Способ одновременного количественного определения витамина а и каротиноидов

 

Изобретение относится к химическим методам определения и может быть испольювано при определении содержания витамина А и каротиноидов в масляных концентратах, витаминных премиксах, биологическом материале, в химических, фармацевтических , сельскохозяйственных и прочих биологических исследованиях, а также при контроле производства витамина А. Целью изобретения является упрощение и сокращение длительности процесса. Способ включает щелочной гидролиз пробы, экстракцию определяемых веществ органическим растворителем, обработку экстракта минеральной кислотой и спектрофотометрический анализ, при этом в качестве органического растворителя используют этилэцетат, а из минеральных кислот используют тетрафторборную кислоту в количестве , обеспечивающем ее содержание в смеси с экстрактом 1,0-2,7%, при этом обработку экстракта проводят в течение 2-5 мин. 1 ил., 8 табл.

COIO3 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ,„;!

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4716674/13 (22) 10.07.89 (46) 30,03.92 Бюл. М 12 (71) Украинский научно-исследовательский институт птицеводства (72) А,Д.Рошаль, П.Ф.Сурай, И.А.Ионов, М, И, Коршунова и А, Г. Мухленов (53) 637.4 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

N - 590664, кл. G 01 Й 31/08, 1978. . J Vitaminology, 1961, 7., N 2, р 150 — 162. (54) СПОСОБ ОДНОВРЕМЕННОГО КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА А И КАРОТИНОИДОВ (57) Изобретение относится к химическим методам определения и может быть испольовано при определении содержания витамина А и каротиноидов в масляных

Изобретение относится к химическим методам определения и может быть использовано при определении содержания витамина А и каротиноидов .в масляных концентратах. витаминных премиксах, био: логическом материале в химических, фармацевтических, .сельскохозяйственных и прочих биологических исследованиях, а также при контроле производства витамина А.

Известен способ определения витамина А, включающий омыление материала спиртовым раствором щелочи, экстракцию неомыляемой фракции органическим растворителем и проведения цветной реакции с фосфорно-молибденовой кислотой, Недостатками дан ного способа я вля ются низкая точность и высокая погрешность

„„ЯЯ„„1723518 А1 (st>s G 01 N 31/18 концентратах, витаминных премиксах, биологическом материале, в химических, фар-. мацевтических, сельскохозяйственных и прочих биологических исследованиях, а также при контроле производства витамина А.

Целью изобретения является упрощение и сокращение длительности процесса. Способ включает щелочной гидролиз пробы, эк- стракцию определяемых веществ органическим растворителем, обработку экстракта минеральной кислотой и спектрофотометрический анализ, при этом в качестве органического растворителя используют этилацетат, а из минеральных кислот используют тетрафторборную кислоту в количестве, обеспечивающем ее содержание в смеси с экстрактом 1,0 — 2,77, при этом обработку экстракта проводят в течение 2 — 5 мин. 1 ил„8 табл. определений, так как фосфорно-молибденовая кислота дает цветную реакцию с большим числом различных соединений, т.е. является неспецифическим реагентом, что приводит к существенному завышению результатов. Кроме того, серьезные затруднения представляет сама фосфорно-молибденовая кислота.вследствие ее низкой стабил ьности.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эффекту является способ определения витамина А и каротиноидов, включающий омыление материала спиртовым раствором щелочи в течение 90 мин, экстракцию неомыляемой фракции бензолом, выдерживание экстрагирующей смеси в течение 15 мин для разде1723518 ления водного и бензольного слоев, промы вку бен зол ь ного слоя водой для удаления щелочи, разделение полученного экстракта витамина А и каротиноидов на две равные части, В первой спектрофотометрически определяют каротиноиды, используя в качестве раствора сравнения чистый бензол (длина волны 460 нм). Во вторую часть экстракта добавляют 5 мл спиртового раствора соляной кислоты, встряхивают и помещают в темное место, Через 15 мин кислоту нейтрализуют эквивалентным количеством щелочи, бензольный слой промывают. водой и центрифугируют для осветления. Полученный раствор спектрофотометрируют при

390 нм; в качестве раствора сравнения используют раствор, в котором ранее определяли каротиноиды.

Недостатки прототипа заключаются в следующем.

Используемый экстрагент- бензол дает устойчивые эмульсии с водными растворами щелочей, которые дополнительно стабилизируются присутствием этанола и поверхностно-активных веществ, выделившихся в процессе омыления из анализируемых образцов. При отстаивании системы гидролизат — экстрагент даже спустя 30 мйн после зкстрагирования разделение фаз происходит не полностью. При отделении бензольного слоя от водного часть бензола с растворенными веществами теряется вместе с водой.

Аналогичный процесс, хотя и в меньшей степени, наблюдается при отмывке бензольного экстракта водой для удаления примесей щелочи.

Образование водно-бензольных эмульсий приводит к понижению точности анализа, занижению полученных результатов.

Деление экстракта на две части вносит дополнительную операцию в ход анализа, еще больше понижает точность определений и увеличивает их продолжительность.

Для перевода витамина А в аналитическую форму (дегидровитамин А) часть бензольного экстракта заливают спиртовым раствором кислоты, спустя 15 мин смесь нейтрализуют и опять промывают. Перевод витамина А в дегидроформу проводится в . двухфазной системе бензол-вода что неэффективно (скорость дегидратации в гетерогенной среде ниже). Кроме того, в процессе промывки снова образуется эмульсия, при этом теряется часть дегидроформы витамина А.

После промывки раствор остается мутным. Для его осветления приходится использовать дополнительную операцию— центрифугирование, что удлиняет анализ. мулятивного действия

20 носительно чистого этилацетата, затем в . кювету микропипеткой добавляют 1,0-2,7 Д

45 Этилацетатный экстракт промывают 23 раза дистиллированной водой, затем в мерную пробирку переносят полученный раствор и доводят этилацетатом обьем до 15 мл. Удаление остатков воды проводят встря25

В процессе анализа приходится рабо-. тать длительное время с бензолом-ядом куЦель изобретения — упрощение и сокращение длительности процесса.

На чертеже представлен график, поясняющий способ.

Согласно предлагаемому способу биологический материал заливают 2 н. водноэтанольным раствором щелочи, добавляют в качестве антиоксиданта аскорбиновую кислоту и омыляют в течение 60-90 мин при

60 С; из полученного гидролизата этилацетатом извлекают витамин А и.каротиноиды.

Экстракт 2 — 3 раза промывают водой до удаления следов щелочи, переньсят в мерную пробирку или колбу, доводят его объем до заданной величины. Аликвоту 3 мл спектрофотометрируют на длине волны 450 нм от(объем) тетрафторборной кислоты, полученную смесь встряхивают и через 2-5 мин снова спектрофотометрируют при 390 нм.

По оптической плотности экстракта при 450 нм определяют содержание каротиноидов в биологическом материале, при 390 нм — количество витамина А по приросту оптической плотности.

При использовании предлагаемого способа точность определения каротиноидов в

1,4 раза, а витамина А в 2,1 раза выше, чем способа-прототипа. Время, затрачиваемое на анализ согласно предлагаемому способу, меньше в 1,8 раза.

Пример 1. Определение витамина А и каротиноидов в печени кур.

Навеску гомогенизированной куриной печени (0,5 г) заливают 5 мл 2 н. водно-этанольного раствора гидроокиси натрия, добавляют 0,05 r аскорбиновой кислоты и нагревают при 60 С в течение 90 мин. Затем к гидролизату добавляют 15 мл этилацетата и хорошо встряхивают. хива нием экстракта с 3 — 5 г безводного сульфата натрия.

После осушивания 3 мл экстракта фотометрируют на длине волны 450 нм для определения концентрации каротиноидов. В качестве раствора сравнения используют чистый этилацетат. Для определения концентрации витамина этот же экстракт фотометрируют на длине волны 390 нм и, таким образом, получают начальную оптическую плотность экстракта, Затем в обе кюветы

1723518 микропипеткой добавляют 0,05 мл тетраф- Способ осуществляют так же, как в приторборной кислоты и отмечают приростоп- мере 3, лишь уменьшив навеску до 50— тической плотности — ЛА, Через 2 — 4 мин, 100 мг. когда оптическая плотность экстракта пере- Пример 5. Определение витамина А стает расти, записывают. ее максимальное 5 и каротиноидов в плазме крови. .значение. Измерения проводят также на Плазму крови (5-6 мл) помещают в кругдлине волны 390 нм. По разнице между вто- лодонную колбу, щелочной гидролиз и все рым и первым измерениями рассчитывают другие операции проводят согласно примеи рирост оптической плотности. ру 1.

С помощью пересчетной формулы (или 10 Определение витамина А и каротиноик алибровочного графика) по величине А доввлюбыхдругихсубстратах проводяттак

450 находят содержание каротиноидов, по А — же, как описано в примере 1. количество витамина А в исследуемом об- Пример 6. Определение зависимости разце. Содержание витамина А рассчитыва- скорости дегидрирования витамина А от ко15 личества тетрафторборной кислоты в этила A . (490 0— AÐ0), цетате.

9 К 3 мл этилацетатного экстракта витагде Хд — количество витамина А в пробе, мина А (концентрация витамина А мкг/г; 66,3 м кгlмл) добавляют 0,03 — 0,50 мл тетV — объем этилацетата, мл; 20 рафторборной кислоты. Первое измерение

g — навеска образца, г; оптической плотности на длине волны 390

КА — калибровочный коэффициент (тан- нм проводят через 60 с после смешивания генс угла наклона калибровочной прямой), растворов, все последующие изменения — с интервалом 30 с, При этом в зависимости от

Аз„— оптическая плотность раствора 25 дозы внесенной НВ 4 за стРого определенпри 390 нм до добавления тетрафторборной ное вРемЯ в кажДом слУчае витамин А полкислоты, ностью переходит в дегидроформу, при

390 этом оптическая плотность достигает макА — оптическая плотность раствора симального значения и в течение длительного времени не изменяется. после до авления тетрафторборной кисло- 30 ro a ты при 390 нм, Результаты приведены в табл, 4.

Данные анализа печени кур приведены в табл, 1.

Из данн ых табл. 4 следует, что наиболее и каротиноидов в желтке куриных яиц. Сравдом в течение 2 — 5 мин наблюдается и и нительные испытания предлагаемого спо- ами

35 добавлении к этилацетатном аство виц у р с вору висоба и протот14па. тамина А тетрафторборной кислоты в количестве 1,0 — 2,7 об. А, т.е. когда соотношение

Навеску 1 г яичного желтка анализируют по способу-прототипу и предлагаемому 38 1 П и вл этилацетат: HBF4 лежит в и е елах 100;138;1. При добавлении тетрафторборной кистаты испытаний приведены в табл. 2 и 3.

Проведенные испытаниЯ показали, что меньшается за счет аз в образования дегидрофо мы витамина А использование предлагаемого способа позволяет повысить точность определения ка- . анализи м ротиноидов в 1 4 раза, витамина А — в 2,1 45

45 вия протекания побочной реакции. При этом дегидроформа либо образуется не полгаемому спо об меньше в 1 8 аза

Rример3.Опре е ен евитаминаА и каротиноидов в комбикорме, тамина А тетрафторборной кислотой предНавеску комбикорма 2 — 3 г помещают в часть спектра витамина еще до добавления тетрафторборной кислоты, т.е, чистого витатрия 0 05 г аскорбиновой кислоты и нагре- (КРиваЯ ) в о ласти 340-450 нм и астьспектрадегидроформы витамина А по55 сле добавления тетрафторборной кислоты перации проводят согласно примеру 1, через каждые 30 с. измерения (кривые 2 — 6).

Доза HBF4 0,05 мл. Как видно из чертежа, пределение витам"на полное дегидрирование витамина A наступает уже через 2 мин, что также подтверждает дан н ые табл. 4.

1723518

Пример 7, Определение зависимости времени полного дегидрирования витамина

А от его содержания в растворе.

К одинаковым обьемам раствора витамина А (3 мл) с различной его концентрацией добавляют одно и то же количество тетрафторборной кислоты — 0,05 мл. При этом скорость реакции дегидрирования, время выхода и процент выхода аналитической формы витамина А остаются неизменными, Результаты измерений приведены .в табл. 5.

Из данных табл. 5 следует, что изменение концентрации витамина А не оказывает влияния на скорость и полноту дегидратации, т.е. предлагаемый способ применим для большого интервала концентраций витамина А.

Пример 8, Определение устойчивости дегидроформы витамина А.

К 3 мл раствора витамина А добавляют

0,05 мл тетрафторборной кислоты. Определение оптической плотности раствора проводят каждые 30 — 60 с.

Результаты измерений представлены в табл, 6.

Максимальное количество дегидроформы в данном случае образуется через 3 мин.

Измерения показывают, что полученная дегидроформа витамина А устойчива во времени и не разлагается при проведении анализа в течение 10 — 20 мин.

Пример 9. Построение калибровочных графиков для определения витамина А и каротиноидов.

Масляный препарат витамина А разбавляют гексаном в 250, 1000 и 2500 раз. Аликвоты растворов 1 — 3 мл заливают 5 мл 2 н. водно-этанольного раствора гидроокйси натрия; омыление и все дальнейшие операции проводят, как описано в примере 1.

Результаты испытаний приведены в табл. 7.

Через полученные точки проводят калибровочную прямую. Калибровочный коэффициент (тангенс угла наклона прямой)

KA равен 6,097.

Калибровочный график для определения каротиноидов строят с помощью растворов бихромата калия. Калибровочный коэффициент Кк равен 4,46.

Пример 10. Сравнение продолжительности анализа согласно предлагаемому и

5 известному способам.

Сравнение предлагаемого способа и прототипа указывает на то, что время, затрачиваемое на анализ образца по способу с тетрафторборной кислотой, значительно

10 меньше, чем по прототипу; способ упрощается за счет устранения ряда операций в ходе анализа, Результаты сравнения приведены в табл. 8.

15 Таким образом, использование в качестве экстрагента этилацетата исключает образование в процессе экстракции эмульсии . и способствует более быстрому разделению фаз, что повышает точность определений и

20 сокращает продолжительность анализа; использование для дегидратации витамина А тетрафторборной кислоты позволяет упростить способ и сократить время его выполнения за счет устранения ряда аналити25 ческих операций; замена бензола нетоксичным этилацетатом улучшает условия работы, расширяет возможности использования способа.

Проведенные испытания показали, что

30 при использовании предлагаемого способа точность определений каротиноидов повышается в 1,4 раза, витамина А — в 2,1 раза.

Время анализа сокращается при этом в 1,8 раза.

35 Формула изобретения

Способ одновременного количественного определения витамина А и каротиноидов, включающий щелочной гидролиз и робы, экстра кцию оп ределяемых веществ.

40 органическим растворителем, обработку экстракта минеральной кислотой и спектрофотометрический анализ, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения и ускорения процесса, в качестве органического раство45 рителя используют этилацетат, а из минеральных кислот используют тетрафторборную кислоту в количестве, обеспечивающем ее содержание в смеси с экстрактом 1,02,7 ф„при этом обработку экстракта прово50 дят в течение 2 — 5 мин.

1723518

Таблица 1

Концентрация витамина

А, мкг/г

Оптическая плотность при 390 нм

Навес ка, Г

Оптическая плотность при 450 нм, А450

Образец 2

ЬА=А -А

2

328,9+2,64

Таблица 2

Оптическая плотность

Концентрация витамина А, мкг/г желтка

Выход внутреннего стандарта, 8

Образец

Объен раствора зтмлацеата, нл

Навеска, t

Концентрация каротинондов, мкг/г желтка

А4Ю „зте

f Кароти- j Витамин ноиды j A

0,I43 0,093

0,135 0 ° 088

0,130 0,084

0,1ЗО О,ОЗ7

0,114 0,026

0,119 0,035

16 ° О

15,0

16,5, 0,531

О,481 .0,476

Контроль

5,79

5 ° 80

4,58

5,39й 0,95

19,22

18,78

20,10

0,460

0,486

0,498

19,37+ 0,91

Контроль + внутренний стандарти

0,165 0„107 0,841 0,734

0,169 0,110 0,851 0,741

0,188 0,12 0,875 0,753

15,0

I 5,0

l6,о

24,00

23,26

26,94

150,73

142,25

149,88

147,62+ 3,32 101, 1 94,8

24,73 1 2,64 к

В качестве внутренмего стандарта в каждую пробу добавляли 5,30 мкг каротиноидов и 150 мкг витамина А в расчете на 1 г навескн. б л и В О -2»

Концентрация

Г каротиноидов, мкг/r

Выход внутреннего стандарте, Ф

Образец

Навеска, г

Объем бензопа, мл

Концентрация витамина А, мкг/г

Каротино-1Витамин иды А

0,492

0,496

0,510

0,145 0,026

0,139 0,030

Ою!35 Ою021

4,76

5,45

3,71

19,72

18,75

17,71

15,0

15,0

15,0

Контроль

18,73 1,37

4,64 1,19

129,20

161,14

113125

0,187

0,205

0 150

24,43

26,37

20,91

0,512

0,520

0,480

15,0

15,0

15,0

0,735

0,931

0,604

Контроль + внутренний стандарт я

134,53ьь33,13 97,6

86,6

23 ° 90+3,76

Ф

В качестве внутреннего стандарта в каждую пробу добавляли 5,30 нкг каротиноидов и 150 нкг витамина А в

Ф рас ете на 1 г навески.

О, 073

0,067

0,070

0,143

0,005

0,.004

0,О04

0,009

0,003

0,003

0,003

0,006

0,265

0,246

0,255

Î 516

Концентрация каротиноидов, мкг/г

0,262 4,58

0,243 4,00

0,252 3,82

0,510 4,21

4, 15+0,37

328,4

331,7

329,4

326,1

1723518

Таблица 4

Объем раствора HBF4, мл

Соотношение объемов растворов витамина А и HBF

Количество

НВР4 т обе 6

Выход дегидроформы, 3

Объем раствора, мл

Таблица 5

Выход дегидроформы, 3

Объем добавляемого раствора НВГ„, мл

Концентрация . витамина А, мкг/мл

Время полного дегидрирования витамина А, мин

0,05

0,05

0,05

3,00

3,00

3,00

20,2

46,5

80,5

100

Таблица 6

3 3,5 д 5 10 20 30

Время иэмерения, 1 мин

l,5 2

Оптическая плотность Формы 0,93

1,0 1,05 1,05 1,05 1,05 1,05 1,03 0,9

0,96

Выход дегидроформы, 88,6

95 2 100,0 100 0 100 0 100.. 100 98 1 93 5

91,5

Таблица «7

4,59

Концентрация растворов витамина А, мкг/мл о,92 г,15

2,29

9,17 18,35 р,35о о,365 о,770. 1,56о 2,950

Прирост оптичес" кой плотности, д >90

0,066

3

3

3

0,01

0,02

0,03

0,05

0,08

0,09

0,10

0,15

300:1

150:1

100:1

60:1

38;1

33:1

3o:

20:1

0,33

0,67

1,00

1,67

2,67

3,00

3,33

5,00

Время полного дегидрирования витамина А, мин

7,о-9,5

5,5-8,0

4,0-5,0

3,0-4,5

2,0-4,0

1,5-3,0

1,0-2,0

0,5"1,5

95,6

91,0

85,8

1723518

Таблица .8

Операция

60-90

60-90

Омыление

7-.15

3-.5

5-10

15-30

Разделение экстракта

3"5

Центрифугирование

Полное время анализа

Составитель П.Сурай

Редактор Л.Веселовская Техред М.Моргентал . Корректор Т.Малец

Заказ 1062 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Экстракция витамина А и каротиноидов

Промывка экстракта водой

Перевод витамина в дегидроформу

Нейтрализация раствора щелочью и промывка

Спектрофотометрическое измерение

Продолжительность, мин, по способу г прототипу предлагаемому

5 5

137-190 76-115

Способ одновременного количественного определения витамина а и каротиноидов Способ одновременного количественного определения витамина а и каротиноидов Способ одновременного количественного определения витамина а и каротиноидов Способ одновременного количественного определения витамина а и каротиноидов Способ одновременного количественного определения витамина а и каротиноидов Способ одновременного количественного определения витамина а и каротиноидов Способ одновременного количественного определения витамина а и каротиноидов 

 

Похожие патенты:

Изобретение относится к устройствам для дозирования жидкости, позволяет повысить точность и является усовершенствованием изобретения по авт

Изобретение относится к испытательной технике, а именно к испытаниям на прочность

Изобретение относится к способам определения бикарбонатов и карбонатов в присутствии нитрита.- Целью изобретения является одновременное определение бикарбонатов и карбонатов Способ включает введение в анализируемьй раствор моноэтаноламина осаждение карбоната раствором хлорида бария в щелочной среде и последующее комплексонометрическое титрование избытка бария
Наверх