Способ определения углеводородокисляющей активности микроорганизмов

 

Изобретение относится к защите материалов от биоповреждений и может быть использовано при определении концентрации микроорганизмов и их водорастворимых метаболитов для оценки активности углеводородокисляющих микроскопических грибов и бактерий. Целью изобретения является повышение точности определения активности углеводородокисляющих микроорганизмов . Способ заключается в инкубировании суспензии бактерий или спор исследуемого микромицета в двухфазной среде, например жидкий углеводород - водно-минеральная среда, в углеводородную фазу которой предварительно вводят радиоактивный изотоп - тритий, при 25-30 или 30-37°С в течение 10-15 или 1-3 сут для микромицетов или бактерий соответственно , после чего проводят отделение биомассы и водной фазы. 3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ KOMI4TET . ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4766487/13 (22) 07.12.89 (46) 07.03,92. Бюл. № 9 (72) Л. К.Михайлова, Т. В. Коронелли, В.Б,Скрибачилин, М.Н.Семененко и

Е.А.Лаптева (53) 665.66(088.8) (56) Патент CtjjA ¹ 2914447, кл. 195-103.5, 1959;

Авторское свидетельство СССР № 646763, кл. С 12 0 1/16, 1979. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ (57) Изобретение относится к защите материалов от биоповреждений и может быть использовано при определении концентраИзобретение относится к защите материалов от биоповреждений и может быть использовано при определении концентрации углеводородокисляющих бактерий и микромицетов и их водорастворимых метаболитов для оценки активности углеводородокисляющих микроскопических грибов и бактерий, Особенностью усвоения мицелиальными грибами и бактериями жидких углеводородов нефти является обязательное наличие двухфазной среды: жидкий углеводород — водно-минеральный раствор, в которой при развитии микромицетов и бактерий происходит образование биомассы на границе фаз„— накопление продуктов метаболизма.

Известен способ определения концентрации микроорганизмов, заключающийся в . том, что пробу микроорганизмов инокулируют в лактозный бульон, содержащий С -за14

„„. Ж „„1717629 А1 (я)5 С 12 N 1/20, С 12 Q 1/16 ции микроорганизмов и их водорастворимых метаболитов для оценки активности углеводородокисляющих микроскопических грибов и бактерий. Целью изобретения является повышение точности определения активности углеводородокисля ющих микроорганизмов. Способ заключается в инкубировании суспензии бактерий или спор исследуемого микромицета в двухфазной среде, например жидкий углеводород — водно-минеральная среда, в углеводородную фазу которой предварительно вводят радиоактивный изотоп — тритий, при 25 — 30 или

30 — 37 С в течение 10 — 15 или 1 — 3 сут для микромицетов или бактерий соответственно, после чего проводят отделение биомассы и водной фазы, 3 табл. мещенную лактозу, и подвергают инкубированию в течение определенного времени при 37 С, Концентрацию микроорганизмов оценивают по количеству выделяющегося радиоактивного С Ог, 14

Недостатками способа являются неизбежное искажение результатов. исследования, сопряженное с потерей С 02 в

14 процессе его улавливания, с влиянием банальной микрофлоры, а также невозможность определения их активности.

Наиболее близким к предлагаемому способу по технической сущности является способ определения концентрации микроорганизмов, заключающийся в измерении радиоактивности нативных и термоанактивированных микроорганизмов, причем инками" рование нативной пробы с радиоактивным изотопом проводят при 2 — 8 С в течение 18—

24 ч, а инактивированной — при той же температуре не менее 2 ч. В качестве

1717629 радиоактивного изотопа используют P в

32 виде двухзамещенного фосфорно-кислого натрия. С помощью калибровочной кривой по уровню активности Р, который включается в клетки при ассимиляции, находят концентрацию живых микроорганизмов. flo концентрации микроорганизмов можно судить об активности их развития.

Недостатком известного способа является ограниченная возможность его практического применения, а также недостаточная точность определения активности.

Например, в ряде случаев возникает необходимость определения наряду с концентрацией микроорганизмов их водорастворимые метаболиты. Так, при протекании микробиологических процессов в топливных емкостях в системах техники в засорении топливных агрегатов существенную роль играет биомасса, а в процессе повреждения материалов топливных систем — водорастворимые продукты метаболизма (органические кислоты, аминокислоты и т.п.). Поэтому для достоверной оценки мик. робиологического засорения топливных емкостей и систем техники в случае выделения из них бактерий и микромицетов требуется определить углеводородокисляющую активность выделенных микроорганизмов. Углеводородокисляющая активность оценивается по количеству биомассы либо еодорастворимых метаболитов, образую. щихся при развитии бактерий и микромицетое в углеводород — водно-.минеральной среде. Однако известный способ не позволяет учитывать кроме концентрации микроорганизмов (биомассы, ассимилирующей изотоп Р ) другие продукты жизнедеятельности микроорганизмов.

Целью изобретения является повышение точности определения.

Способ заключается в культивировании суспензии бактерий или спор исследуемого микромицета в двухфазной. среде: жидкий углеводород-водно-минеральная среда, в углеводородную фазу которой предварительно введен радиоактивный изотоп — тритий(Нз) при 25-30 С или 30-37 С втечение

10-15 или 1-3 сут для бактерий и микромицетов соответственно, после чего проводят отделение биомассы (клеток микромицета или бактерий) и водной фазы. Возможность осуществления способа обусловлена применением радиоактивного изотопа трития, введенного в концевую группу н-октадека. на, который живые клетки гриба поглощает и окисляет его в стеариновую кислоту. Едимственный протон в карбоксильной группе (Нз) является подвижным и обменивается с f0

15 еоримые метаболиты. Указанное обстояT8llbcTBo расширяет возможности способа

20 орган измов

55 внешней средой (водно-минеральным раствором);

СНз(С Ни)16СН* - СНз(СН2)16

CDOH - СНз(СНг)иСОО

Таким образом, использование в качестве радиоактивного изотопа трития, введенного е углеводородную фазу, позволяет по его накоплению в биомассе и в водной фазе учитывать и определять наряду с концентрацией углеводородокисляющих микромицетов или бактерий и их водорастподготовки проб живых микроорганизмов и повышает объективность определения активности углеводородокисляющих микроОпределение активности углеводородокисляющих микроорганизмов заключается в измерении радиоактивности биомассы (клеток) микроорганизмов и водной фазы, содержащей еодорастворимые метаболиты, образовавшихся при культивировании исследуемых штаммое бактерий или микромицетов е двухфазной среде жидкий углеводород — водно-минеральный раствор, в углеводородную фазу которой предварительно введен н-октадекан, меченный по концевой группе Н, при благоприятных для развития микроорганизмов температурах (30 — 37оС для бактерий, 25 — 30 С вЂ” для микромицетое} в течение 1 — 3 (бактерии) или

10 — 15 сут (микромицеты) и сравнении полученных значений с величиной радиоактивности биомассы и водной фазы, образовавшихся при культивировании в аналогичных условиях известных активных штаммое углеводородокисляющих микроорганизмов, Время инкубироеания микромицетов определяется логарифмической фазой роста, е которой наиболее интенсивно протекают процессы образования биомассы и накопления продуктов жизнедеятельности и которая при развитии микромицетов в углеводород-водно-минеральной среде составляет 10-15 сут, а для бактерий — 1-3 сут. Температура 25-30 и

30-37ОС выбрана как наиболее благоприятная для развития углеводородокисляющих микромицетов и бактерий соответственно.

В табл. 1 приведены данные по накоплению радиоактивного изотопа в водной фазе и биомассе штаммов микроорганизмов, выделенных из топлив при их развитии в углеводород-водно-минеральной среде, в

1717629

Контрольные варианты необходимы для учета явлений гашения сцинтилляции, возникающих в связи с окраской биомассы и минерального раствора, а также обработанной биомассы солюбилизэтором.

Инкубирование приготовленных смесей проводят при 25 — 30 С в течение

10-15 сут без принудительного встряхивания.

Для получения средней (из трех повторностей) пробы биомассы объединяют и одновременно обрабатывают биомассы, выросшие в трех разных пробирках одного варианта. Выросшие на границе раздела фаз топливо-инеральный раствор биомассы микромицетов (в виде пленки) микологическим крючком переносят в чистую сухую пробирку и промывают на холоду охлажденным до 4 С додеканом последовательно 4-5 раз, причем каждый раз новой порцией (1 мл) додекэна. Охлаждение необходимо для предотвращения процессов окисления н-октадекана и потери радиоактивной метки при промывании биомассы.

Биомассу, отмытую от сорбированного на ее поверхности углеводорода, гомогенизируют в механическом диспергаторе в 2 мл солюбилизатора (солюбилизатор Т-1 фирмы

Cinsser Analytic, GMBH).

В сцинтилляционные флаконы, содержащие по 5 мл сцинтилляционной жидкости (ЖС-109; раствор 5 г 2,5-дифенилоксазола и

0,2 г и-бис-(2-(5-фенилоксазоил))-бензола в 1 л сцинтилляционного толуолэ) вводят пробы минерального раствора (100 мкл) из каждой пробирки в отдельный флакон и средние пробы биомассы в растворе солюбилизатора (500 мкл).

Измерения радиоактивности препаратов проводят на жидкостном сцинтилляционном счетчике радиоактивных излучений, например Mark-ll (Голландия).

По полученным результатам производят перерасчет радиоактивности препаратовв каждой . фракции (биомассы, минерального .раствора) с учетом отобранного для анализа объема пробы и общего количества фракции. углеводородную фазу которой предварительно введен н-октадекан-Н . Для получез ния объективных результатов для исследования выбраны штаммы, образующие при росте в углеводород-водно-мине- 5 ральной среде различную биомассу. В биомассе штэммов с условными номерами

1, 8 и 15 обнаружено практически одинаковое количество радиоактивного индикатора. В то же время штамм С.reslnae-15 10 накапливает в водной фазе значительно большее количество радиоактивного индикатора по сравнению со штаммами 1 и 8. В наибольшей степени способность образовывать водорастворимые продукты жизне- 15 деятельности выявлена у штамма

С.гез пае-16. Наименьшее количество радиоактивного индикатора установлено как в биомассе, так и в водной фазе штамма 1701, В биомассе штаммов Acrernonium ИИепзе и 20

Chrysosporium sp. обнаружено приблизительно одинаковое количество радиоактивного изотопа, в то время как в водной фазе .

A,kilieuse содержание изотопа в 5 раз выше, чем в водной фазе Chrysosporium sp. При 25 культивировании штаммов Peniclllium.

jenseni u Pseudomonas sp. основное количество радиоактивного изотопа накапливается в водной фазе, а при культивировании

Mycobacterium sp. — в биомассе. 30

Таким образом показано, что перераспределение радиоактивного индикатора происходит в зависимости от углеводородокисляющей способности штамма с учетом его способности образовывать как биомас- 35 су, так и водорастворимые продукты жизнедеятельности, в том числе органические кислоты. Это позволяет проводить измерение радиоактивности непосредственно в биомассе (клетках), а также в водной и угле- 40 водородной фазах после инкубировэния микромицетов с меченым соединением.

Как видно из табл. 1, из пяти штаммов

С.resinae штамм 16 является наиболее активным, так как для него установлено наи- 45 большее накопление радиоактивного изотопа в биомассе и водной фазе. Для сравнения в табл, 1 приведены данные по количеству сухой биомассы, образуемой.ис- следуемыми штаммами, исходя из которых 50 наиболее активным считают штамм

С.resinae-1. Использование способа позво-. ,. ляет учесть наряду с образующейся биомассой накопление водорастворимых продуктов метаболизма, что повышает обь- 55 ективность определения активности углеводородокисляющих микромицетов, Пример 1, В каждую из 12 пробирок (по 3 пробирки на каждый вариант) наливают по 3 мл водного минерального раствора, имеющего следующий состав, Д: азотнокислый калий 0 2: сернокислый магний 0.04; фосфорнокислый однозэмещенный калий

0,03; фосфорнокислый двузамещенный натрий 0,07; рН раствора 7. Затем вносят по

0,3 мл суспензии спор гриба исследуемого штамма и штамма сравнения-с концентрацией 10 спор/мл и добавляют по 0,5 мл б н-додекана с введенным в него н-октэдеканом, меченым по концевой группе тритием (удельная активность 2,45 мКи/мл).

1717629 радиоактивности клеток и водной фазы, показала большую активность штамма сравнения (табл. 3).

Способ позволяет достоверно определить активность углеводородокисляющих микроорганизмов, что имеет большое практическое значение при выборе штаммов для оценки биостойкости топлив, в том числе вновь разрабатываемых, Объективная оценка микробиологической устойчивости нефтяных дистиллятных топлив позволит избежать отказы и неисправности топливной системы техники, вызванные биологическим повреждениям топлив.

Таблица 1

Количество н-октадекана-Н, мкЯ

Количество биомассы, определенное весовым методом, мг

Штамм

В водной фазе

В биомассе и водной азе

В биомассе

Ciadosporiumreslnae-1

С. reslnae-8

С. гез пае-15

С. res danae-16

С. resinae-1701

Acremonlumhitieuse

Chrysosporium sp

Реп(с!Шца jeuseni

Aspergilius versicolor

Preudomonas зр.

М cobacterium s .

0,0084

0,0082

0,0081

0,0060

0,0036

0,0184

0,0178

0,0066

0,0022

0,0031

0,0045

0,0380

0.0355

0,0442

0,0522

0,0075

0,0503

0,0102

0,0436

0,0098

0,0128

0,0012

0,0464

0,0437

0.523

0,0582

0,0111

0,0687

0,0280

0.0502

0,0120

0,0159

0,0057

64

61

62

47

28

128

121

52

18

П р и и е ч а н и е: Количество н-октадекана-Н в исходном топливе 1,4038 мкМ. з

Доверительный интервал с 95 %-ной вероятностью составляет

+ 11%.

Оценка активности исследуемого микромицета, произведенная в сравнении с активностью известного штамма, показала большую активность исследуемого штамма (табл. 2).

Пример 2. В приготовленную по примеру 1 среду (углеводород — водно-минеральный раствор) вносят по 0,3 мл суспензии клеток бактерий исследуемого штамма и штамма сравнения с концентрацией 10 клеток/мл (по стандарту мутности). Инкубирование приготовленных смесей проводят при 30-37 С в течение 1 — 3 сут при перемешивании (120 об/мин).

После инкубации с изотопом клетки исследуемого и сравниваемого штаммов бактерий отделяют от водной фазы, а затем трехкратно отмывают охлажденным до 4 С додеканом с последующим сливом супернатанта и ресуспензированием осадка (клеток) в 2 мл солюбилизатора, Б сцинтилляционные флаконы, содержащие по 5 MR сцинтилляционной жидкости, вводят пробы водной фазы (200 мкл) из каждой пробирки в отдельный флакон и сред:: е пробы клеток бактерий в растворе солюэилизатора (500 мкл).

Измерение и расчет радиоактивности препаратов проводят по примеру 1.

Оценка активности исследуемого штамма бактерий, произведенная в сравнении с активностью известного штамма по сумме

Формула изобретения

Способ определения углеводородокисляющей активности микроорганизмов, предусматривающий культивирование микроорганизмов на питательной среде в оптимальных условиях с радиоактивным изотопом с последующим его определением в биомассе, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения, культивирование проводят в двухфазной среде, состоящей из жидкого углеводорода и водно-минерального раствора, содержащей в качестве жидкого углеводорода н-октадекан, меченный по концевой группе тритием, и дополнительно проводят определение радиоактивного изотопа в водной среде.

1717629

Таблица 2

fl ри меч э ни е. Доверительный интервал с вероятностью 95 составляет +11 $

Таблица 3

П римеча ние.Доверительный интервал с вероятностью 95О составляет +.11

Составитель И.болотина

Техред М.Моргентал Корректор О.Кундрик

Редактор И.Дербак

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 853 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Раушская наб.. 4/5