Способ выделения витамина в @
Изобретение относится к микробиологии , биохимии и физхимии, в частности к способу выделения витамина 812 из клеток пропионовокислых бактерий. Цель изобретения - увеличение выхода витамина и упрощение способа. Способ выделения витамина 812 включает культивирование пропионовокислых бактерий, отделение культуральной жидкости, обработку биомассы для разрушения клеток, экстракцию фенол-хлороформенной смесью и получение готового продукта, при этом перед экстрагированием клетки обрабатывают 0,5-3%-ным раствором анионного детергента додецилсульфата натрия в щелочной среде при рН 9-10 в течение 30 мин. Обработку биомассы осуществляют путем замораживания клеток при температуре (-4)-(-12°С)и выдержки в течение 1 ч с последующим оттаиванием. 1 з.п. ф-лы, 3 табл.
союз советских
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4699525/13 (22) 05.06.89 (46) 07.03.92. Бюл. № 9 (71) Львовский государственный университет им. Ив.Франко (72) С.А. Елисеев, Н.М. Дацюк, О.И, Подопригора и Т.В. Выговская (53) 668.394(088.8) (56) Патент BHP ¹167245, кл. С 07 D 55/62, 1976.
Патент США ¹ 4383110, кл. С 07 Н 15/12, 1984.
Канопкайте С. Кобаламины — Вильнюс:
Макслас, 1978, с. 65-66. (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА
В 12 (57) Изобретение относится к микробиологии, биохимии и физхимии, в частности к
Изобретение относится к микробиологии, биохимии и физхимии, в частности к способу выделения витамина В 12 из клеток пропионовокислых бактерий — промышленных продуцентов витамина В12.
Известны способы получения витамина
В12, заключающиеся: e ..фотохимическом преобразовании кофермента В12 или оксикобаламина и их алкильных производных в витамин В12; в аэробной ферментации артробактерий с последующим выделением из биомассы в результате гидролиза и фенольно-хлороформенной экстракции витамина
В12; в выделении и очистке витамина В12 на ионообменной смоле, содержащей сополи- . мердивинилбензола и стирала; в кислотном гидролизе бактериальной массы с последу„„. Ж„„1717634 À1 (я)5 С 12 P 19/42, С 07 Н 23/00 способу выделения витамина В12 из клеток пропионовокислых бактерий. Цель изобретения — увеличение выхода витамина и упрощение способа. Способ выделения витамина В12 включает культивирование пропионовокислых бактерий, отделение культуральной жидкости, обработку биомассы для разрушения клеток, экстракцию фенол-хлороформенной смесью и получение готового продукта, при этом перед экстрагированием клетки обрабатывают
0,5-3;4-ным раствором анионного детергента додецилсульфата натрия в щелочной среде при рН 9 — 10 в течение 30 мин. Обработку биомассы осуществляют путем замораживания клеток при температуре (-4) — (-12 С) и выдержки в течение 1 ч с последующим оттаиванием. 1 з.п. ф-лы, 3 табл. ющим выделением витамина В 12 в.результате фенольно-хлороформенной экстракции, Недостатки приведенных способов выделения витамина ВГ2 заключаются в дороговизне оборудования и реактивов, применяемых для очистки, дороговизне многокомпонентных питательных сред для выращивания микроорганизмов, необходимости энергетических затрат для проведения гидролиза.
Наиболее близким по технической сущности является способ выделения витамина
В12 из биологического материала. заключающийся в том. что клетки микроорганизмов. содержащие кобаламины,отделяют от культуральной жидкости путем центрифугирования, заливают 5 — 6 объемами воды и в
1717634 течение 5 — 10 мин автоклавируют при рН
4-5 в присутствии 4 мг KCN. После центрифугирования супернатант подщелачиваютдо рН 8-9, к немудобавляют4 мг KCN и выдерживают в темноте в течение 1 ч для перевода кобаламина в дициамидную форму. Их извлекают путем многократной экстракции небольшими порциями фенол-хлороформенной смеси (1;1). Из смеси кобаламины переводят в воду при добавлении 1.5 объема хлороформа и 0,75 объема н-бутанола. Следы хлороформа и бутанола удаляют посредством обработки содержи-. мого этиловым эфиром. Концентрацию кобаламинов в водном растворе определяют спектрофотометрически.
Недостатком известного способа является громоздкость, длительность самого технологического процесса выделения витамина В12, требующего использования дополнительного оборудования и затрат электроэнергии (эвтоклавирование), многократность экстракции, ведущая к продолжительному процессу получения продукта.
Кроме того, недостатком способа является низк и выход витамина 8>z в связи с тем, что зкстракция фенол-хлороформенной смесью не ведет к полному извлечению витамина Bfz. Невысокий выход витамина l31z получается в результате количественных его потерь при термической денэтурации.
Цель изобретения — увеличение выхода витамина и упрощение способа.
Поставленная цель достигается тем, что согласно способу, включающему культивирование пропионовокислых бактерий, отделение культуральной жидкости от биомассы, обработку биомассы для разрушения клеток, экстрэкцию фенол-хлороформенной смесью и получение готового продукта, перед экстрагированием разрушенные клетки обрабатывают 0,5-3%-ным раствором анионного детергента додецилсульфата натрия в щелочной среде при рН
9-10 на протяжении 0 5 ч.
Кроме того, разрушение клеток осуществляется путем замораживания их при температуре (-4)-(-12)ОС и выдержкой в течение 1 ч с последующим оттаиванием.
Предлагаемый способ отличается от известного совокупностью признаков: обработка 0,5 — 3- -ным раствором анионного детергента додецилсульфата натрия при рН
9-10 в течение 0,5 ч; для разрушения клеток используют процесс замораживания при температуре(-4)-(-12)ОC и выдержку в тече-. ние 1 ч с последующим оттаиванием, Широкое применение в микробиологических экспериментах, связанных с извле5
50 чением и солюбилизэцией гидрофобных и встроенных в структуру бактериальных клеток белков, тейхоевых кислот, липидов и липополисахаридов нашли детергенты. В основе солюбилизирующего действия детергентов лежит их амфифильная природа, позволяющая им взаимодействовать и с гидрофобными и гидрофильными участками белков, либо других соединений, обладающих амфипатическими свойствами. В ряде случаев поверхностно-активные вещества выступают в качестве специфических экстрэгирующих реагентов.
Известно, что обработка детергентэми вызывает диспергирование клеточных стенок, нарушение целостности наружных слоев клетки, увеличение проницаемости, раэрыхление и обезвоживание клеточной стенки вплоть до полного или частичного растворения и выхода внутриклеточного содержимого в среду. Но ни один из используемых детергентов не образует комплексного соединения с кобаламином, Однако неизвестно, что именно DDCNa . вызывает специфическую солюбилизацию витамина В12 из клеток бактерий, Итак, предложено испольэовать в качестве детергента додецилсульфэт натрия, вызывая специфическую солюбилизацию витамина В12 из клеток бактерий.
В основе обнаруженного явления может лежать специфичность взаимодействия отрицательно заря>кеного неорганического фрагмента молекулы детергента с положительно заряженным атомом кобальта в молекуле витамина В 2, что не исключает и других вероятных механизмов. Пропионовокислые бактерии синтезируют кроме витамина Вп такие соединения, как флавины, менахиноны, цитохромы, порфирины и т.д.
Однако после обработки клеток 00ойа в щелочной среде. из бактерии выходит витамин 812. а не какое-либо иэ перечисленных соединений. Даже в специальной литературе, посвященной способам разрушения бактерий, нет сведений о применении DDCNa для дезинтеграции клеток при щелочных рН. как наиболее эффективном методическом подходе.
П ри щелоч н ых значениях рН (9 или 10) изменяется поверхностный заряд клеток бактерий, что позволяет алкильным частям молекул DDCNa взаимодействовать с гидрофобными участками клеточных стенок бактерий и приводит к их дезинтеграции.
В результате взаимодействия щелочного раствора ООСКа с суспензией бактериальных клеток при перемешивании окончательное значение величины рН становится нейтральным., что в свою оче1717634
55 редь обуславливает стабильность выхода витамина B >z. П ри взаимодействии сил ьно щелочных детергентов с витамином В 12 образуется соединение кобаламиновой природы, снижающее рН до нейтрального, которое в дальнейшем не приводит к разрушению витамина В12. Существующие способы выделения витамина Ви проводятся в средах с слабокислым и нейтральным значением рН, что приводит к неполному извлечению витамина В 12 из клеток и низкому его выходу.
Снижение рН раствора до 9,0 либо увеличение свыше 10,0 снижает выход витамина Biz из клеток за счет физико-химических изменений, происходящих с молекулами детергента. Более низкий выход витамина В12 наблюдается и при снижении концентрации
DDCNa менее 0,5 или увеличении ее свыше 3 за счет снижения числа мицелл детергента, способных специфически взаимодействовать с молекулами кобаламино в.
Выбор рН и концентрации детергента подтверждаются данными, приведенными в табл. 1.
Замораживание — n роцесс известный, но в предлагаемом способе он ускоряет разрушение клеток. В этих температурных границах (-4) — (-12) С происходит кристаллизация свободной воды в клетке. Ослабевают межмолекулярные связи в клеточной стенке. облегчается доступ ODCNa к внутреннему содержимому клетки, а именно к веществам кобэламиновой природы.
Обработка 0,5-3 -ным раствором
DDCNa, который взаимодействует с кобаламинами. ведет к образованию соединений, легко экстрагируемых органическими растворителями. Такое соединение с доугими детергентами неионной (тритон X-100, 114, 305, твин 20, 40, 60. 65, 80), катионной (катамин АВ, цетилтриметиламмонийбромид, цетилтриметилпиридинийхлорид), анионный (холат и дезоксихолат натрия) природы, обладающих общеизвестным свойством— дезинтегрировать микроорганизмы, только
DDCNa оказался способным специфически извлекать витамин 812 из бактериальных клеток (табл. 1).
Пример 1. Культуру пропионовокислых бактерий (штамм Propionibacterium
shermanii МУ-512) выращивают нэ синтетической среде. На 3-е сутки культивирования вносят 5,6-ди метил бе нзамидозол (5,5ДМБ), На 5-е сутки культивирования клетки отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при 5000 об/мин, затем промывают физраствором и зэмораживают при -4ОС в течение 1 ч. К 3 г замороженных клеток добавляют 8 мл 0,5 ного раствора
DDCNa при рН 10,0 и перемешивают на магнитной мешалке в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего центрифугируют при 8000 об/мин 15 мин. Осадок промывают 2 мл 0,5 -ного раствора DDCNa при рН 10,0, центрифугируют в том же режиме, а супернатанты сливают. В супернатант добавляют 2 мг KCN, встряхивают и выдерживают в темноте 20 мин. Витамин В1г извлекают путем многократной экстракции небольшими порциями фенол-хлороформенной смеси (1:1). Из смеси витамин переводят в воду при добавлении 1,5 объема хлороформа и 0,75 объема н-бутанола. Следы хлороформа и бутанола удаляют посредством обработки содержимого этиловым эфиром. Концентрацию витамина B Параллельно проводят выделение витамина Ва по известному способу с тем же количеством бактериальных клеток. Содержание витамина B z в экстрактах из клеток пропионовокислых бактерий: по известному способу — 480 + 0,2 мкг/г сухого веса клеток; предлагаемым способом 760 0,1 мкг/г сухого веса клеток. Выход витамина B>z при выделении предлагаемым способом выше на 57-58 . Пример 2, Выращивание пропионо.вокислых бактерий, отделение клеток,промывание физраствором и замораживание их проводят по примеру 1. К 3 г замороженных клеток добавляют 8 мл 3 -ного 00CNa при рН 9,0 с последующим перемешиванием на магнитной мешалке в течение 30 мин при комнатной температуре, затем центрифугируют при 8000 об/мин 15 мин. Осадок . промывают 3 -ным раствором DOCNa npu рН 9,0, центрифугируют, добавляют 2 мг KCN, встряхивают, выдерживают в темноте 30 мин. Витамин В12 извлекают путем многократной экстракции небольшими порциями фенол-хлороформенной смеси (1:1), затем операции проводят по примеру 1. Выход витамина 110 по сравнению с известным способом. Пример 3. Выращивание пропионовокислых бактерий, отделение клеток, промывание физраствором и замораживание их проводят по примеру 1, К 3 г замороженных клеток добавляют.8 мл 4 -ного DDCNa при рН 11,0 с последующим перемешиванием на магнитной мешалке в течение 30 мин при комнатной температуре, затем центрифугируют при 8000 об/мин 15 мин. Осадок промывают 4 -ным DDCNa при рН 11, цен1717634 трифугируют, добавляют 2 мг,Д KCN, встряхивают в темноте 30 мин. Затем операции проводят по примеру 1, Выход витамина В1г составляет 37,5О по сравнению с известным способом. . Пример 4. Выращивание пропионовокислых бактерий, отделение клеток, промывание физраствором и замораживание их проводят по примеру 1. К 3 r замороженных клеток добавляют 8 мл 0,3%-ного 00СКа при рН 7,0 с последующим перемешиванием на магнитной мешалке в течение 30 мин при комнатной температуре, затем центрифугируют при 8000 об/мин 15 мин. Осадок промывают 0,3 $-ным раствором DDCNa при рН 7,0, добавляют 2 мг 4 KCN, встряхивают и выдерживают в темноте 30 мин, Затем операции проводят по примеру 1. Выход витамина 64,6% по сравнению с известным способом. Пример 5, Выращивание пропионовокислых бактерий, отделение клеток, промывание физраствором и замораживание проводят по примеру 1. К 3 г замороженных клеток добавляют 8 мл 0,50",. .-ного тритона X-100 при рН 10,0 и пере лешивают на магнитной мешалке в течение 30 мин при комнатной температуре, затем центрифугируют, добавляют 2 мг% КСК, встряхивают, выдерживают в темноте 30 мин. Затем операции проводят по примеру 1, Выход витамина В1г не наби юдают. Пример б. Выращивание пропионово к исл ы х бактерий, отделение клеток, промывание физраствором и замораживание проводят по примеру 1. К 3 г замороженных клеток добавляют 8 мл 0,5%-ного цетилтриметиламмонийбромида (ЦТАБ) при рН 10,0 и перемешивают на магнитной мешалке в течение 30 мин при комнатной температуре, затем центрифуги руют при 8000 об/мин 15 мин. Осадок промывают 0,5%-ным ЦТАБ при рН 10,0, центрифугируют, добавляют 2 мг% KCN, встряхивают, выдерживают в комнате 30 мин, Затем операции проводят по примеру 1, Выход витамина В г не наблюдают. Пример 7. Вырашивание пропионовокислых бактерий, отделение клеток, промывание физраствором и замораживание проводят по примеру t. К 3 r замороженных клеток добавляют 8 мл 0,5о -ного холата натрия при рН 20,0 и перемешивают на магнитной мешалке в течение 30 мин при комнатной температуре, затем центрифугируют при 8000 об/мин l5 мин. Осадок промывают 0,5%-ным холатом натрия при рН 10,0. центрифугируют, добавляют 2 мг;, KCN, встряхивают, выдерживают в 50 темноте 30 мин. Затем операции проводят по примеру 1. Выход витамина В1г не наблюдают. Для сравнения данные, полученные под влиянием рН и концентрации DDCNa на выход витамина В1г из клеток Propionibacterlum freudenrelchii sobs. shermanil, сведены в табл. 1. Бо всех приведенных примерах используют известную синтетическую среду состава. г/л: (Й н 4)23 04 6 КгНР04 7 KHZP04 3 NaCI 0,5 МЯЯ04 7НгО 0,1 Глюкоза 40 Цитрат Na 0,5 СоСЬ 2НгО 5мгg, РеС!з 6HzO 1мг% Растворы витаминов и микроэлементов По 1 мл/л Дистиллированная вода До 1,0 л. Данные о специфической солюбилизирующей активности DDCNa характерны не только для мутантного штамма МУ-512, отличающегося высоким уровнем кобаламиногенеза, но и других штаммов (МУ-3, исходного природного штамма Познанского); табл, 2, Конкретные значения концентрации 00СКа и величины рН обусловлены физикохимическим состоянием самого вещества, так как его солюбилизационные свойства обнаруживаются только при определенных значениях концентрации и рН. В табл. 3 приведена зависимость содержания витамина Вп от типа детергента (все детергенты используются в концентрации 0,5 Д при рН 10,0). Как видно из приведенных в табл. 3 данных, предлагаемый способ выделения витамина 81г существенно отличается от известных и обладает явными преимуществами; отсутствие процесса гидролиза сокращает время получения витамина. а отсутствие нагрева уменьшает затраты энергии. Формула изобретения 1, Способ выделения витамина Ви, включающий культивирование пропионовокислых бактерий, отделение культуральной жидкости, обработку биомассы для разрушения клеток, экстракцию фенол-хлороформенной смесью и получение готового продукта, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода витамина и упро1717634 Таблица 1 Таблица 2 Таблица 3 щения способа, перед зкстрагированием клетки обрабатывают 0,5 — 3 -ным раствором анионного детергента додецилсульфата натрия в щелочной среде при рН 9-10 в течение 30 мин. 5 2. Способ по и. 1, отличающийся тем, что обработку биомассы осуществляют путем замораживания клеток при температуре (-4)+12) С и выдерживания в течение 1 ч с последующим оттаиванием.
