Способ получения гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к рекомбинантным белкам

Авторы патента:

ПАНЮТИЧ АЛЕКСАНДР ВАСИЛЬЕВИЧ

ШИДЛОВСКАЯ ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА

ВОЙТЕНОК НИКОЛАЙ НИКОЛАЕВИЧ

ПРАСОЛОВ ВЛАДИМИР СЕРГЕЕВИЧ

ЧУМАКОВ ПЕТР МИХАЙЛОВИЧ

РЕЗНИКОВ МИХАИЛ ВЛАДИМИРОВИЧ

C12N5/10 - клетки, модифицированные введением чужеродного генетического материала, например клетки, трансформированные вирусом

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в гибридомной технологии для получения антител против рекомбинантных антигенов, экспрессированных в клетках мыши. Изобретение состоит в иммунизации мышей непосредственно трансфектированными сингенными клетками (СЭКП). Таким образом, исключается необходимость очистки рекомбинантного антигена. При внутриселезеночном способе введения СЭКП образуются штаммы гибридом, продуцирующие антитела класса IgM. Общая продолжительность от начала иммунизации до получения штаммов гибридом составляет3-4 недели. При комбинированном внутрибрюшинном и внутриселезеночном способе введения СЭКП образуются штаммы гибридом, продуцирующие антитела классов IgM и IgG.Общая продолжительность от начала иммунизации до получения штаммов гибридом составляет 5-6 недель. Способ апробирован на антигене-гормоне роста человека. Ген гормона роста трансфектирован в мышиные фибробласты линии Balb/ЗТЗ. З табл. СП С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 N 5/10

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

,ф

О (21) 4800444/13 (22) 20.11.89 (46) 15,05,92. Бюл. N. 18 (71) Институт молекулярной биологии им, В, А. Энгельгардта, Научно-производственное объединение Белорусского научно-исследовательского института переливания крови.

Всесоюзный гематологический научный центр (72) А. B. Панютич, E. А. Шидловская, Н. Н, Войтенок, В. С. Прасолов, П, М, Чумаков и М, B. Резников (53) 578.085.23(088.8) (56) Europ. J. Immunol., 1976, чо!. 6, р, 292295, J. lmmunol. Methods, 1987, vol, 101, р.

57-62. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДОМ, ПРОДУЦИРУЮЩИХ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ

АНТИТЕЛА К РЕКОМБИНАНТНЫМ БЕЛКАМ (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в гибридомИзобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в процессе получения моноклональных антител (МКА) к рекомбинантным белкам.

Традиционный путь получения МКА к рекомбинантным белкам включает ряд этапов: 1) клонирование гена белка; 2) получение варианта гена, пригодного для экспрессии в клеточной системе; 3) экспрессия гена; 4) наращивание культуры клеток, продуцирующих рекомбинантный белок; 5) очистка рекомбинантного белка, часто соЯЛ, 1733470 А1 ной технологии для получения антител против рекомбинантных антигенов, экспрессированных в клетках мыши. Изобретение состоит в иммунизации мышей непосредственно трансфектированными сингенными клетками (СЭКП). Таким образом, исключается необходимость очистки. рекомбинантного антигена. При внутриселезеночном способе введения СЭКП образуются штаммы гибридом, продуцирующие антитела класса lgM. Общая продолжительность от начала иммунизации до получения штаммов гибридом составляет 3-4 недели. При комбинированном внутрибрюшинном и внутриселезеночном способе введения СЭКП образуются штаммы гибридом, продуцирующие антитела классов IgM u lgG.Oáùàÿ продолжительность от начала иммунизации до получения штаммов гибридом составляет

5-6 недель. Способ апробирован на антигене-гормоне роста человека. Ген гормона роста трансфектирован в мышиные фибробласты линии Ваlb/ЗТЗ. 3 табл. пряженная с его денатурацией и последующим восстановлением пространственной структуры; 6) иммунизация животных путем последовательных введений рекомбинантного белка в смеси с адъювантом; 7) получение штаммов гибридом, продуцирующих

МКА к рекомбинантному белку путем слияния иммунных сленоцитов и клеток родительской миеломы.

Такой способ является достаточно сложным в связи с большим количеством трудоемких этапов. Кроме того, полученные

1733470

МКА могут не распознавать природные белки, что может быть связано с отсутствием углеводных остатков у рекомбинантных белков, изменениями их первичной или третичной структуры, Вместе с тем, MKA,ðàñпознающие природные и рекомбинантные белки. являются основой для получения стандартных и абсолютно воспроизводимых реагентов со строго определенной специфичностью, использование которых в экспериментах и разных вариантах иммунного анализа возрастает в геометрической прогрессии.

Целью изобретения является повышение надежности способа получения гибридом, продуцирующих моноклональные нтитела к рекомбинантным белкам.

Поставленная цель достигается за счет того, что экспрессию гена белка осуществляют в сингенных эукариотических клеткахпродуцентах, которыми проводят иммунизацию сингенных животных.

Предлагаемый способ включает следующие этапы: 1) клонирование гена белка; 2 вЂ” экспрессия гена в сингенных эукариотических клетках-продуцентах (СЭКП); 3) иммунизация животных СЭКП; 4) получение штаммов гибридом, продуцирующих МКА к рекомбинантному белку путем слияния иммунных спленоцитов и клеток миеломы, При этом исключаются такие операции, как получение варианта гена, пригодного для экспрессии в прокариотической клеточной системе; наращивание культуры клеток, продуцирующих рекомбинантный белок; очистка рекомбинантного белка. Дополнительным преимуществом предлагаемого способа является то, что в клетках млекопитающих происходит гликозилирование рекомбинантного продукта и его пространственная структура формируется в условиях, близких к физиологичным. Это позволяет получить МКА, распознающие рекомбинаíTный и натуральный белки в равной степени. Кроме того, использование для иммунизации мышей СЭКП вместо растворимых рекомбинантных белковых антигенов не требует применения адъювантов, Для получения моноклональных антител к рекомбинатным белкам íà QCHoae клеток млекопитающих, продуцирующих чужеродные белки, использованы фибробласты Balb/ÇTÇ, сингенные мышам линии

Bali/с, синтезирующие рекомбинантный гормон роста человека.

Пример 1. Специфический иммунный ответ у мышей Ва! Ь/с, иммунизированных клетками Balb/ÇTÇ, продуцирующими рекомбинантный гормон (ГР) человека, Важным моментом гибридомной технологии является иммунизация животных.

Оценка иммунного ответа перед слиянием клеток позволяет прогнозировать получе5 ние специфических моноклональных антител, Этот пример иллюстрирует индукцию иммунного ответа у мышей после введения сингенных эукариотических клеток-продуцентов.

10 Для получения СЭКП, синтезирующих

ГР человека, был создан ретровирусный вектор рР$-neo-hSTH, содержащий безинтронный ген ГР человека в полилинкерном регионе оригинального вектора, несущего

15 устойчивость к неомицину, Первоначально была проведена трансфекция >Р- 2(5) клеток, которые в итоге содержали интегрированный рекомбинантный провирус (вектор)

pHS-neo- hSTH и продуцировали. инфекци20 онный ретровирус, несущий pPS-neo-hSTH

РНК. Этот рекомбинантный ретровирус был использован для инфицирования фибробластов Ва1Ь/ЗТЗ, сингенных мышам линии

Balb/c. Клонированные клетки Balb/ÇTÇ, 25 продуцирующие рекомбинантный гормон роста человека, были выделены после двухнедельной селекции в присутствии неомицина.

Фибробласты Balb/ÇTÇ, продуцирую30 щие ГР, культивировали в среде IMDM (модифицированная Iscove s среда Дульбекко) с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЗТС), 2 мМ 1=глютамина, 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина. 0,05 мЫ меркап35 тоэтанола. Монослой клеток отмывали средой без сыворотки, инкубировали в

lMDM с 1 7 > сыворотки мышей Balb/ñ 1 ч при

37 С и снимали раствором трипсина в версене, После трехкратной отмывки средой

40 без сыворотки клетки ресуспендиравали в

0,02 M фосфатном буферном растворе с

0,15 M NaCI, Клетки вводили внутрибрюшинно (в/б) по 10-20 млн. на мышь, что соответствует оптимальному количеству

45 клеток для полу ения МКА к корпускулярным антигенам и/или внутриселезеночно (в/с) по 200-400 тыс, клеток на мышь, как описано Spitz et а1. При комбинированном способе иммунизации клетки вводили в/с

50 через 21 сут после иммунизации в/б.

Для оценки индукции иммунного ответа спленоциты культивировали в IMDM с ".0 о

ЭТС B концентрации 3-5 млн/мл в течение

5 сут супернатанты тестировали методом

55 иммуноферментного анализа (ИФА) по следующей схеме. Рекомбинантный ГР или бычий сывороточный альбумин (БСА) сорбировали в лунках микроплат (Nunc

IrnmunopIate 1) (500 нг/лунку в 0,1М карбонатном буфере, рН 9,5, 16 ч при 4 С). После

1733470

MKA к рекомбинантному белку, составляет при этом 5-6 недель.

Формула изобретения

Способ получения гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к рекомбинантным белкам, включающий клонирование и экспрессию генов белка, 10

1аблица 1 ность при 492 х 10 нм, 3 тант оцитов

»/

1/64 1 128, „„1 .)г

105, 96

18 з

"»6 24

9г) 9 J,,97 г

285 I . 3 .3 „ .:; 12

Таблица 2 вЂ” г лонь»гибридом, » ,"уциру,ощие мю

Оптическая плотность при 492 х 10 .-.м, Т»1зотип M!(A антиген в ИЭА

»гг

l-»

21 г12

Контрольные

MKA

1334

1007

1416

712

1013

1466

1011

1858

1317

1799

1389

1556

2359

1226

921

1349 иммунизацию животных и получение штамf408 t ибРиДом, o T Jt и ч а »Q Щ и Й c; R гег, НТо, с целью повышения надежности, экспрессию гена белка осуществляют в сингенных

5 эукариотических клетках-продуцентах, которыми проводят иммунизацию сингенных животных.

1054

364

812

354

346

499

491

703

848

-туг 8

794