Способ получения смеси аминокислот, аденина и тирозина

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения смеси аминокислот, аденина и тирозина из дрожжей . Цель изобретения - повышение полноты их извлечения. Суспензию прессованных дрожжей в деионизованной воде нагревают при 48 ± 1°С в течение 30 ч при перемешивании . Полученный автолизат пропускают через колонку с катионитом КУ-2-8 в Н+-форме при значении критерия А аденина 2-4. Колонку промывают 1 мМ серной кислотой и элюируют 1 М раствором аммиака при том же значении критерия А аденина. Элюат пропускают через колонку с высокоосновным анионитом в ОН -форме и промывают анионит 1 н.раствором аммиака. Объединяют растворы, прошедшие колонку при пропускании элюата и при промывании. Объединенный раствор высушивают и получают смесь аминокислот. Анионит промывают деионизованной водой и элюируют 1 н.раствором серной кислоты. Пропускание через анионит и элюирование с анионита проводят при А аденина 2-4. Из элюата выделяют тирозин. Фильтрат после отделения тирозина пропускают через колонку катионита КУ-2-8 в МН/ -форме. Катионит промывают деионизованной водой и проводят элюирование 1 н.раствором гидроксида натрия, Из элюата выделяют аденин. 3 табл. Ё I

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАP СТВЕ ННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (1 ! () (Ъ

1«р

О

iQ

1=3 (1 — а) Г

Ф ° u (21) 4609661/13 (22) 06.12.88 (46) 07.05.92, Бюл, Мв 17 (71) Научно-производственное гидролизное объединение "Гидролизпром" (72) М.Л.Суханов, И,В.Зайцева, Д.И.Островский, А, Н. Клюквин, В, В. Рябов, С.В. Малярчук, Н.Ф,Езерская, А.Б.Воронков, И,М.Голубков и Ю,А.Лаптев (53) 57:085.42: 663. 035/038: 543,544 (088. 8) (56) Авторское свидетельство СССР

N 1363815, кл, С 07 D 473/34, 1985, Авторское свидетельство СССР

N. 1027859, кл. А 23 J 1/18, 1981. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СМЕСИ АМИНОКИСЛОТ, АДЕНИНА И ТИРОЗИНА (57) Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения смеси аминокислот, аденина и тирозина из дрожжей. Цель изобретения — повышение полноты их извлечения. Суспензию прессованных дрожжей в деионизованной воде нагревают при 48 1 С в течение 30 ч при перемешиИзобретение относится к биотехнологии и касается способа получения смеси аминокислот, аденина и тирозина из дрожжей.

Цель изобретения — повышение полноты их извлечения.

Способ осуществляют следующим образом.

Суспензию прессованных дрожжей в деионизованной воде нагревают до

48 1 С и перемешивают в течение 30 ч.

Получают дрожжевой автолизат. Его пропускают через колонку с катионитом в Н -форме при значении критерия il аденина 2 — 4.

ÄÄ5UÄÄ 1731806 А1 (я)5 С 12 N 1/06, 1/08, А 23 J 1/18 вании, Полученный автолизат пропускают через колонку с катионитом КУ-2-8 в Н+-форме при значении критерия il аденина 2 — 4, Колонку промывают 1 мМ серной кислотой и элюируют 1 М раствором аммиака при том же значении критерия А аденина. Элюат пропускают через колонку с высокоосновным анионитом в ОН -форме и промывают анионит 1 н.расгвором аммиака. Объединяют растворы, прошедшие колонку при пропускании элюата и при промывании.

Объединенный раствор высушивают и получают смесь аминокислот. Анионит промывают деионизованной водой и элюируют

1 н.раствором серной кислоты. Пропускание через анионит и элюирование с анионита проводят при А аденина 2 — 4. Из элюата выделяют тирозин. Фильтрат после отделения тирозина пропускают через колонку катионита КУ-2-8 в NH4 -форме, Катионит промывают деионизованной водой и проводят элюирование 1 н.раствором гидроксида натрия, Из элюата выделяют аденин. 3 табл.

Колонку промывают серной кислотой и проводят элюирование раствором аммиака при том же значении критерия А аденина.

Критерий Л определяет режим хроматографического процесса, включая в себя основные равновесные, кинетические и геометрические параметры хроматографической системы. Его расчитывают по формуле где a — доля свободного объема в колонке между зернами сорбента;

1731806

à — объемный равновесный коэффициент распределения; х — высота слоя сорбента в колонке;

U — линейная скорость пропускания раствора в колонке над слоем сорбента;

D — коэффициент внутренней диффузии;

R — радиус набухшего зерна сорбента, При А ) 1 хроматографический процесс проходит в регулярном режиме и

on ределяется в основном законами сорбционного равновесия. При А < 1 хроматографический процесс проходит в нерегулярном режиме, характеризуется неравновесным распределением вещества между фазами раствора и сорбента и не описывается законами равновесной сорбции.

При неравновесной фронтальной ионообменной сорбции многокомпонентных смесей не только изменяется сорбируемость отдельных компонентов, но и их соотношение не соответствует рассчитанному по константам обмена, При этом происходит существенное изменение состава сорбируемой смеси по сравнению с составом раствора, а также потери отдельных компонентов за счет их "проскока" через колонну.

При комплексной переработке биомассы дрожжей с получением нескольких ценных продуктов необходимо проводить хроматографические процессы при значении критерия А ) 1 для всех целевых компонентов.

При значении критерия А аденина 2 — 4 другие целевые компоненты автолизата также сорбируются в регулярном режиме, При меньших значениях критерия А аденина происходят необратимые потери аденина, а также некоторых, в том числе незаменимых, аминокислот. Кроме того, при этом содержание компонентов нуклеиновых кислот в смеси аминокислот повышается выше допустимого предела, Проведение хроматографических процессов при значении критерия А аденина

> 4 нецелесообразно, так как это либо приводит к непроизводительным затратам времени вследствие снижения скорости пропускания раствора, либо за счет уменьшения зерна сорбента приводит к повышению гидравлического сопротивления колонны, Элюат, полученный с катионита, пропускают через колонку с высокоосновным анионитом в ОН -форме при значении критерия аденина 2 — 4 и промывают анионит раствором аммиака. Объединяют растворы, прошедшие через анионит при пропускании элюата и при промывании объединенный раствор высушивают и получают смесь аминокислот. Затем анионит и ромы вают деионизованной водой и проводят элюирование раствором серной кислоты при значении критерия А аденина 2-4. Элюат нейтрализуют, упаривают под вакуумом в

2 — 4 раза и выдерживают из него при охлаждении осадоктирозина. Тирозин отфильтровывают. Фильтрат пропускают через колонку с катионитом в NH4 -форме, Катионит промывают деионизованной водой и проводят элюирование раствором гидроксила натрия. Элюат нейтрализуют, упаривают в 2 — 4 раза, охлаждают и отделяют осадок аденина, Пример. B промытый простерилизованный реактор заливают 250 мл деионизованной воды и загружают 1 кг свежих прессованных дрожжей. Смесь выдерживают 30 ч при 48 + 1 С, непрерывно перемешивая, Автолизат пропускают через колонну с катионитом КУ-2-8 в Н -форме (5х30 см) при оп редел ен ном значении критерия il аденина . Колонну промывают 2 л

1 мМ раствора серной кислоты и проводят элюирование 2 л 1 н раствора аммиака при определенном значении критерия il аденина. Полученный злюат подают на колонну с высокоосновным анионитом APA в ОН— форме (2,5х30 см) при определенном значении критерия 1 аденина, Анионит промывают 100 мл 1 н раствора аммиака, который присоединяют к раствору, прошедшему через анионит. Обесцвеченный и освобожденный от компонентов нуклеиновых кислот раствор аминокислот высушивают на распылительной сушилке, Колонну с анионитом промывают 100 мл деионизованной воды и проводят элюирование 1 л 1 н,раствора серной кислоты при определенном значении критерия А аденина, Элюат нейтрализуют 25 -ным раствором аммиака до значения рН 70+0,5 и упаривают под вакуумом в 2 — 4 раза. Упаренный элюат охлаждают до 8 — 12 С и выдерживают в течение 10 — 12 ч при этой температуре, Осадок полупродукта отделяют фильтрацией, промывают деионизованной водой и переносят в реактор, содержащий 100 мл деионизованной воды.

Полученную суспензию нагревают при перемешивании до 96 — 100 С, выдерживают при этой температуре 10 — 15 мин и фильтруют. Фильтрат охлаждают до 8-12 С, подкисляют до рН 3,0-3,4 концентрированной серной кислотой и выдерживают при этой температуре 5 — 6 ч.

1731806

Осадок тирозина отделяют фильтрацией, промывают деионизованной водой и сушат. Фильтрат подают на колонну с катионитом КУ-2-8 в NH4 -форме (1x10 см) со скоростью 10 мл/ч. Колонну промывают 20 мл деионизованной воды и проводят элюирование 70 мл 1 н.раствора гидрооксида натрия, Элюат нейтрализуют концентрированной серной кислотой до рН 7,0+0,5 и упаривают под вакуумом в 2 — 4 раза. Упаренный раствор охлаждают до 5 С и выдерживают 10 — 12 ч, Кристаллы аденина отделяют фильтрацией, промывают деионизованной водой и сушат.

Аминокислотный анализ проводят на анализаторе Биотроник ЛЦ-5000 в системе натриевых буферов с погрешностью 2 .

Значения параметров, которые использованы при расчете критерия А аденина, приведены в табл. 1, Расчет il при а = 0,3.

Использованные виды дрожжей указаны в табл. 2.

В табл.3 приведены зависимости выхода смеси аминокислот, аденина и тирозина, а также аминокислотного состава смеси и содержания в ней компонентов нуклеиновых кислот от значения аденина при сорбции и десорбции на катионите и анионите.

Характеристика смеси аминокислот, аденина и тирозина приведена ниже.

Смесь аминокислот являет собою мелкодисперсный порошок белого или слабо-желтого цвета, гигроскопичен; растворимость — не менее 10 (в воде); рН 5 водного раствора 6,0 — 7,4, влажность — не более 10/, содержание негидролизованноIo белка (качественно) отсутствует; содержание аминокислот — 70 ч 15%; содержание низших пептидов не более 20 /; содержание компонентов нуклеиновых кислот — не более 0,1%, содержание аммиака не более

0,2 ; содержание углеводов не более 0,5 ; содержание липидов не более 0,5 ; зола не более 1,0%, содержание солей тяжелых металлов не более 0,001%.

Аденин являет собою белый или почти белый мелкокристаллический порошок; содержание аденина 99,5» 0,5%; ультрафиолетовый спектр раствора препарата в 0,1 н.соляной кислоте в области от 210 до 300 нм имеет единственный максимум поглощения при 261,5 нм и минимум при 228 нм, Отношение оптических плотностей вышеуказанного раствора: Д /Д = 0,79;

Д /Д = =0,30; 0,1,— ный раствор про280 280 зрачен и неокрашен, Препарат хроматографически гомогенен (ВЭЖХ на колонке

ЛиХросорб РП-18); зольность — не менее

0,05 ; содержание тяжелых металлов менее 0,0005%.

Тирозин являет собою шелковистые иглоподобные кристаллы белого цвета; содержание тирозина в препарате 99» 1 ; ультрафиолетовый спектр раствора препарата в 0,1 н.соляной кислоте в области от 210 до 300 нм имеет два максимума поглощения при 274 и

221 нм и минимум при 243 нм. Отношение оптических плотностей вышеуказанного раствора: Я /Д = 11,1; Д /Д = 0,80;

Д /Д = 0,66. Препарат хроматографически гомогенен (ВЭЖХ на аминокислотном анализаторе Биотроник "ЛЦ 5001", в системе литиевых буферов); зольность менее

0,1 ; содержание тяжелых металлов менее

0,0005 о .

Формула изобретения

Способ получения смеси аминокислот, аденина и тирозина, включающий автолиз дрожжей путем нагревания дрожжевой суспензии при перемешивании, пропускание автолизата через катионит, промывание катионита раствором серной кислоты, элюирование целевых продуктов, пропускание элюата через анионит, промывание анионита, элюирование и выделение целевых продуктов из элюата, отличающийся тем, что, с целью повышения полноты их извлечения, автолизат пропускают через колонку

+ с катионитом в Н -форме при значении критерия А аденина 2 — 4, промывают катионит серной кислотой и элюируют раствором аммиака при том же значении критерия аденина, полученный элюат пропускают через колонку с высокоосновным анионитом в

ОН -форме при значении критерия i1 аденина 2 — 4, промывают анионит раствором аммиака, объединяют растворы, прошедшие через анионит при пропускании элюата и при промывании, и из объединенного раствора высушиванием выделяют смесь аминокислот, затем анионит промываютдеионизованной водой и элюируют тирозин и аденин раствором серной кислоты при значении критерия А аденина 2 — 4, элюат нейтрализуют, упаривают под вакуумом в 2 — 4 раза и из упаренного элюата при охлаждении выделяют осадок тирозина, его отфильтровывают, фильтрат пропускают через колонку с катионитом в NH4 -форме, катионит промывают деионизованной водой, элюируют аденин раствором гидроксида натрия, элюат нейтрализуют, упаривают под вакуумом в 2 — 4 раза, охлаждают и отделяют осадок аденина.

1731806

Та блица l

Показатель (3

4 5

Сорбция на катионите КУ-2-8 о

Температура, С

22

22

40

40

1,2xlO

5.3х10

5,0х10 г

3,2х10 г

5,0х10 г

30

5,31х10 г

3,25xlO-г

Десорбция с катионита

22 22

Температура, С о

22

10,5 !0,5

12,0

10,5

l0 5

1>3х10

1,3х10

1,3х10

2,5xlO

1,3х10

5,0xlO"2

3,2xl 0 г

3,2х10 г

3,44x10"з

3,69xl 0

2 10xlO-з

Температура, С о

22 22

7,4

7,4

11,3

9,2

9,2

l,lх10

4xl0 г

9,5xlO

2xl 0-г

1,1х!0

4х10 г

1,5xlO

lх10 г

1,74х10

Скорость потока U, см/с 3,21х10 г

22

30

Температура, С

22

5,4

5,4

4,4

3,7

3,7

2,5х10

4х10 г

2,5хl 0

4х10 г

2,1х10

2x10-г

5,32х10 з

30

30

APA-4п

APA-4п

АРА-2п

АPA-2п

APA-2п

Коэффициент распределения, Г

Коэффициент диффузии

D, смг/с

Радиус зерна R, см

Длина .колонки х, см

Скорость потока U,ñè/с

Коэффициент распределения, Г

Коэффициент диффузии

D> смг/с

Радиус зерна R, см

Длина колонки х, см

Скорость потока U, см/с

Коэффициент распределе" ния, f

Коэффициент диффузии

D> смг/с

Радиус зерна R, см

Значение критерия $ аденина

Коэффициент распреде" ления Г

Коэффициент диффузии

D, смг/с

Радиус зерна R, см

Скорость потока 11, см/с

Длина колонки х, см

Марка анионита

5,3х10 5,3х10

6,48х10-г 1,77х10-г

3,2х10 г 5,0х10 г

30 30

4,20xlO з 1,15х10 з

Сорбция на анионите

1,60х10-г 5,64х10-г

Десорбция с анионита

2,66x1 O з 4,08xl 0-з

5j3x10

3,2х-1-0 г

1,5х10

2х10 г

5,43х10 г

2,1х10

2х10 г

3,06х10-з

3 2xl0 г

4, 73х10-г

2,9xlO

1х10 г

l,6lх10 г

1731806

Таблица2

Значение показателя для вида дрожжей, Показатель

Candida

scottii!

Ассоциация i Ассоциация

Candid a scot- Cand ida ut itii 70K lis 93K

Kluyvегоmy- Trichosporon сes marxiа- сutanlum

1us 1

1 Sacch.

carisbaSacch. cerevis cee

gensis

Выход от А.С.Д.,вес.7,":

0,30

0,40

0,30

0,20

0,25

0,30

0,35

12,5

0,50

16,0

13,1

0,2

12,3

0,2

0,2

0,1

Содержание компонентов нуклеино" вых кислот в смеси аминокислот, вес. ь:

0,2

0,2

0,2

0ь!

0 1

П р и м е ч а н и е. А = 3.

Т а б л и ц а 3

Показатель

Значение показателя при 9, аденина

Выход аденина от абсолютно сухих дрожжей, мас,4

0,1 0,2 0,2 0,3 0,3

Выход тирозина от абсолютно сухих дрожжей, мас.3

0,1 0,3 0,4 0,5

0,5

Выход смеси аминокис" лот от абсолютно сухих дрожжей, мас.ь

10,3 15,2 15,7

16,0 16,1

Содержание компонентов нуклеиновых кислот в смеси аминокислот,мас.ь 0,3 0,2

0,1

0,1

0,1

Содержание отдельных аминокислот, 4 мл от суммы

Аспарагиновая кислота

3,4 3,3 3,3

2,5 2,3 2,3

3ю2 30 29

3,2

3,1

Треонин

Серии

2,3

2 3

2,7

2,7

Глутаминовая кислота

4,5 4,3 4,3

3,7 3,4 3,3 6,1 5,0 4,3

10,9 9,1 7,8

4,2

4,1

3,2

3,2

3,8

3,о

7, !

7,0 аденина тирозина смеси аминокислот

Пролин

Глицин

Аланин

0,20, 0,40

15,7

0,1

1731806

Продолжение табл.3

Показатель

Значение показателя при л аденина

7,6

8,0

2,4

2,9

2,0

7,3

12,1

2,7

1,7

8>3

13,1

3,7

8,6

15,6

4,8

5,6

7,0

15,2

3 9

5,0

35

45

Составитель Г.Голева

Редактор О.Хрипта Техред М.Моргентал Корректор Н.Король

Заказ 1557 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Валин

Иетионин

Цистеин

Изолейцин

Лейцин

Тирозин

Фенилаланин

Лизин

Гистидин дргинин

7,9

2,6

1,8

7,9 .12,8

3 3

8,0

15,5

4,5

5,3

8,2 8,1

2,2 2,2

17 17

8,5 8,6

13,3 -13,4

4,0 4,1

9>1 9,3

15 7 15,7

5 0 4,9

5,8 5,8