Способ получения штамма sтrертососсus sanguis, способного секретировать @ -1,3-глюкан-3-глюканогидролазу

 

Изобретение относится к биотехнологии и фармакологии и касается способов получения препаратов для стоматологии. Разработан способ получения штамма Streptococcus sanguis, продуцирующего а- 1,3-глюкан-З-глюканогидролазу, заключающийся в том, что из ДНК Bacillus circulans BC-8/Ferm ВР-733 выделяют EcoRI-EcoRI фрагмент размером 3 т.п.о., клонируют его в плазмиду pYEIOOL затем в векторах pGB301, pMN2, pMN1, pMN3. Полученными плазмидами, содержащими ген ог-1,3-глюкан-3-глюканогидролазы, трансформируют клетки Streptococcus sanguis.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)з С 12 М 15/55

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

1 (2 1) 4027298/13 (22) 20.03.86 (31) 60-57443 (32) 20.03.85, (33) JP (46) 15.03.92. Бюл. N- 10 (71) Аизо Мацусиро (J Р) (72) Аизо Мацусиро (J Р) (53) 575.224.2:577.2 (048) (088.8) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ШТАММА

STREPT0C0CCUS SANGUtS, СПОСОБНОГО СЕКРЕТИРОВАТЬ а-1,З-ГЛЮКАН-ÇГЛ ЮКАНОГИДРОЛАЗУ

Изобретение относится к биотехнологии и фармакологии и касается способов получения препаратов для стоматологии, Разработан способ получения штамма

Streptococcus sanguls, экспрессирующего а -1,3-глюкан-3-глюканогидролазу, заключающийся в том, что из ДНК Вас!Поз

clrculans BC-8/1-Ferrn ВР-733 выделяют

EcoRl-Есой! фрагмент размером 3 т.п.о., клонируют его в плазмиду рТ Е1001, затем в векторах pGB301, pMN2, pMN1, pMN3. Полученными плазмидами, содержащими ген а-1,3-глюкан-3-глюканогидролазы, трансформируют клетки Streptococcus sanguls.

Пример 1. В.пробу почвы, содержа щую выветрившийся гранит, смешанный с торфом, и имеющую рН приблизительно 6, добавляют стерилизованную и забуферированную фосфатом (рН 7) минимальную среду. содержащую 0,1 мас.% (ИНф$04,0,005 мас.%

М98О4 ° 7Hz0, 0,0005 мас.% РеС!2 ° 6НзО и

О,ОЗ мас.g нерастворимого глюкана, пол»5U „„1720493 А3 (57) Изобретение относится к биотехнологии и фармакологии и касается способов получения препаратов для стоматологии.

Разработан способ получения штамма

Streptococcus sanguis, продуцирующего а1,3-глюкан-З-глюканогидролаэу, заключающийся в там, что иэ ДНК Bacillus circulans

ВС-8/Ferm ВР-733 выделяют EcoRI-EcoRI фрагмент размером 3 т,п.о., клонируют его в плаэмиду pYEI001, затем в векторах

pGB301, pMN2, pMN1, рМЙЗ. Полученными плаэмидами, содержащими ген а-1,3-глюкан-Ç-глюканогидролазы, трансформируют клетки Streptococcus sanguls. ученного из кариогенного штамма бактерий

Streptococcus агапэ ОМ Z 176, который является источником углерода. Пробы почвы инкубируют в среде в течение трех дней при 28 С.

Семейство бактерий, культивированных в этой среде, подвергают субкультивированию двенадцать раэ и затем концентрируют. Получают плоские агары, содержащие 1,2 мас.% агара, в который до- О бавляют 0,2% .нерастворимого глюкана и ь» минимальную среду. На пластинки прививают концентрированную культуру бактерий и культивируют до образования колоний. Через несколько дней, в течение которых осуществляют инкубирование при 30 С, бактерии, экспрессирующие активность глюканазы и разрушающие нерастворимый глюкан, идентифицируют при помощи образования прозрачных гало вокруг колоний.

Четыре колонии, которые образовывают наиболее заметное гало, депонированы

I 720493 в техническом исследовательском институте микробиологической промышленности, Япония, под номерами I=ERM ВР;733 и

FERM BP-995.

Пример 2. Для определения активно- 5 сти фермента глюканазы суспензию нерастворимого глюкана (пример 1) размельчают обработкой ультразвуком и используют в качестве субстрата. Культуру Baciilus

clrculans БС-8 (далее БС-8) инкубируют в 10 соевом бульоне триптиказы при 30 С. Экспрессию фермента глюканазы инициируют добавлением нерастворимого глюкана.

Пробы верхнего слоя, содержащие фермент, получают центрифугированием и 10- 15 кратной концентрацией культуральной среды. Либо верхний слой обрабатывают

75; сульфатом аммония с тем, чтобы осуществить осаждение фермента, За единицу активности фермента принимают такое ко- 20 личество, которое продуцирует0,1 мМ глюкозы в течение 16 ч при 37 С из субстрата нерастворимого глюкана.

Пример 3, Культуры бактерий БС-8 инкубируют в 500 мл соевого бульона трип- 25 тиказы, содержащем 0,3 нерастворимого глюкана, в течение трех дней при 30 С. Верхний слой культуры, полученный центрифугированием, обрабатывают 75 g,-ным раствором сульфата аммония с тем, чтобы 30 фермент перешел в осадок. Полученный осадок растворяют в 50 мМ буферного раствора фосфата (рН 7,0) и наносят на колонку из целлюлозы ДЕ-52. Фракции собирают элюированием 50 мМ раствором фосфатно- 35 го буфера (рН 7) при увеличении концентрации NaCI от 0 до 0,5 М, Фракцию, имеющую пик активности, подвергают хроматографии на колонке Сефадекс 1 — 150, В результате электрофореза в геле обнаруживают две по- 40 лосы, одна в 68 килодальтон(к Д) идругая в

54 кД (молекулярные массы), Протеин в 68 кД идентифицирован как а-1,3-глюканаза, в то время как протеин в 54 кД идентифицирован как имеющий активность а-1,б-глю- 45 каназы.

Протеин с молекулярной массой 68 кД, подвергают очистке при помощи процедуры, описанной выше, и применяют к глюкану, химические связи которого типа а-1,6 50 предварительно разрушают в результате обработки йодной кислотой или производимой промышленностью декстраназой, имеющей только Q-1,3 химические связи.

Протеин с молекулярной массой 68 кД раз- 55 рушает а -1,3 связи и дает восстановительные сахара. Фермент с молекулярной массой 54 кД обладает активностью Глюканазы, характерной для а-1,6 связи,и является, таким образом, а-1,6-глюкан-б.глюканогидролазой.

Несмотря на то, что химические связи нерастворимого глюкана принадлежат главным образом а-1,3 семейству и что а-1,3«люканаза играет главную роль в ферментной деградации нерастворимого глюкана, установлено, что комбинация а1,3-глюканазы и а-1,6-глюканазы дает синергетический эффект при деградации нерастворимых глюканов. Поэтому, чтобы удалить нерастворимый глюкан, предпочтительно клонирование обоих генов как а1,3-глюканазы, так и а-1,6-глюканазы, и связывание их в одной плазмиде.

Пример 4. Бактерии БС-8 культивируют в соевом бульоне триптиказы и ДНК экстрагируют, ДНК центрифугируют в градиенте плотности CSCI — EtBr. При этом присутствие ДНК плазмиды не выявлено.

Далее единственную полосу хромосомной

ДНК изолируют и подвергают очистке. ДНК диализуют и расщепляют эндонуклеазой

EcoRI.

Одновременно культуру Е.coll ХБ 101, содержащую производимую промышленностью плазмиду PYEI001, культивируют в

300 мл L-бульона (содержащего 10 г пепто- . на, 5 г экстракта дрожжей, 1 г глюкозы, 5 г

Na CI и 1000 мл kzO) с р Н на уровне 7,2. ДН К плазмиды PYEI001 затем экстрагируют и обрабатывают ферментом EcoRI.

; Один мг ДНК вЂ” фрагмента EcoRI БС-8 и один мг ДНК плазмиды PYEI001 лигируют лигазой Т4, ДНК рекомбинантной плазмиды трансформируют в штамм ХБ 101 E. сон К12, Пример 5. Известно, что встраивание

ДНК-фрагмента в сайт EcoRI гена устойчивости к хлорамфениколу (Cm") плаэмиды р1 EI001 делает бактерии чувствительными к хлорамфениколу.

Среди колоний культуры Е.coll, которые были трансформированы рекомбинантной плазмидной PYE 1001, отбирают клоны, обладающие Cm-чувствительностью, которые далее идентифицируют на наличие гена а-1,3 глюканазы с правильной ориента: цией.

Так как бактерия ХБ 101 требует для роста треонин, лейцин и пролин, Cm-чувствительные (Cm ) колинии Е.соИ культивируют

1 на синтетической минимальной среде, содержащей небольшое количество казаминокислот и 0,2 $ размельченного ультразвуком нерастворимого глюкана в качестве единственного источника углерода. Несмотря на то, что не получено ни одного гало и предполагают, что трансформированные бактерии не

1720493 способны секретировать а-1,3-глюканазу, некоторые из колоний дают рост, это указывает на то, что они экспрессируют продукт гена а-1,3-глюканазы и, таким образом. приобретают способность разрушать и ассимилировать нерастворимый глюкан в качестве источника углерода.

Те трансформированные культуры, которые дают рост на минимальной среде, культивируют и их ДНК экстрагируют, расщепляют эндонуклеазой ЕсоЮ, при помощи гелевого электрофореза получают ДНКфрагмент размером 3,0 т.п.о.

Культуры Е.coll ХБ 101 ° бактерии Х6

101, трансформированные плазмидой

Р т Е!001и бактерии ХБ 101, трансформированные плазмидой PYEI001, включающей вставку фрагмента ДНК в 3,0 т.п,о., культивируют. Верхний слой, полученный при центрифугировании лизированных клеток из трех типов культур, анализируют на активность глюканазы в соответствии с процедурой из примера 2. В результате установлено, что только бактерии, трансформированные плазмидой PYEI001, содержащей фрагмент в 3,0 т.по., проявляют активность глюканазы. Таким образом, это доказывает правильность вставки гена а1.3-глюканазы бактерии БС-8 в плазмиду

PYEI001E,coll. Кроме того, только клетки ХБ

101, трансформированные плазмидой

PYEI001, включающей вставку в 3,0 т.п.о., способны выжить в канаминокислотах и нерастворимом глюкане.

ll р и м е р 6. Штамм (М СТС7868) бактерии Streptococcus sanguis Challis, кото.рый содержится во флоре ротовой полости, трансформируют геном, кодирующим экспрессию а-1,3-глюканазы. Среди различных бактерий S.sanguls u Streptococcus

saIIvarIus являются наиболее безвредными, в частности штамм (М СТС7868)

Streptococcus запдв!з Challis является хорошим материалом для генетиков, трансформацию которого они относительно хорошо понимают. Плазмиду pGB301 используют в качестве вектора трансформации, ДНК плазмиды р68301, которая содержится в цитоплазме штамма S.sanguis

Challis, содержит два маркера устойчивости к лекарственным препаратам, Em" (к эритромицину) и Се" (к хлорамфениколу) с единственным сайтом Bst Е II внутри гена Cm .

ДНК плазмиды р68301 гидролизуют ферментом сечения Bst Е II, а концы затупляют при помощи ДНК-полимеразы I.

В то же самое время плазмиду PYEI001 содержащую фрагмент в 3.0 т.п,о., кодирующий экспрессию гена а-1,3-глюканазы, обрабатывают эндонуклеазой ECDRI и концы фрагмента в 3,0 т,п.о. превращают в тупые

ДНК вЂ” полимеразой I. ДНК-фрагмент плазмиды pGB301 и ДНК-фрагмент гена а-1,35 глюканазы лигируют с использованием 100 ед. лигазы Т4 с целью восстановления плазмиды.

Штамм S.sanguis Challis трансформируют лигазной смесью, культивируют на пло10 ских агарах вытяжки ядра головного мозга (В.НЛ), содержащей эритромицин (50 мг/мл). Каждую из этих колоний переносят на плоский агар В.Н.I., содержащий хлорамфеникол (10 мг/мл) с тем, чтобы

15 установить наличие Cm (чувствительных к хлорамфениколу) колоний.

Даже для тех штаммов S. sanguls Challis, которые обладают чувствительностью к хлорамфениколу, фенотипная экспрессия

20 вставленного гена а-1,3-глюканазы отмечена только в одной трети трансформированных колоний. Это вызвано тем, что фрагмент гена может быть вставлен с двумя различными ориентациями. Экспрессию

25 генного продукта анализируют при помощи переноса колоний Cm -бактерий на плоские агары с В.НЛ., содержащие нерастворимый глюкан. Ввиду того, что S.sanguls является грамположительной бактерией, возможно

30. она будет секретировать любую а -1,3-глюканазу, которую она синтезирует. Экспрессию и секретирование глюканазы определяют наличием гало на пластинках с агаром. Таким образом, ген а-1,3-глюкана35 зы правильно введен в клетки S.sanguis бактерии, которая в общем случае присутствует в ротовой полости, и фенотипная экспрессия этого гена может быть осуществлена в этом хозяине.

40 Пример 7, Плазмида pGB301 имеет два стабильных маркера устойчивости к эритромицину и хлорамфениколу и имеет несколько ограничений для ее эффективного применения. Число копий плазмиды

45 pGB301 в клетке S,sanguis примерно равно десяти. Как результат небольшого числа копий весьма неэффективно культивировать небольшие количества $.запди1з, содержащие плазмиду pGB301, и выполнять про50 стые анализы размера плазмиды или выращивать большие количества трансформированных S.sangu!s и получать ДНК плазмиды.

Для устранения этих ограничений плаз55 миды р68301. и рИС9 рассекают по сайтам

Sma I, что позволяет получить линейные молекулы, имеющие тупые концы с обеих сторон. ДНК-фрагменты лигируют и трансформируют в штамм IM 103 Е.coli (Pl).

1720493

Колонии, которые. идентифицируют как содержащие маркер (ас и имеющие плазмиды размером 12 т.п.о., отбирают, а плазмиду обозначают рМ М 1.

Эту плазмиду используют в качестве вектора — переносчика для трансформации культуры $.sanguls в соответствии с описанием, приведенным выше, наделяя трансформированную культуру стойкостью к ампициллину, а также стойкостью к хлорамфениколу и эритромицину.

Ге н а -1,3- глюканазы должен быть вставлен в правильном направлении относительно синтетического промотора, который предшествует участку от В к A. В этой конфигурации можно ожидать энергичную экспрессию и получить большое количество синтезированной а-1,3- глюканазы. Так как ни один из таких штаммов не был изолирован, то сигнальный пептид генного продукта а-1,3-глюканазы бактерии БС-8 не был отсечен сигнальной пептидазой E.coÈ. Кроме того; если продуцирование а -1,3-глюканазы при регулировании мощным синтетическим промотором является черезмерным, бактерия-хозяин, накапливающая а -1,3глюканазу в клетке, погибает.

В тех случаях, когда ген а-1,3-глюканазы вставлен в обратном направлении, т.е. от А к В, имеет место транскрипция гена а -1,3-глюканазы бактерии БС-8 под действием регулярного промотора. Такая. транскрипция снижается до весьма низкого уровня за счет сильного конкурирующего эффекта транскрипции, которая регулируется синтетическим промотором. Этот факт также подтверждается экспериментом, в котором ген а-1,3-глюканазы вставляют при неиндуктивных условиях в направлении вниз от сильных промоторов таких, как йромотор триптофан (Ptrp) vw промотор лактоsa(Plac) культуры Е,coll. В этих случаях были получены продукты генов, вставленных как в правильном, так и обратном направлениях. Гены, вставленные в правильном направлении, дают значительно более энергичное продуцирование а-1,3-глюканазы. . Таким образом, чтобы эффективно продуцировать глюканазу, часть сигнального пептида секреции должна быть модифицирована таким образом, чтобы сигнальный пептид можно было легко удалить от фермента глюканаэы, а ген а-1,3-глюканазы должен быть вставлен в "правильном" направлении вниз от сильного промотора, Пример 8. Р-Лактамаэа. — продукт гена устойчивости к ампициллину(Агп ), подвергается эффективной экспрессии в культуре E.coll, а также в культуре

S.sanguIs, рМЙ1 гидролизуют эндонуклеазой BstEI, а полученные концы превращают в тупые. Одновременно, плазмиду PYEI001 гидролизуют эндонуклеазой EcoRI с тем, 5 чтобы удалить фрагмент гена глюканаэы в

3,0 т.п.о., а затем полученные концы превращают в тупые. Этот фрагмент затем лигиру, ют фрагментом pMN1.

Фрагмент гена, содержащий промотор

10 и сигнальный пептид секреции Р-лактамазы, отсекают от плазмиды pGH54 и вставляют в сайт Nurl внутри ДНК, кодирующей ген а-1,3-глюканазы íà pMN1, в которую был вставлен этот ген.

15 Как было установлено, сайт Nurl находится в области гена глюканазы, кодирующего амино-конец полипептида фермента.

Для завершения этой конструкции используют синтетический линкер, служащий для

20 соединения ДНК, кодирующей сигнальный пептид Р-лактамазы на фрагменте pGH54, с остатком гена глюканазы (от 3 до сайта

Nurl) и снова получают ДНК (от 5 до сайта

Nurl), кодирующую амина-конец этого фер25 мента.

Пример 9. Фрагмент гена, содержащий промотор и сигнальный пептид секреции для стрептокиназы, клонируют в

Streptococcus equlclmllls и определяют его

30 основную последовательность. Эта генетическая последовательность кодирует секрецию стрептокиназы клетками S. equiclmllls, а также Е,coll. Плазмиду рММЗ получают в результате синтеза ДНК-последовательно35 сти, соответствующей промотору и сигнальному пептиду этого фермента гена глюканазы на участке от 5 до сайта Nurl, и лигирования синтезированной ДНК-последовательности в сайте Nurl в плазмиде

40 pHN1, которую предварительно обрабатывают с тем, чтобы включить ген, кодирующий протеин а -1,3-глюканазы.

Культуры штамма IIVI103 Е.coll u

S.sanguis могут быть трансформированы в

45 соответствии с процедурами, описанными в ше, при помощи плазмид pMN2 и pMNÇ.

Трансформированные клетки будут содержать значительное количество а -1,3-.глюканазы и клетки S. san guis будут

50 секретировать фермент.

Таким образом устанавливается феиотипная экспрессия гена а-1,3-глюканазы в культуре S.sanguis, Вставка гена глюканазы в правильном направлении относительно

55 промотора и замена сигнального пептида пептидом, который функционирует в клетках S.sanguls, являются важными свойствами для экспрессии и секретирования больших количеств а -1,3-глюканаэы.

1720493

Составитель T. Забойкина

Редактор Т. Лазоренко Техред М.Моргентал Корректор M. Максимишинец

Заказ 779 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5.

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

К бактериям, отличным от S.sanguls, которые являются естественными по отношению к ротовой полости и могут быть использованы в соответствии с изобретением, относятся другие виды Streptococcus, например Streptococcus sallvarlus, Можно ввести ген в эти бактерии при помощи процедур, аналогичных описанным для трансформации S.sanguls.

Препарации, предотвращающие кариес зубов, содержат бактерию, "аборигенную" относительно ротовой полости. Ген а-1,3глюканазы и ген. а -1,6-глюканаэы или тот и другой продуцируют ферменты, которые разрушают нерастворимый глюкан, вырабатываемый кариогенными бактериями, который служит причиной кариеса зубов. 8 соответствии с этим предмет изобретения может быть установлен на зубах при помощи какого-либо средства таким образом, чтобы экспрессия и секреция ферментов глюканазы путем непрерывного воздействия разрушала нерастворимый глюкан, синтезированный кариогенными бактериями в рОТОВОА полости, 5

Формула изобретения

Способ получения штамма

Streptococcus sanguIs, способного секретировать а-1.3-глюкан-3-глюканогидролазу, 10 заключающийся в том, что осуществляют выделение Е.coRI фрагмента ДНК ВасИ!оз

circulans ВС-8/РЕЯМ BP-733 размером 3,0 кв, клонирование выделяемого фрагмента

ДНК в плазмиду PYEI001, конструирование

15 вектора, содержащего ген а-1,3-глюкан-3глюканогидролазы, субклонирование ДНК фрагмента, клонированного в PYEI001 в вектор р68301 или pMN1, или pMN2, или

pMN3 с последующей трансформацией пол20 ученной рекомбинантной ДНК бактерий

Streptococcu s .anguls.