Рекомбинантная плазмидная днк plt21, кодирующая полипептид со свойствами лимфотоксина человека, и штамм бактерий escherichiacol - продуцент полипептида со свойствами лимфотоксина человека

 

Изобретение относится к биоте)(:нологии, в частности к генетической инженерии, и позволяет получать микробиологическим синтезом новый полипептид со свойствами лимфотоксина человека при упрощеннойтехнологии его получения. Целью изобретения является повышение выхода пслипептида со свойствами лимфотоксина человека. Создана новая рекомбинаитйая плазми.аа pLT21, кодирующая полипептид, представляющий собой укороченный на 21 амино" кислотный остаток лимфотоксин человека и штамм Е.соП 20050/pLT21, обеспечивающий высокий уровень биосинтеза полипептида со свойствами лимфотоксина человека. Рекомбинантн'ая пла'змида pLT2T содержит полусинтетичёский ген полипептида со свойствами лимфотоксина человека. Она состоит из Hind 1П Крп1 - фрагмента плазмиды pTNF31, содержащего тандем промоторов транскрипции А2 и A3 ранней области бактериофага 17, Терминатор трг.н.'.крипции фагаАи гены^-лактамазы и хлорамФеникодацетйлтрансферазы. и Kpnl/Hind III -фрагмента, содержащего синтетический участок инициации трансляции и мутантный геном лимфотоксина человека. Штамм Escherichla coli SG.20050/pLT21 обеспечивает высокий уровень биосинтеза полипептида со свойствами лимфотоксина человека и упрощенной технологией его выделения. 2 с.п, ф-лы, 2 ил„

союз советских

СОЦИЛЛИС гИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

s С 12 N 15/12, 15/77

ГОСУДАРСТВЕ ННЫЙ КОМИТЕТ

fl0 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

Г1РИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ".." "- -"- !! 11ИЕТН6 тЕХИИФЕР

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (116) 30..07.93. Вюл.. 0 28 (2 1) 4834066/13

Р2) 21.03 90 (71).Институт биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Всесоюзный научноисследовательский институт прикладной энзимологии P2) В,Г;Коробко, В .H.Äoápûíèí, 4;А.Филиппов, A.Ì,×óìàêoâ, М. Н;Шингарова, И.B,Äàéûäoâ, 8;А.Бумялис и Е,А.Янулайтис (56) Авторское свидетельство СССР

И 1561510, кл. 6 12,N 15/ОО f988.

Kobiyskl et а!. J:Blocht.m-. 1986, N 100, Й - 3, p,727 — 733. (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ

ДНК pLT21. КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД

СО.СВОЙСТВАМИ ЛИМФОТОКСИНА ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ.

ESCHER1CHfA C0Li-ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА СО СВОЙСТВАМИ ЛИМФОТОКСИНА ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к биотехноло- гии, в частности к генетической инженерии, и:позволяет получать микробиологическим синтезом новь1й полипептид со свойствами лимфотоксина человека при упрощенной

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой сконструированную ln

vitro рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую полус1лнтетический ген лимфотоксина человека; промоторы ранней области бактериофага Т7 и синтетический участок инициации трансляции, обусловливающий биосинтез полипептида с биологи„„. Ж „„1709731 А1 технологии его получения. Целью изобретения является повышение выхода полипеп-тида со свойствами лимфотоксина человека.

Создана новая рекомбинантиая плазмида

pLT21, кодирующая полипептид, представляющий собой укороченный на 21 аминокислотный остаток лимфотоксин человека и штамм Е.coll 20050/pLT21, обеспечивающий высокий уровень биосинтеза полипептида со Свойствами лимфотоксина человека.

Рекомбинантная плазмида р1Т21 содержит полусинтетический ген полипептида со

Ф свойствами лимфотоксина человека. Она со- . стоит из Hind ill Крп1- фрагмента плазмиды

pTNF31, содержащего тандем npoMoropoâ транскрипции А2 и АЗ ранней области бактериофага Т7. терминагор тр;.н.-.крипции. фага Л и гены Р-лактамазы и хлорамфениколацетилтрансферазьг, и Крп1/Hind ill — фраг-. йента. содержащего синтетический участок инициации трансляции и мутантный геном лимфотоксина человека. Штамм Escherlchia со11 SG. 20050/pLT21 обеспечивает высоки1л уровень биосинтеза полипептида со свойствами лимфотоксина человека и упрощенной технологией его выделения. 2 с.п. ф-лы, 2 ил, ческой активностью лимфотоксина человека, а также штамм Escherlchia coll — продуцент зтого полипептида.

Лимфотоксин (ЛТ) представляет собой гликопротеин с мол. м. около 25000 Да. 8 организме человека лимфотоксин главным образом продуцируется актианрованными

Т-лимфоцитами. В опытах in vitro u in vivo было продемонстрировано. что природный

1709731 (гликозилированный) и рекамбинантный (негликаэилиравэнный) лимфатоксин вызывает геморрагический некраз некоторых видов солидных опухолей, гтричем как и н случае фактора йекраза опухоли особенно эффективно его цитатоксическая актив° ность проявляется на опухолях с повышен, ной Малигнатностью. Как и фактор некроза опухоли лимфотоксин, являясь иммуномадулятором широкого спектра действий, проявляет свою.цитотоксическую активность .нысокоизбирательно, воздействуя лишь на апухолевые клетки и не затрагивая здоровые; нетрансформированные клетки. Кроме того, следует отметить, что лимфотаксин обладает,выраженным противанирусным действием по отношению к ряду ДНК- и

PHK-содержащих вирусов, Все.это делает иедицинское n ðèìåíâíèå лимфотоксина человека черезвычайно перспективным.

Известен способ получения лимфатаксина человека, основанный нэ культивироеании апухолевых линий клеток человека йРМИ788 и АС5-Й. которые при индукции

Форбаловыми эфирами, бактериальными эндатоксинами и конканавалином А секретируют лимфатоксин во.внеклеточную среду

Недостатками зтога метода являются черезвычайно низкий выход целевого продукта, трудности крупномасштабного культивирования клеточных линий и, как следствие,. высокая стоимость препаратов

ЛТ.,, ь . Значительна более перспектйвным является способ получения лимфотоксинэ микробиалОгическим синтезам; KoTopQA обеспечивает возможность получения целе, sего продукта са значительно более высокам выходам из сравнитнльно. недорогого исходного сырья. Испольэонэнив при этом химического подхода позволяет создать оптимальные для бактериальной экспрессии варианты структурного гена, а также регулятарных элементов, контролирующих ега экспрессию.

Известна рекамбинантная плазмида

pLTtrp1, кодирующая полипептид со свойствами лимфатаксина человека. н которой ген

AT экспрессируется пад контролем промотора триптафаиового оперонэ. Сведения аб уровне биосинтезэ, лимфотаксинэ штаммом

Е.саИ. содержащий плазмиду pLTtrp1, отсутствуют.

Известна рекомбинантнэя плаэмида

pLT13tac6- 8.2. кодирующая полипептид са свойствами пимфотаксинэ человека. сконструированная нэ основе плэзмиднаго вектора аКК223-3. Плазл1ида pLTtac6-8.2 содержит укороченный геи, кодирующий бе20

40

Кроме того, недостатком известных плазмид является также та, чта все они имеют малопригодную для генно-инженерных операций рестриктную кэрту. чта знэчитель* но затрудняет дальнейшие операции по усовершенствонанию плазмидных конструкций с целью дастйжения максимальной экспрессии полусинтетическага гена ЛТ..

Известная рекамбинантная плэзмидная ДНК pLT9, кодирующая укороченный с.

N-конца полипептид са свойствами лимфотоксина человека, в котором 9 N-концевых аминокислот заменены остатком валина.

Экспрессия гена укороченного палипептида в плазмиде pLTS контролируется канститутивными праматарами:А2. и АЗ ранней области бактериафага Т7 и синтетическим участком инициации трансляции, Штамм

Е.coll SG 20050, содержащий плазмиду

pLT9, обеспечивает высокий уровень палипептида со свойствами пимфотаксинэ человека (свыше 4 х 1 0 ед/мл клеточной суспензии). По принципу конструирования рекамбинантная плазмида pLTS, содержащая иэмененный ген лимфатаксинэ, является наибадее близким техническим решением к изобретению.

Целью изобретения является повышение выхода палипептида со свойствами лимфатоксина человека.

Поставленная цель достигается с памощью новой рекомбинантиой плазмиды

pt.Т21, кадирующей конститутивный синтез палипептида са свойствами лимфотаксина человека, и штамма F.ñoll SG 20050/pLT21, обеспечивающего уровень экспрессии

ЛТ2 х 10 еК/лгл клеточной суспеизии при

7 плотности клеток 10 клеток/ лп.

Реко лбинантиэя ппптмиднэя ДНК а! Т21, кодирующая пп и ич,1 п1д по свайстлак. у которого s отличие ат прираднога белка вместо первых десяти N-концевых эминакислатных остатков имеется последовательность AspL80. Такая конструкция в штамме Е.саИ JM105 при индукции изаг|рапилтиа P -D- галактозидом (!РТ6) обеспечивает экспрессию измененного гена ЛТ,. причем биологически активный белок составляет 1Я, суммарного белка бактерий

10 Недостаткам плэзмиды pLTtac6,8-2 яв-. ляется недостаточно высокий уровень биасинтеза ЛТ,.обеспечиваемый содержащим ее штаммом-прадуцентам, а также необхадимасть в этом случае и н случае плазмиды р1 Ттгр1. ьсуществления нетехнологической стадии индукции биосинтеза при п .,"чeнии лимфатоксина, так как экспрессия генов.ЛТ в этих конструкциях индуцибельна.

1709 31 вами лимфотоксина человека. харэктеризу- Культурэльные призняки. Клетки хороется следующими признаками: шо растут.на простых питательных средах. . кодирует. аминокислотную последовэ-: При росте на агаре "Дифко" колонии кругтельность лимфотоксина человека, у которо-, лые. гладкие, прижаты, .мутные. блестящие го делетирован 21 N-концевой 5 серые, край ровный. При росте в жидких эминокислотный остаток, имеет мол.м, 2,62 средах (на минимальной среде с глюкозой

МДа (4,02 т.п.о.), . или В-бульоне) образуют интенсивную состоит из: . ровную муть. . НЬбИ! /Kpn) — фрагмента ДНК плэзми- Физико-биологические признаки. Клвтды pTNF31. содержащего тандем промото- 10 ки растут при температуре От 4 да 40ОС при ров А2 и АЗ ранней области бактериофагэ оптимуме рН от 6,8 до 7,0. 8 качестве источТ7, терминатор транскрипции фага лямбда, ника азота используют как минеральные toген р -лактамазы и ген хлорамфениколэце- ли в аммонийной форме, тэк и органические. тилтрансферазы(3,4т.п,о.),: . Саед мнения в видв пептона., триптона, Kpnl/Hlndlll — фрагмента, содержащего 15, дрожжевого экстракта, аминокислот и т,д. 8 синтетический саит инициации трансляции качестве источника углерода используют и мутантный геном лимфотоксина человека - аминокислоты, глицерин, углеводы. (0,63,n.o.), Устойчивость к антибиотикаМ. Клетки содержит: проявляют устойчивость к эмпициллив качестве генетического маркера ген 20 ну (до 300 мкг/мл) и хлорамфениколу

P лактамазы и ген хлорамфениколэцетилт- (до 500 мкг/мл). обусловленную наличием рансферазы, детерминирующие устойчи- плазмиды, а также к тетрэциклину (до 30 вость трансформированных плазмидой . мкг!мл) благодаря наличию транспозонэ;

pLT21 клеток Е,соИ к пенициллиновым анти-. Штамм Е.сой SG 20050/pLT21 обусловбиотикам и хлорамфениколу, 25 ливает. конститутивный синтвз полипептида уникальные сайты узнавания рестрик- (фиг. 2) со свойствами лимфотоксина челове. ционными зндонуклеазами„расположеннь|- ка на уровне 2 х t0 едlмл клеточной суепен7 ми на следующих расстояниях вправо от зии, что составляет свыше 25;ь тотального сэйта Kpnl: Gsul — 129 нуклеотидов, ЯаИ вЂ” клеточного белка бактерий и превышает по 618 нуклеотидов, Н!пбИ! — 630 нуклеотидов, 30 казатели известных штаммов E,coll продуNcol - 1181 нуклеотид, Ndel — 1955 нуклео- центов лимфотоксина, .тидав. Пример 1. Химический синтез олигоРекомбинантная плазмида pLT21 со- нуклеотидов. Синтез олигонуклеотидов выдержит полусинтетический мутантный «ен полняют твердофэзным фосфорамидитным лимфотоксина человека. Источником для ее 35 методом на ДНК-синтезаторе System получения была рекембинантнэя плазмида.. (Beckman) с наращиванием олигонуклеi

pLT16,содержащая полусинтетическийгвн, отидной цепи в направлении от 3-конкодирующий последовательность природ- ца к 5-концу с помощью защищенных ного негликозилированного лимфотоксина фосфамидитов - 5 -диметокситритил-! человека. 40 N-ацил-2 - дезоксинуклеозид-3 -О-(метоксиl I

На фи«..1 изображена частичная струк- д и и з о и р оп и л а м и н о) - ф о с ф и т о в, тура плазмиды р Т20(нумерация аминокис- активированных тетрэзолом. Синтез проволотпо последовательности лимфотоксинэ)и дят в масштабе 0,5-0,7 мкмоль, используя в схема локализованного олигонуклеотид-на- качестве носителя пористое стекло {размер правленного мутагенеза плазмиды фЛ2О, 45 пор500А.рязмерчастиц40-80мкм), к кото на фиг. 2 представлена структура полйпеп- - рому через 3-сукцинатную связь присоедитида. кодируемого рекомбинантной:плазмй-: няют первое нуклеозидиое звено (нагрузка дой pLТ21. 20-30 мкмоль/г), Используют известный

Для получения бэктериальиогб итэм- синтетический цикл с тем лишь отличием, ма — продуцента полипептидэ с биологйче-, 50 что после реакции конденсации проводят ской активностью лимфотоксинэ человека .. прамывкусмолы.смесью тетрагидрофурэнв плазмидой pLT21 трансформируют момпв- : пиридий- вода (5:3:2). После окончания синтентные клетки Е.соИ SG 20050. - теза защитные группы удаляют последоеаПолученный таким образом штамм тельной обработкой тиофенолятом

Е.collSG20050/р Т21характеризуетсясле+ 55 триэтиламмония и конц. аммиаком. При дующими признаками. зтам происходит отделение алигонуклеаотиМорфологические признаки. Клетки да от носителя. 5 -Диметоксвтритильную мелкие, утолщенной палочковиднай формы, группу удаляют кислотной обработкой и грамотрицательные. неспоронасныв, ; олигануклеотид Очищают электрофорозом в

709731

20% ПААГ, содержащем 7М мочевину. Вы- Аликвоту реакционной смеси используют ход 1-5 о.е. для трансформации компонентных клеток

Пример 2. Конструирование рекомби- Е.coll. Трансформанты высевают на чашки нантной плазмидной ДНК pLT21. с LB-агаром, содержащим ампициллин

Для приготовления вектора ДНК плаз- 5 (100 мкг!мл) и хлорамфеникол. Скрининг ремиды рТИР33Л (10 мкг) обрабатывают в 70 . комбинантов проводят с помощью гибриди мклбуферай(20мМтрис-HCl,рН75,10мМ . зации колоний in situ с р-меченными зг

- MgCI2, 50 мМ NaCI, 5 мМ меркаптоэтанол) олигонуклеотидами (l) и (И). Из клонов, гибрестриктазой Xhol (20 ед.) в течение 1 ч при ридизирующихся с олигонуклеотидом (И) и

37 С. Реакционную смесь-охлаждают до 10 негибридизующихся с олигонуклеоитидом

10ОС, прибавляют четыре дезонксинукпео- (!), выделяют ДНКи анализируют с помощью эйд-5-трифосфата до концентрации 50 мкМ эндонуклеаз НаеИ! и Msp! и определением

l и 10 ед. ДНК полимеразы 1 Е.coll (фрагмент . нуклеотидной последовательности регупяКленова), инкубируют 1 ч при 10ОС, после торной области и начала структурного гена. чего реакцию останавливают прибавлением 15 Одну из полученных таким образом рекомЕОТАдо концентрации 25мМ. Смесьpenpo- бинантных ДНК, р! Т20, используют для теинизируют двухкратной фенольной экст- дальнейшего конструирования. ракцией, ДНК высаживают этанолом; ПримерЗ. Конструирование рекомбипромывают 70%-ным этанопом, высушива- нантной плазмидной ДНК pLT21, ют, растворяют в 50 мкп буфера R и обра- 20 К раствору 10 мкг ДНК плазмиды pLT20 батьгвают 15 ед. эндонуклеазы Н!пб!1I 2 ч . в 100 мкл буфера Й прибавляют рестриктапри 37ОС. Векторный фрагмент величиной. зы Крп! и Hindi!I (по 25 ед. каждой) и инку3,4 т.п;о, выделяют электрофорвзом в 1%. бируют 1 ч:при 37ОС, после чего фрагмент !.МР-вгарозном геле, Затем обрабатывают . (=700 и;о.) выделяют электрофорезом в

90 мкг ДНК плазмиды pLT16 в 500 мкл буфе- 25 1%-ном геле легкоплавкой агарозы,. Анало- . ра R рестрикционной эндонуклеаэой EcoRI гичным образом гидролизуют 2 мкг penw(100 ед.) в течение 1, 5 ч при 37ОС, После . кативной формы ДНК (РФ ДНК) фага этого прибавляют 100 мкл буфера. содержа- М13гпр10 гидропизом той же смесью эндощего 66 мМ трис-HCI; pH 8,0, 77 мМ йаС1, нуклеаз и векторный фрагмент также очи5 vM IVIgClz e 10 мМ дитиотреит, и 50 ед.эк- 30 щают электрофорезом в. 1%-ном геле зонуклеаэы 1И Е.соИ (Sigma), Отбирают легкоплавкой агароэы. Затем 0.5 мкг векторапиквоты по 300 мкп через 5, 7 и.S мин и ного фрагмента -лигируют с 0,1 мкг реакцию останавливают прибавлением 35 мкл Kpnl/Hindi!I-фрагмента. полученного иэ . 100 мМ раствора спермина; смесь выдер- плазмиды pLT20. в 20 мкп буфера L a течеживают 15мин при ООС, центрифугируют 35 ние 10 ч при 13 C. Одной десятой частью

10 мин при 12000 об/мин. Осадок промы- . лигаэной смеси трансформируют компетенвают80%-ным зтанолом. содержащим 03M тные -клетки Е.coll WK-6 mutS. После ацетзт натрия и 10 мМ ацетат магния, сно- - трансформации клетки смешивают и ри ва центрифугируют, после чего осадок. 42 С с 3 мл 0,8% LB-агapa. содержащего растворяют в 300 мкп буфера, содержащд- 40 40 мкг/мл 5-бром-4-хлор-,В -О-галактопираго 50 мМ ацетат натрия, рН 5,0,30 мМ NaCI . ноэид. (Х-GaI), 1 мМ изопропилтио j3 -0-гаи ) мМ ZnS04, прибавляют 40 ед; нукпеазы лакто-пиранозид и 200 мкл культуры клеток из золотистой фасоли и смесь инкубируют E.cîII WK-6 mutS в логарифмической фазе

30 мин при ЗООС. Реакцию останавливают . роста. Смесь выливают на чашки с 1,64/. осаждением ДНК спермином, как описано 45 LB-агаром.и после застывания инкубируют. выше. Осадок. промывают. зтанопом, высу- 16 ч при 37ОС, Из фаговых клонов, образуюшиввют. растворяют в 300 мкл буфера и й щих бесцветные бляшки. выделяют двухцеобрабатывают 80 ед. рестриктаэы HIndlll в почную РФ ДНК и ее анализируют с течение 4 ч при 37ОС, после чего фрагменты .. помощью совместного гидролиза рестрикДНК нужного размера (около 600-650 п.î.), 50 тазами Kpnl и Hindill, Для дальнейшей расодержащие большую часть гена лимфоток- .,:боты . используют рекомбинантный фаг сина, выделяют при помощи электрофореза M13LT20; содержащий нужной величины в 1%-ном геле легкоплавкой агарозы. фрагмент Kpnl/Hindi!i. Для выделения од0,2 мкг полученного таким образом ноцепочечной(+)-ДНКк10wn2xLB-бульона фрагмента ДНК лигируют в 25 мкл буфера L 55 прибавляют 0,1 мл ночной культуры клеток (20 мМ трис-HCI; pH 7,5, 10 мМ МцС!2, Е.coll WK-6 rgutS; e смесь вносят кусочек

0,2 мМ rATP, 10 мМ дитиотреит) с 1 мкг верхнегоагара.содержащего индивидуальвекторной ДНК. полученной, как описано ную фаговую бляшку, и инкубируют при выше, из плазмиды рТИГЗЗ, с помощью аэрации 6 ч при 37 С. Затеи летки центри 50 ед. Т4 ДНК-лигазы в течение 6 ч при 15 С.

l70973 I

10 фугируют (12000 об/мин, 5 мин), к супернатанту прибавляют 1.4 мл раствора. содержащего 20;ь полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) и 2,5 M NaCI. выдерживают 15 мин при 20 С и центрифугируют 5 мин при 5

12000 об/мин. Осадок растворяют в 100 мкл буфера, содержащего 20 мМ трис-НО, рН

8.0, 1 мМ ЕОТА. раствор трижды экстрагируют фенолом и ДНК высаживают. зтанолом. 10

Для проведения мутагенеза 0.5 мкг(+)-. нити ДНК фага M13LT20 смешиваЮт с

250 пмоль фосфорилированного.олигойуклеотида (Ill) в 50 мкл буфера L без дитиот- реита и rATP, смесь нагревают в течение .15

15 мин при 80 С. после чего медленно в течение 3 ч охлаждают до 15 С, затем прибавляют dATP. dGTP u TTP до концентрации

100 мкм каждого и 15 ед. ДНК-полимеразы

Е.соИ (фрагмент Кленова). Смесь инкубиру- .20 ют 4 ч при 15 С, затем прибавляют rATP до концентрации 0,1 мМ, дитиотреит до кон: центрации.10 мМ и 100 ед. Т4 ДНК-лигазы и продолжают инкубацию при той >ке температуре еще в течение 10 ч. Пятую часть-ре- 25 акционной смеси используют для. трансформации компетентных клеток Е.соИ

WK-6 mutS, описано выше, Скрининг рекомбинантных фагов проводят гибридизацией. с 5-(Р)-меченным мутагениэирующим оли- : 30 гонуклеотидом (III) в условиях жесткой От- . мывки (55 С, 2 x SSC). Клетки E.ñoÏ ЯК-6

"must, содержащие гибридиэующиеся с зон-. дом фаги, выращивают, из них выделяют репликативную форму фаговой ДНК и под- 35 вергают анализу с помощью совместного гидролиза рестриктаэами Kpnl+Pstl и ХИо1+.Рзд.Рекомбинантные фаги, содер>кащие .ДНК, нечувствительные к рестриктаэе Xhol и, о6разующие при гидролизе, смесью рестрик- 40 таз Kpnl u Xhot фрагмент. величиной342 п,о., M13LT21, отбирают для дальнейшей рабо- ты, Затем выделяют Крп!/Н!М1Н - фрагмент ДНК этих фагов, реклонируют.его Й плазмиду pTNF31h по тем же рестрикт- 45 ным свойствам, как описано выше. 8 ре-: зультате получили новую рекомбинантнуюплазмидную ДНК pLT21, структуру которой подтверждали рестриктным анализом с помощью эндонуклеаз HaeIII и Мар1, а 50 также определением нуклеотидной после. довательности ппаэмиды между сайтами

KpnI u HIndIII.

Плазмида pLT21 детерминирует био-синтез попипептида, представляющего eo" 55 бой укороченный с N-конца йа 21. аминокислоту лимфотоксин человека.

Пример 4, Получение. штамма-ирбдуцента полипептида со свойствами лимфотоксина человека.

Ппазмидой pLT9 рансфопмnpyют ксм петентные клетки E.colt 56 20050 по известному методу и получает штамм-продуцент полипептида со свойствами пимфотонсина человека.

I I р и м е р 5. Определение продуктивности штамма Е.colt — продуцента полипептида со свойствами лимфотпксина человека. .\

Клетки Е.соИ SG 20050/pLT21 выращивают при 37 С р 20 мл LB-бульона в течение

20 ч на качалке при скорости вращейия

190 об/мин, отбирают пробу 2 мл, клетки центрифугируют 10 мин при. 6000 об/мин, затем суспендируют в 1 мл буфера. содержащего 25 мМ трис-НО, рН 8,0, 0,5 мМ фенилметилсульфонипфторид и 5 мг/мл лиэоцим, и инкубируют 30 мин при 25 С. ь

Для вскрытия клеток смесь замораживают в . течение 10 мийпри -70 С, а затем оттаивают. во льду; эту операцию повторя|от трижды. после чего определяют содержание лимфотоксина в растворе измерением его биологической активности.

Биологическую активность ЛТ определяют на культуре трансформированных мышиных фибробластоа линии -.929. С этой целью монослойную культуру клеток выращивают а С02-термостате в 96-луночных пластинах для .культур клеток в среде

DMEM,:ñoäåðæàùått 10%-ную сыворотку теленка, Для определения биологической активности культуральную среду заменяют на свежую среду l3fAEM, содержащую 1 -ную сыворотку теленка, актиномицин 0 (1 мкг/мл) и клеточный лизат в двухкратных серийных разбаалениях (примерно соответствующих концентрации лимфотоксина

0Т 1 мкг/мл до 10 5мкг/мл). Пластины снова инкубируют в течение 16-20 ч в СОг-термостате, затем клетки прокрашивают трипановым синим и подсчитывают количество ок ра ше нн ых (жиз неспособн ы х) и неокрашенных (живых) клеток. За 1 единицу активности принимают количество лимфотоксина, вызывающее гибель 50% трансформированных клеток, Таким образом, предлагаемая группа изобретений позволяет получать новый norfипептид со свойствами лимфотоксина человека, причем уровень биосинтеэа такого полипептида составляет 2 х 10 ед./мл куль7 туры клеток, что составляет свыше 25% суммарного клеточного белка E.ñîtt при упрощенной технологии его получения за счет исключения стадии индукции биосинтеза белка, Формула иэoбреreния

1. Рекомбикантнвя плаэмидная ДНК

pl T21, кодирующая полипептид со свойст1709731

3;Ией Vsl Àãä Ser Ger. Ger Иа а ° еОЙАССМАМЙЙЙАЙТТААМА ГМ)ЙСХ,КОС GTT АОА TCC ФСО АСС CT GCQ.20 61в Иы А1а Ащ Gln Н1в Pra Xgs 5fe4 His Ьеи АХа Н1в Ser Thr Leu„..

646 LOT 000 CGT QAO 0М СЖ ААО АУС СА2 CTT GCQ CAC АСС AAC CTQ.

СССАОАСжОССОМСАОС

А

С

6 (О

Tg АА

Оу, О аО

° "О(ЙАССТЙИЙЙАМЖ2БИЫМТЙЙСОТЮМ CTTGQCGACAGQkkQCTC...

ЛЮАОИАТАС-GAAQGGGTGT COT (IXX) вами лимфотоксинэ человека. мол. м, 2,62

МДа и размером 4,02 т.п.о„содержащая

Hindlll-Kpnl — фрагмент ДНК плазмиды

pTNF31 с тандемом промоторов А2 и. А3 ранней области бактериофага Т7, терминатором транскрипции фага лямбда, геном Р-лактамазы и геном хлорамфениколацетилтрансферазы размером 3,4 т.п.о., Kpnl-Hlndlll - фрагмент с синтетичеСким сайтом инициации трансляции и мутантным геном лимфотоксина человека. кодирующим аминокислотную последовательность лимфотоксина человека. у которого делетирована 21 М-концевая аминокислота. размером 0,63 t,n.o., генетические маркеры: ген Р -лактамаэы — ген устойчивости к пенициллиновым антибиотикам, ген Св — гвн устойчивости к хлорамфе5 николу; уникальные сайты узнавания рекстрикционных зндонуклеазами, расположенные на следующих расстояниях вправо от сайта

Kpnl:GSUI 129 нуклеотидов. Sall — 618 нук10 леотидов. Н!п01И- 630 нуклеотидов. NCOI—

1181 нуклеотид, Ndel — 1955 нуклеотидов.

Й,. Штамм бактерий Езс1тег1сЫа coll

BKf1M 8-5279 — продуцент полипептида со

15 своествами лимфотоквина человека.

Корректор З,Лончакбва.

Редактор ЛЯавлова

Заказ 3088 Тираж . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитата по изобретенивм и открмтиям пре ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Рауаскав,наб,. 4/5 .

Производственно-издательский юмбинат "Патент", г„Ужгород, ул. Гагарина. 30!

Э

tQ

И

° г 1

Составитель Е.Кузнецова

Техред М,Моргвнтэл