Способ культивирования клеток животных в полимерных гранулах

 

Изобретение относится к биотехнологии , в частности к культивированию иммобилизованных в полимерных гранулах клеток животных. Цель изобретения - повышение количества жизнеспособных клеток и упрощение способа. Способ заключается в смешивании суспензии клеток животных с 2.5-5,0%-ным раствором полимера класса N-виниламидов с мол.м. 125000-1000000, в которой дополнительно введен стабилизатор дисперсии в концентрации 1-2%, введении этой смеси в гидрофильную фазу для получения гранул полимера с иммобилизованными клетками с последующим инкубированием их в питательной среде. Причем, в качестве стабилизатора дисперсии используют овальбумин, яичный порошок или Span-40, а в качестве гидрофильной фазы - питательную среду для культивирования этих клеток с температурой 29-40°С. 1 з.п.флы, 1 табл. fe

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 N 11/08

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4765821/13 (22) 23.10.89 (46) 23.03.92. Бюл. N. 11 (71) Институт биоорганической химии им.

M.М. Шемякова и Институт тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова (72) Е.А. Марквичева, И.Ф. Кузькина, Т.Н.

Плечко, С.M. Амбросова, Ю.Э. Кирш, Т.М.

Карапутадзе, М.А. Завальный, Г.А, Симакова, И.А. Грицкова, В.П. Зубов, С.И. Туркин и

Н.Н. Стерлигова (53) 577,15(088.8) (56) ЕР 0126919, кл. С 12 N 11/04, А 61 К

9/50, С 12 N 5/00, опублик,1983.

Проспект фирмы "ВеИсо", 1988. (54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК

ЖИВОТНЫХ В ПОЛИМЕРНЫХ ГРАНУЛАХ. (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к культивированию иммоИзобретение относится к биотехнологии, в частности к культивированию иммобилизованных в полимерных гранулах клеток, и может быть использовано для получения физиологически активных веществ, . продуцируемых клетками, в особенности моноклональных антител, продуцируемых гибридомами.

Известен способ культивирования кле-. ток в гранулах на основе альбумина, который заключается в том, что 5 -25 -ный раствор альбумина смешивают с суспен. зией клеток в среде до конечной концентрации клеток 10 — 10 кл/мл, диспергируют

3 полученную смесь s масло для создания дискретных белковых частиц, добавляют

0,01%-ный раствор сшивающего агента (себацилхлорида, адипйлхлорида), после сшивки образовавшихся гранул отмывают

„„ЯЦ „„1721088 А1 билизованных в полимерны гранулах клеток животных. Цель изобретения — повышение количества жизнеспособных клеток и упрощение способа, Способ заключается в смешивании суспензии клеток животных с

2,.5-5.0 -ным раствором полимера класса

N-виниламидов с мол.м. 125000-1000000, в которой дополнительно введен стабилизатор дисперсии в концентрации 1-2, введении. этой смеси в гидрофильную фазу для получения гранул полимера с иммобилизованными клетками с последующим инкубированием их в питательной среде. Причем, в качестве стабилизатора дисперсии используют овальбумин, яичный порошок или

Span-40, а в качестве гидрофильной фазы— питательную среду для культивирования этих клеток с температурой 29 — 40 С. 1 з.п.флы, 1 табл. гранулы с иммобилизованными в них клетками от сшивающего агента, а затем от масла углеводородными растворителями. доводят рН среды до 7,0, помещают гранулы в среду для культивирования и инкубируют при 37 C.

Недостатками этого способа являются многостадийность, связанная с необходимостью проведения многократных отмывок (от. сшивающего агента, от масла, от органического растворителя), что приводит к нарушению целостности клеток, снижение количества жизнеспособных клеток из-за проведения процесса получения гранул с иммобилизованными в них клетками при неоптимальных для клеток условиях (рН) и использования токсичных углеводородных растворителей.

1721088

Известен способ культивирования клеток в гранулах из.альгината кальция, который заключается в том, что 1,2-1,6%-ный водный раствор альгината натрия смешивают.c суспенэией клеток в среде (до конечной концентрации клеток 10 -10 в зависимости з от конкретной культуры клеток), полученную смесь выдавливают по каплям в 1 52 -ный раствор осадителя (СаО2) для получения фазового разделения и образования гранул, далее проводят несколько раз промывку образовавшихся гранул с иммобилизованными в них клетками средой для культивирования, после чего помещают гранулы в среду и инкубируют при 37ОC.

Недостатками известного способа куль-. тивирования являются многостадийность процесса, обусловленная необходимостью многократных отмывок оТ ионов кальция перед инкубированием гранул с иммобилизованными клетками в среде, а также использование ограниченного набора сред и буферных растворов для культивирования иммобилизованных в гранулах клеток. Кроме того, способ невозможно реализовать в средах, содержащих фосфат- и цитратионы, которые связываются с ионами Са2, однако часто такие среды и буферы являются оптимальными для жизнедеятельности клеток. В известном способе происходит разрушение альгинатных гранул в аппаратах с перемешиванием, а также снижение количества жизнеспособных клеток, иммобилиэованных в гранулы вследствие низкой прочности гранул, обусловленной диффузией ионов Са в среду.

Целью изобретения является увеличение количества жизнеспособных клеток и упрощение способа.

Предлагаемый способ основан на том, что суспензию клеток смешивают с 2,55,0 -ным водным раствором полимера класса N-виниламидов с мол.м, от 125000 до

1000000, содержащим 1 — 2% стабилизатора дисперсии, полученную суспензию клеток диспергируют непосредственно в среду для культивирования при 29 — 40 Сс целью образования полимерных гранул с иммобилизованными клетками . и инкубируют полученные с иммобилизованными клетками гранулы в среде.

Согласно изобретению в качестве стабилизатора дисперсии используют овальбумин, яичный порошок, Span-40 в виде растворов. которые добавляют к раствору полимера, В качестве полимера для получения гранул иммобилизованными клетками используют полимеры иэ класса N-виниламидов, в частности поли-N-винилкапролактам (ПВК), сополимеры метилакрилата, 10

55 метилметакрилата, винилацетата с ПВК и

N-виниламидами следующего строения:

-СН -(H—

И-С

) К, Ry где, если RI — СНз, или СгНь, или СзНт, тогда

Яг — СзН7, или С2Н5, или СНз соответственно, В литературе отсутствуют данные об использовании каких-либо полимеров класса

М-виниламидов для получения иммобилизованных клеток.

Для иммобилизации используют клетки перевиваемой линии СНО(яичник китайского хомячка) либо гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела против мозаики резухи.

Клетки, освобожденные из гранул, окрашивают трипановым синим и подсчитывают их количество в камере Горяева, Индекс пролиферации (коэффициент прироста количества клеток) рассчитывают по отношению концентрации клеток, полученных на

6-е сутки инкубирования, к их посевной концентрации.

Пример 1. 15 мл 8%-ного раствора поли-N-винилкапролактама с мол.м. 900000 стерилиэуют автоклавированием, получают белый осадок полимера, декантируют воду и заменяют ее на среду для культивирования, либо стерильный фосфатный буфер(рН

7,0). После снижения температуры до комнатной получают раствор полимера; к которому добавляют 15 мл стерильного 2%-ного раствора овальбумина в 0,9%-ном NaCI. К полученному водному раствору полимера, содержащему стабилизатор дисперсии (конечная концентрация полимера 4%, а стабилизатора 1 ), добавляют 10 мл суспензии клеток 3В4 (гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к вирусу мозаики резухи) в среде ДМЕМ ("Gibco"), содержащей 10% фетальной сыворотки теленка.

Полученную смесь (конечная концентрация клеток 5,10 кл/мл добавляют по каплям к

100 мл среды ДМЕМ при перемешивании и температуре среды 38 С, Полученные полимерные гранулы с иммобилиэованными в них клетками инкубируют в течение 6 дней в спиннерах (общий объем 250 мл, рабочий объем 100 мл) при 37 С при перемешивании со скоростью 120 об/мин. На 3-и сутки куль- . тивирования заменяют среду на 80%. По окончании процесса. среду декантируют, а гранулы выдерживают при комнатной температуре в течение 20 — 30 мин для их полного растворения. Коэффициент прироста количества клеток (индекс пролиферации) 1721088

10

30

45

55 определяют как описано. Данные по культивированию приводятся в табл..1.

П р и м.е р 2. Смесь для получения гранул с иммобилизованными клетками готовят по примеру 1, но при этом используют

15 мл 10%-ного раствора сополимера полиN-винилкапролактэмэ с винилацетатом (содержание винилацетата 20 мас. ) с мол,м.

125000 и 15 мл 3%-ного раствора яичного порошка. Полимерные гранулы получают в среде, подогретой до 29 С. Все дальнейшие операции йроводят кэк в примере 1.

Пример 3. Готовят смесь суспензии клеток перевиваемой линии СНО (яичник китайского хомячка) с раствором полимера и стабилизатора дисперсии по примеру 1.

При этом используют 15 мл 8%-ного раствора ПВК (мол,м. 400000) и 15 мл 4%-ного раствора яичного порошка. Полимерные гранулы получают, как описано в примере 1, но при температуре среды 40 С.

Пример 4, Смесь для получения полимерных гранул с иммобилизованными клетками ЗВ4 готовят по примеру 1, но при: этом используют 15 мл 5%-ного раствора сополимера ПВК с метилметакрилатом (содержание метилметакрилата 15 мас,%) с мол,м. 500000 и 15 мл 2 -ного раствора яичного порошка; Гранулы получают при температуре среды 32 С. Все дальнейшие операции делают как в примере 1.

Пример 5. Смесь для получения гранул с иммобилизованными в них клетками 3В4 готовят по примеру 1, но при этом используют 15 мл 8%-ного раствора сополимера N-атил-Й-виниламида масляной кислоты с метилметэкрилатом (содер>кание метиламетакрилата составляет 15 мас. ) с мол.м. 300000 и 15 мл 4%-ного раствора

Span-40. Гранулы получают при 40 С, далее асе делают как в примере 1.

Пример 6. Смесь для получения гранул готовят по примеру 1, но при этом используют

15 мл 10%-ного раствора сополимера N-метилN-виниламидэ масляной кислоты с метилметакрилатом (содержание метилметакрилата составляет 15 мас.%) с мол.м. 250000 и 15 мл

3 -ного раствора Span-40. Гранулы получают при 40 С.

Пример 7. Смесь для получения гранул готовят по примеру 1, но при этом используют 15 мл 10 -ного раствора сополимера N-атил-N-виниламида пропионовой кислоты с метилакрилатом (содержание метилакрилата 15 мас. ) с мол.м. 300000 и 15 мл 3 -ного раствора овальбумина. Гранулы получают при 40 С, а все дальнейшие операции проводят как в примере 1.

Пример 8. Смесв для получения гранул с иммобилизованными клетками готовят по примеру 1, но при этом используют

15 мл 5%-ного раствора ПВК с мол.м, 1000000 и 15 мл 4 -ного раствора яичного порошка. Гранулы получают при 38 С, а далее все делают по примеру 1.

Пример 9 (по известному способу).

Готовят 30 мл стерильного 2 -ного раствора альгината натрия (фирма "ВеПсо") в 0,9 -ном растворе NaO. К полученному раствору полимера добавляют 10 мл суспензии клеток ЗВ4 в среде ДМЕМ, содержащей 10 фетальной сыворотки теленка (конечная концентрация клеток 5,10 кл/мл). Полученную смесь добавляют по каплям в 100 мл 1,6%-ного раствора

CaCIz. Полученные гранулы из альгината кальция с иммобилизованными в них клетками 4 раза отмывают средой, затем декантируют среду, а полимерные гранулы помещают в 100 мл среды ДМЕМ и инкубируют в спиннере при 37 С по примеру 1.

По окончании процесса среду декантируют, добавляют 20 мл стерильного 50 мМ раствора цитрата натрия для разрушения капсул. Освобожденные из гранул клетки окрашивают трипановым синим и подсчитывают их количество в камере Горяева.

Все результаты по культивированию клеток в полимерных гранулах, полученных по примерам 1 — 9, приведены в таблице, Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет упростить способ культивирования клеток в полимерных гранулах, увеличить количество жизнеспособных клеток, выросших в них на 10,7 — 16,6%. а также расширить ассортимент сред, которые могут использоваться при таком способе культивирования.

Формула изобретения

1,Способ культивирования клеток животных в полимерных гранулах, предусматриаающий смешивание суспензии клеток с водным раствором полимера, введение этой смеси в гидрофильную фазу для получения гранул полимера с иммобилизованными клетками и инкубацию их в питательной среде, отличающийся тем, что, с целью повышения количества жизнеспособных клеток и упрощения способа, в качестве водного раствора полимера используют 2,55,0 -ный pañòâîð полимера класса

N-виниламидов с мол.м, 125000 — 1000000, в который дополнительно вводят стабилизатор дисперсии в концентрации 1-2%, а гидрофильной фазы — питательную, среду для культивирования этих клеток с температурой 29 — 40 С, 2,Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве стабилизатора дисперсии используют овальбумин, яичный порошок или Span-40.

1721088

Составитель H.Ñòåðëèãîâà

Техред М.Моргентал Корректор Л.Патай

Редактор И;Дербак

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 928 Тираж Подписное . ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5