гидролиэата ДНК и 1 мг клеток, инкубируют при 60 С в течение 10 мин. После инкубации реакционную смесь центрифигируют (8000 g. 10 мин) и надосадочную жидкость хроматографируют на тонкослойной пластинке "Sllufol-ОЧ2у" в охлажденной (+4 С) воде. Целевой продукт обнаруживают в УФ-свете, идентифицируя сравнением с положением образца-свидетеля, и элюируют 0,05 М К-фосфатным буфером (рН 7,0). Оптическую плотность элюата измеряют нэ спектрофотометре. Концентцию 2 -деэоксиаденозина рассчитывают, 1705347 используя коэффициент молярной экстинции при длине волны 260 нм, равный 14380.

Эффективность штамма Е.coll БМТ2Д/1А в сравнении с другими штаммами микроорганизмов представлена в таблице.

Сравнительная оценка эффективности наиболее активных иэ 120 проверенных штаммов микроорганизмов представлена в таблице.

Из данных таблицы следует, что эффективность клеток Е.coll БМТ-2Д/1А в несколько раэ выше любого иэ проверенных штаммов микроорганизмов.

Использование штамма Е.coll БМТ2Д/1А иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Культуру штамма Е.со11

БМТ-2Д/1А вносят петлей с косяка в колбу емкостью 250 мл, содержащую 50 мл питательной среды (МПБ с 0,5 -ным дрожжевым экстрактом), и культивируют на биологической качалке (180 об/мин) в течение 20 ч при 37 С. После осаждения клеток центрифугированием (5000 g,10 мин) получают 0,5 г сырых клеток (0,1 г в расчете на сухую массу) с активностью 1.1 мкмоль/мин/мг сухой биомассы.

Пример 2. Клетки Е.coll БМТ-2Д/1А, выросшие в 2-х 250 мл колбах, засевают в лабораторный ферментер АК-3 емкостью 3 л, содержащий 2 л питательной среды. Ферментацию ведут 12 ч при 37 С с аэрацией

0,8 л/мин на 1 л среды.

После окончания культивирования клетки собирают центрифугированием, получая

20 г сырых клеток (4 г в расчете на сухую массу) с активностью 1,2 мкмоль 2 -дезоксиаденоэина/мин/мг сухой биомассы.

Для приготовления гидролизата ДНК к

0,8 г ДНК молок лососевых рыб в 25 мл 0.05

М натрий-ацетатного буфера (рН 5,0) прибавляют 0,15 мл 0,25 М хлорида магния, 1,5 мл этанола и сырую биомассу Splcaria

vlolacea БМ-205 в количестве 0,5 г(в расчете на сухую массу). Смесь доводят водой до 30 мл и инкубируют 30 ч при 60 С, После фильтрации получают 30 мл гидролизата, содержащего 2 -деэоксиаденоэин, 2 -деэокситимидин, 2 -деэоксигуаноэин и 2 -деэоксицитидин, в концентрациях, соответственно.

22,9 мМ, 24,2 мМ, 15,2 мМ и 17,5 мМ, 5 Смесь общим объемом 80 мл, содержащую 1,1 г аденина, полученный выше гидролизат ДНК, 0,65 r клеток Е.coll БМТ-2Д/1А (в расчете на сухую массу), инкубируют 1,5 ч при 60 С. После удаления клеток центрифу10 гированием (8000 g 10 мин) супернатант кипятят 5 мин и наносят на колонку (100 мл) со смолой АВ-17-2М в ОН-форме, Колонку промывают водой, Фракции. содержащие

2 -деэоксиаденозин (0,6 л), собирают, упари15 вают до 25 мл и продукт кристаллизуют на холоду. Получают 0,49 г кристаллического

2 -дезоксиаденозина. Выход целевого продукта в расчете на исходную ДНК составляет 61,2 мас.7ь.

При хроматографировании на тонкослойных пластинках "Sllufol-UVzs4" в системе растворителей хлороформ;этанол (4:1) и и-бутанол: 25ф -ный водный аммиак (7;2) по25 движность целевого продукта совпадает с

Rf заведомо известного препарата 2 -дезоксиаденозина.

Т.пл. целевого продукта 192-193 С, Элементный анализ для С1оН зй50з.

30 М=251,2.

Найдено, 7;: С 47,92; Н 5,19; N 27,60.

Вычислено, 7ь: С 47,81; Н 5,18; и 27,89.

Использование штамма обеспечивает по сравнению с известным штаммом-прото35 типом следующие преимущества: повышение активности биокатализатора в реакции синтеза 2 -дезоксиаденозина из гидролизата ДНК и аденина с 0,4 до 1,2 мкмоль/мин/мг;

40 снижение расхода клеток на получение

1 г 2 -дезоксиаденозина с 3,63 до 1,3 г; повышение выхода целевого продукта с

54,9 до 61,2 мас.$ от исходной ДНК.

Формула изобретения

45 Штамм бактерий Escherlchla соИ BKM

CR-319Д, предназначенный для получения

2 -дезоксиаденозина.