Способ иммуноэлектроосмофореза

Авторы патента:

Изобретение относится к иммунологии, в частности к методу количественного имму-ноэлектрофореза, и может быть использовано для изучения количественных изменений антигенов. Цель изобретения - количественное определение антигена способом встречного электроиммуноосмофореза. Для осуществления способа проводят 'анализ антигена методом встречного иммуноэлектрофореза и после окрашивания пластины вырезают участки геля с окрашенным преципитатом, элюируют их 0.1%-ным раствором додецилсульфата натрия в 0,1 М ацетатном буфере, рН 5,0. с последующим фотометрированием элюата. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)s G 01 N 33/561

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

5=A В, К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4655809/14 (22) 27.02.89 (46) 23.02.92. Бюл. N. 7 (71) Северо-Кавказский научно-исследовательский институт фитопатологии (72) В,В.Чигрин, И.И.Соколов и И,С.Каневчева (53) 615.373 (088.8) (56) Nature. 1964, 201, 4924, 1092-1094. (54) СПОСОБ ИММУНОЭЛЕКТРООСМОФОРЕЗА (57) Изобретение относится к иммунологии,. в частности к методу количественного иммуИзобретение относится к иммунологии, в частности к методу количественного иммуноэлектрофореза, и может найти применение при изучении количественных изменений специфических антигенов.

Цель изобретения вЂ” количественное определение антигена способом встречного электроиммуноосмофореза при использовании поливалентных сывороток.

Способ осуществляется следующим образом.

Проводят анализ антигена методом встречного иммуноэлектроосмофореза, окрашивают образующиеся преципитаты Кумасси 8-250.

Для определения количества антигена иммунофореграмму подвергают стандартной обработке (сушка, окраска. промывка), затем вырезают участок фореграммы с окра. Ж 1714511 А1 ноэлектрофореза, и может быть использовано дляя изучения количественных изменений антигенов, Цель изобретения вЂ” количественное определение антигена способом встречного электроиммуноосмофореза. Для осуществления способа проводят анализ антигена методом встречного иммуноэлектрофореза и после окрашивания пластины вырезают участки геля с окрашенным преципитатом, элюируют их 0,1%-ным раствором додецилсульфата натрия в 0,1 М ацетатном буфере, рН 5,0, с последующим фотометрированием злюата. 2 табл. шенными преципитатами. Площадь вырезаемого участка где А вЂ” расстояние между центрами лунок, мм;

В вЂ” диаметр лунки+.4 мм (2 мм с каждой. стороны лунки), мм, Перед вырезанием сухой гель смачивают дистиллированной водой. Вырезанный участок фореграммы с окрашенным преципитатом .злюируют 0,2 M ацетатным буфером, рН 5.0; содеожащим 0,1%-ный додецилсульфат (ДДС) Na, при 50 С в тече- ; ние 1 ч.

Экстракт фотометрируют при 565 нм, а вычисление проводят исходя из.соотношения оптических плотностей растворов ана1714511

Таблица 1 лизируемого образца и наиболее близкого по окраске контрольного образца с известным содержанием антигена.

Пример 1. Навеску (1 г) листьев пшеницы, зараженных ржавчинным грибом, растирают в 0,1 М трис-глициновом буфере, рН 8,6, содержащем 0,1 аскаорбата натрия (5 мл). Экстракт центрифугируют при 6 тыс, g и сгущают криодиализом до

1/10 исходного объема. 0,05 мл надосадочной жидкости наносят в верхние лунки фореграммы. Размеры фореграммы определяются размером стекол, на которые нанесен гель.

Шесть лунок на фореграмме содержат определяемый антиген в известных концентрациях. В нижние лунки вносят антисыворотку с титром 1:128. Электрофорез проводят при напряжении 10 В/см и силе тока 1,5 MA/см. Участок фореграммы с окрашенными преципитатами вырезают, как описано. Окраску элюируют 3 мл 0,2 M Naацетатного буфера, рН 5,0, содержащего

0 1 g, ДДС Na, в течение 1 ч при 50 С. После замеров оптической плотности при 565 нм подбирают образец с известным содержанием антигена, оптическая плотность которого наиболее близка оптической плотности анализируемого образца. Далее из соотношения этих оптических плотностей определяют концентрацию ржавчинных антигенов в анализируемом образце и проводят пересчет на 1 г сырого веса.

В каждом образце грибные антигены определялись параллельно и методом ракетного электрофореза по Лоуреллу.

В табл. 1 представлены результаты сравнения определения грибных антигенов в листьях пшеницы методом ракетного алектрофореза и количественного электроосмофореза.

Как видно из табл.1, при определении грибного белка методом ракетного электро5 иммунофореза по Лореллу с использованием поливалентной сыворотки, реагирующей с множественными антигенами гриба, получаются резко (в 3-4 раза) заниженные результаты по сравнению с теми, которые дает

10 предлагаемый способ, предусматривающий фотометрирование красителя, связанного комплексом антиген вЂ” антитело.

Пример 2. К экстракту здоровых листьев пшеницы добавляют определенный

15 объем гомогената из уредоспор стеблевой ржавчины с известным содержанием белка и проводят определение антигена в экстракте методом количественного электрофореза.

Результаты определения приведены в

20 табл.2, Как видно из табл,2, предлагаемый способ отличается хорошей чувствительностью и точностью в достаточно широком диапазоне концентрации, 25

Формула изобретения

Способ иммуноэлектроосмофореза, включающий иммунопреципитацию с по30 мощью встречного иммуноэлектрофореза, окраску образующихся преципитатов, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью количественного определения антигена, после завершения иммуноэлектроосмофореза

35 вырезают участки геля с окрашенным преципитатом, элюируют их 0,1/-ным раствором додецилсульфата натрия. в 0,1 M ацетатном буфере рН 5,0 с последующим фотометрированием элюата.

1714511

Таблица 2

Составитель И. Баш каев

Редактор О.Юрковецкая Текред М.Моргентал . Корректор О.Кундрик

Заказ 689 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Изобретение относится к иммунологическим методам исследования и может быть использовано для выявления активации В-системы иммунитета

Способ диагностики болезни вильсона-коновалова // 1247014

Способ определения m.leprae у больных с регрессом заболевания // 2137137

Изобретение относится к медицине, в частности, может быть использовано в качестве одного из критериев выявления излеченности больных лепрой

Способ диагностики лепры // 2171689

Изобретение относится к медицине, а именно к лепрологии, и может быть использовано для диагностики лепры

Способ прогнозирования перехода облигатного предрака в ранний рак гортани у мужчин // 2260807

Изобретение относится к области клинической лабораторной диагностики и может быть использовано для прогнозирования перехода облигатного предрака в ранний рак гортани у мужчин

Способ количественного определения фетального гемоглобина человека // 2310204

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике

Способ диагностики хронической скрытой хламидийной инфекции в центральной нервной системе // 2361217

Изобретение относится к области медицины, а именно к инфектологии, и касается способа диагностики хронической скрытой хламидийной инфекции в центральной нервной системе (ЦНС)

Способ определения кардиотоксических осложнений у больных хроническим лимфолейкозом // 2450791

Изобретение относится к медицине, онкологии и гематологии и может быть использовано для определения кардиотоксических осложнений у больных хроническим лимфолейкозом, получающих полихимиотерапию

Молекулярно-генетический способ определения чувствительности опухоли у пациентов с раком легкого к терапии гефитинибом // 2454464

Изобретение относится к области медицины, в частности к молекулярной онкологии, и может быть использовано для молекулярно-генетической диагностики чувствительности опухоли у пациентов с раком легкого на терапию гефитинибом

Способ определения степени тяжести тканевой гипоксии при хронических диффузных заболеваниях печени // 2463611

Изобретение относится к области медицины и касается способа определения степени тяжести тканевой гипоксии при хронических диффузных заболеваниях печени (ХДЗП)

Способ прогнозирования течения воспалительного процесса // 1781609

Способ ускоренного линейного иммуноэлектрофореза для дифференцирования буркхольдерий // 2496112

Изобретение относится к медицине, лабораторной диагностике и касается способа ускоренного линейного иммуноэлектрофореза (ЛИЭФ) для дифференцирования буркхольдерий. Способ включает получение антигенного препарата, линейный иммуноэлектрофорез антигенов исследуемых микроорганизмов и последующий учет результатов, причем для быстрого выявления патогенных возбудителей сапа и мелиоидоза с использованием сывороток иммунных кроличьих или козьих, с титром антител в РИД не ниже 1:16, полученных иммунизацией ВСЭ из ацетон-высушенных клеток штаммов В. pseudomallei 100 или В. mallei 10230, предварительно обработанных ультразвуком 2 раза в течение 2 мин при 50 Гц с охлаждением, содержащих антитела к специфическому высокомолекулярному антигенному комплексу с м.м. не ниже 336 kDa, линейный электрофорез проводят в следующей постановке: пластинку фирмы «GelBond», размером 8,5×10 см, заливают 10 мл 1% раствора агарозы фирмы «Calbiochem», приготовленного на трис-вероналовом буфере, содержащем 0,1 г лактата кальция и 0,7 г азида натрия в 1 л буфера, рН 8,6, разведенном в 5 раз (этот же буфер используется в электродных отсеках), на расстоянии 1 см от края пластинки с анодной стороны вырезают полосу геля шириной 4-5 см, гель растапливают, охлаждают до 48°С, добавляют к нему 5-10 об.% сыворотки, содержащей антитела к исследуемым антигенам, и снова заливают на пластинку, между гелем с сывороткой и исследуемыми пробами антигенов оставляют контактную полоску геля шириной 1-2 мм, после застывания геля с сывороткой на границе с контактной полосой располагают прямоугольные гель-образцы с антигенами, подлежащими исследованию, гель-образцы готовят так же, как сыворотку, внося в охлажденный гель 5-10 об.% исследуемых антигенов, к краям геля прикладывают мостики из 5 слоев фильтровальной бумаги, смоченные электродным буфером, электрофорез проводят при напряженности электрического поля - 4-5 В/см в течение 3-5 ч при комнатной температуре, после остановки электрофореза пластинки просматривают, наличие линий преципитата на границе гель-образца и геля с сыворотками иммунными кроличьими или козьими, содержащими антитела к искомому антигенному комплексу, при данных условиях ЛИЭФ свидетельствует о присутствии антигенов патогенных В. pseudomallei и В. mallei, отрицательный результат указывает на отсутствие антигенов патогенных микроорганизмов, что позволяет дифференцировать возбудители сапа и мелиоидоза от непатогенных близкородственных буркхольдерий. Способ обладает простотой и быстротой исполнения, наглядностью, возможностью определения общих и специфических антигенов буркхольдерий, отбора иммунных сывороток, содержащих антитела к соответствующим антигенам, возможностью количественной оценки результатов при отсутствии потребности в сложном оборудовании. Данный способ может применяться как дополнительный аналитический метод выявления антигенов патогенных буркхольдерий. 5 ил., 4 пр.