Способ проведения микрохирургических операций с яйцеклетками и эмбрионами

 

Использование: биотехнология, трансплантация эмбрионов млекопитающих. Сущность изобретения: Эмбрионы крупного рогатого скота на стадии морулы получают на 7-й деньпослеосеменения. Помещают их в 1,5 М раствор сахарозы в фосфатно-срлевом буфере Дюльбекко. Заточенной микропипеткой делают прокол оболочки и извлекают содержимое клетки. Зародыш без оболочки переносят в изотонический раствор. Производят разделение зародыша на две половинки. Две части эмбриона переносят в 1,5 М раствор сахарозы. Каждую из частей зародыша помещают во внеклеточную оболочку и переносят в физиологический раствор. 2 ил., 1 табл.

СОЮЗ СОВЕ ТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А1

t;)(j u >g

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4832540/15 (22) 12.04.90 (46) 23.04.92. Бюл. N. 15 (71) Научно-исследовательский институт животноводства Лесостепи и Полесья УССР (72) Ф.И.Осташко, Н.Д.Безуглый и Н.А.Гордиенко (53) 636.081/082:576:32(088.8) (56) ЮПабвеп Я.М. Mlcromanlpulatlorl of

embryo qf the large domestic species

mammalian egg transfer/ Ed, С,Adams,. 1982, р. 186 — 208. (54) СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ МИКРОХИРУРГИЧЕСКИХ ОПЕРАЦИЙ С ЯЙЦЕКЛЕТКАМИ И ЭМБРИОНАМИ

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к микрохирургии биологических объектов, имеющих внеклеточную оболочку, и может быть использовано в трансплантации эмбрионов млекопитающих.

Целью изобретения является повышение сохранности биологического объекта и повышение технологичности операции.

Поставленная цель достигается тем, что биологический объект извлекают из внеклеточной оболочки в гипертоническом растворе непроникающих через мембрану клетки веществ концентрации 1,2-1,5 М в среде, обеспечивающей жизнеспособность, Через оболочку вводят капилляр, втягивают в него клеточную массу биологического объекта и извлекают ее иэ оболочки, проводят микрохирургические операции с клеточной массой в растворе, обеспечивающем жизнеспособность, затем при необхо„„Я3 „„1727822 (я)5 А 61 О 19/04, С 12 N 5/00. С 12 0 1/24 (57) Использование: биотехнология, трансплантация эмбриочов млекопитающих.

Сущность изобретения: эмбрионы крупного рогатого скота на стадии морулы получают на 7-й день после осеменения. Помещают их в 1,5 M раствор сахарозы в фосфатно-солевом буфере Дюльбекко. Заточенной микропипеткой делают прокол оболочки и извлекают содержимое клетки, Зародыш без оболочки переносят в изотонический раствор. Производят разделение зародыша на две половинки. Две.части эмбриона переносят в 1,5 М раствор сахарозы. Каждую из частей зародыша помещают во внекле-. точную оболочку и переносят в физиологический раствор, 2 ил., 1 табл. димости помещают снова ее в одну или несколько внеклеточных оболочек в гипертоническом растворе и переносят в изотонический физиологический раствор.

Способ проведения микрохирургических операций основан на том, что внеклеточная оболочка биологического. объекта, в частности прозрачная оболочка (зона пеллюцида) яйцеклеток и эмбрионов, не обладает избирательной проницаемостью, в то время как цитоплазмати,еские мембраны клеток, в частности яйцеклеток v, бластомеров эмбрионов, обладают избирательной проницаемостью. Это приводит к тому, что при помещении в гипертонические растворь1 непроницаемых через цитоплазматические мембраны качеств, например хлористого натрия, сахарозы осмомо".ÿðíoстью 1.2 — 1,5 М, обьем клеточной массы биологического объекта уменьшается ч 2.5-2Я

1727822

50 раза, а размеры внеклеточной оболочки не изменяются.

На фиг.1 на примере 2-клеточного эмбриона отображечы объемы внутриклеточной массы зародыша, находящегося в изотоническом растворе; на фиг.2 — то же, в гипертоническом растворе осмомолярностью 1,2-),5 М.

Выбор концентрации 1,2 — 1,5 M обусловлен тем, что при более низкой концентрации ущныиейме объема клеточной массы незючйтельно и извлечь ее из внеклеточной оболочки трудно,;а более высокая концентрация непройикающих веществ повреждает клетки (см. таблицу.).

Сущность способа заключается в следую;цем, Биологический объект, имеющий внеклеточную оболочку, находящийся в физиологическом растворе, переносят в гипертонический раствор непроникающих веществ осмомолярностью 1,2-1,5 IVI, Выдерживают в растворе в течение 1 мин, а затем фиксируют положение микросоской.

Микроиглой или микроножом делают прокол или разрез внеклеточной оболочки, вводят микропипетку и вынимают целый или часть биологического объекта из собственной оболочки. Переносят его в изотонический раствор, где объект принимает прежние форму и размеры. Проводят необходимые операции и снова переносят целый или часть обьекта в гипертонический рас-. твор, где они уменьшаются в объеме. При необходимости помещают часть или целый биологический объект в пустую внеклеточную оболочку.

Пример. Эмбрионы крупного рогатого скота на стадии морулы получают на 7-й день после осеменения. Пригодные к работе эмбрионы помещают в 1,5 М раствор сахарозы в фосфорно-солевом буфере

Дюльбекко. В таком растворе объем внутриклеточной массы зародыша уменьшается в

2,8 раза, а размеры внеклеточной оболочки не изменяются, при этом пространство между оболочкой и цитоплазматической мембраной увеличивается. Микрохирургическую операцию проводят под микроскопом "Биолам P-2" с помощью двух

30 позиционеров микроманипулятора, эмбрионы удерживают микроприсоской. Заточен-. ной микропипеткой с диаметром, сравнимым с размерами внутриклеточной массы, находящейся в гипертоническом растворе, делают прокол оболочки и извлекают содержимое клетки. При этом разрыв внеклеточной оболочки незначителен, а собственно эмбрион извлекают из нее без повреждений. Зародыш без оболочки переносят в изотонический раствор, где эмбрион восстанавливает свой первоначальный объем, и производят разделение зародыша стеклянной иглой на две половинки. Затем две части эмбриона переносят в 1,5 M раствор сахарозы снова, где размеры половинок уменьшаются. Одну из частей зародыша помещают через отверстие во внеклеточную оболочку, из которой эмбрион был извлечен, а вторую часть зародыша — в другую оболочку, из которой предварительно извлечено содержимое, После проведения микрохирургической операции половинки эмбрионов, находящиеся во внеклеточной оболочке, переносят в физиологический раствор, Результаты эксперимента показывают, что использование гипертонического раствора при удалении внеклеточной оболочки позволяет манипулировать с эмбрионами без риска их повреждения и, следовательно, повысить процент жизнеспособных половинок после разделения зародышей.

Формула изобретения

Способ проведения микрохирургических операций с яйцеклетками и эмбрионами, включающий извлечение их из внеклеточной оболочки с последующим возвращением впустую оболочку,,о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения сохранности биологического объекта и повышения технологичности операции, извлечение яйцеклеток и эмбрионов из внеклеточной оболочки и возвращение их в пустую оболочку осуществляют в гипертоническом растворе непроникающих веществ осмомолярностью 1,2-1,5 М в среде, обеспечивающей жизнеспособность. объектов.

1727822

* Биологические объекты помещают в гипертонический раствор, выдерживают в течение 1 ч, возвращают в физиологические условия и культивируют вне организма.

** Биологические объекты культивируют вне организма в изотоническом растворе.

Составитель M.Óñöåëåìoâ

Техред М.Моргентал Корректор О. Кравцова

Редактор И.шмакова

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 1357 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5