Штамм актиномицета sтrертомuсеs lavendulae - продуцент протеолитических ферментов

 

Изобретение относится к биотехнологии , в частности к получению высокоактивного штамма - продуцента протеолитических ферментов. Штамм актиномицета Streptomyces lavendulae BKAM-S- 910 на среде следующего состава, г/л: кукурузная мука 10-20; пептон 0,5-1,8; сухие кормовые дрожжи 0,5-1; сернокислый магний 0,02-0,04; вода водопроводная остальное , синтезирует активные внеклеточные протеолитические ферменты, обладающие широким спектром действия. Протеолитическая активность культуральной жидкости составляет по Кунитцу 40-97 ПЕ/мл, фибринолитическая активность 3000 ед./мл, а полный лизис тромба проходит на 30-60 мин. Лиофилизированный ферментный препарат , полученный из культуральной жидкости , характеризуется следующей протеолитической активностью: по казеину 40-80 ПЕ/мл, по фибрину 5200 ед./мл; при концентрации препарата 1 мг/мл тромб лизируется за 5-10 мин. Синтезируемые штаммом активные внеклеточные протеазы могут быть использованы в кожевенной, пищевой промышленности и в медицине. (Л С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (st)s С 12 N 9/52, 1/20

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4772467/13 (22) 22.12.89 (46) 23.05.92. Бюл. N. 19 (71) Институт микробиологии АН СССР (72) А.А.Имшенецкий, С.B.Ëûñåíêî, Н.С.Демина, В.В.Коршунов и Г.А.Ширшова (53) 663.15(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

N 1615177, кл. С 12 и 1/20, 9/68, 1988.

Авторское свидетельство СССР

М 1010127, кл. С 12 N 15/00, 1981.

Патент СССР N. 1001862. кл. С12 N 9/48, 1983. (54) ШТАММ АКТИ HOMИLlЕТА

STREPTOMYCES LAVENDULAE — ПРОДУЦЕНТ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению высокоактивного штамма — продуцента протеолитических ферментов. Штамм актиИзобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для получения протеолитических ферментов.

Известен продуцент протеолитических ферментов Actinomyces sphегоides М8-2, который при культивировании на среде, содержащей глюкозу. цитрат натрия, сернокислый аммоний, сернокислое железо, имеет протеолитическую активность культуральной жидкости 2,48-2,76 ПЕ/мл. а лиофилизированного препарата — 2,76-3,3 ПЕ/мг (в 1 мкМ тирозина).

Недостатками данного продуцента являются невысокая протеолитическая активность культуральной жидкости и осажденного из нее препарата, а также низкая тромболитическая активность препара... Ж 1735364 А1 номицета Streptomyces lavendulae ВКАМ-S910 на среде следующего состава, г/л: кукурузная мука 10-20; пептон 0,5-1,8; сухие кормовые дрожжи 0,5-1; сернокислый магний 0,02-0,04; вода водопроводная остальное, синтезирует активные внеклеточные протеолитические ферменты, обладающие широким спектром действия, Протеолитическая активность культуральной жидкости составляет по Кунитцу 40-97 ПЕ/мл, фибринолитическая активность 3000 ед,/мл, а полный лизис тромба проходит на 30-60 мин, Лиофилизированный ферментный препарат. полученный из культуральной жидкости, характеризуется следующей протеолитической активностью: по казеину

40-80 ПЕ/мл, по фибрину 5200 ед./мл; при концентрации препарата 1 мг/мл тромб лизируется за 5-10 мин. Синтезируемые штаммом активные внеклеточные протеазы могут быть использованы в кожевенной, пищевой промышленности и в медицине. та (10 мг препарата растворяют тромб за

1 ч).

Наиболее близким по технической сущности к изобретению является штамм

Streptomyces caligosus DS 14486, При культивировании на питательной среде, содержащей пептон, дрожжевой экстракт, агар-агар, глюкозу, при рН 6,5 в течение

96 ч получают культуральную жидкость с активностью 20 RE/мл и осажденный из нее ферментный препарат с активностью

8-10 ПЕ/мг (в мкМ тирозина).

Недостатками штамма являются невысокая протеолитическая активность, обогащенная питательная среда и длительное время культивирования.

Цель изобретения — получение штамма актиномицета Streptomyces lavendulae ИН1735364

МИ-SV-36 — высокоактивного и родуцента протеолитических ферментов.

Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганиз-. мов под номером ВКПМ-$-910. Штамм выделен в ИНМИ АН СССР из почвенного образца. Штамм хранят в лиофилизированном состоянии на картофельном агаре или среде СР-1 с глюкозой.

Штамм характеризуется следующими морфологическими и физиолого-биохимическими признаками, Общая характеристика: аэробный, грамположительный, мицелиальный.

Мицелий воздушный, Картофельный агар. Белые или серовато-розовые колонии (цвет лаванды), субстратный мицелий бежевого цвета, воздушный мицелий хорошо развит, Овсяный агар. Колонии серовато-сиреневого цвета или белые, субстратный мицелий темно-бежевого цвета, воздушный мицелий хорошо развит, Сусло-агар. Рост умеренный, колонии

- светло-коричневые с развитым воздушным мицелием.

МПА. Колонии бежевого цвета, воздуш. ный мицелий слабо развит либо отсутствует.

Соевый агар, Рост хороший, колонии серо-розоватого цвета, субстратный мицелий коричневого цвета, воздушный мицелий хорошо развит.

Образование пигментов. Не наблюдается образование растворимых меланоидных пигментов на всех агаризованных и жидких средах, применяемых для культивирования.

Морфология спороносцев. Спороносцы в виде примитивных спиралей (1-2 витка), зрелые цепи содержат 10-15 спор, поверхность спор гладкая.

Физиолого-биохимические признаки.

Желатину разжижает, молоко коагулирует и пептонизирует. Сероводород и индол не образует. Нитраты не восстанавливает. В качестве источника углерода усваивает глюкозу, фруктозу, рафинозу, маннит, инозит, Слабо усваивает ксилозу, сахарозу и арабинозу. Источники азота: соли аммония и аминокислоты. На ломтиках картофеля и моркови наблюдается хороший рост. Оптимальная температура роста 26-28 С, При

37 С рост слабый, п ри 45 С рост отсутствует.

Штамм выращивают на дешевой питательной среде, содержащей, г/л: кукурузная мука 10-20; пептон 0,5-1,8; сухие кормовые дрожжи 0,5-1,0; MgSO< 7Н20

0,02-0,04; водо п роводн а я вода, р Н среды

6,4-6,8. Среду разливают по 50 мл в колбы

Эрленмейера объемом 250 мл, Количество посевного материала 107. Выращивание проводят на качалке (200 o6/мин) в течение

5 48-72 ч. Мицелий отделяют центрифугированием при 5000 об/мин. Протеолитическую активность определяют по методу

Кунитца и выражают в условных. единицах

ПЕ/мл, мг (в мкМ тирозина). Фибринолити10 ческую активность измеряют по диаметру зон ливиса по методу Аструпа, а тромболитическую активность — по времени лизирования in vitro экспериментально полученных тромбов из донорской крови.

15 Осаждение ферментов из культуральной жидкости осуществляют с помощью сульфата аммония. Полученный препарат лиофилизируют и хранят в запаянной ампуле при

-5 С.

20 Протеолитическая активность культуральной жидкости 40-97 ПЕ/мл, а лиофилизированного препарата 40-80 ПЕ/мг.

Фибринолитическая активность по плазмину 3000 ед./мл для культуральной жидкости

25 и 5200 ед/мг для препарата, В плазме крови активность полностью сохраняется. Полный лизис тромба in vitro культуральной жидкостью проходит за 30-40 мин, а 1 мг препарата — за 5-10 мин.

30 Пример 1. Штамм Streptomyces

lavendulae ВКПМ-S-910 выращивают на следующей питательной среде, г/л; кукурузная мука 10; пептон 0,5; сухие кормовые дрожжи

0,05; MgS04 7Н20 0,02; вода водопровод35 ная, рН 6,8. Среду разливают по 50 мл в колбы Эрленмейера объемом 250 мл. Количество внесенного посевного материала

10%. Выращивание проводят на качалке (200 об/мин) в течение 48 ч. Мицелий отде40 ляют центрифугированием при 5000 об/мин, Осаждение ферментов из культуральной жидкости осуществляют с помощью сульфата аммония 80 насыщения, Осадок отделяют центрифугированием при 5000 об/мин, 45 диализуют против дистиллированной воды и лиофилизируют, Протеолитическую активность определяют по Кунитцу и выражают в

ПЕ/мл, мг (в мкМ тирозина).

Протеолитическая активность культу50 ральной жидкости 40 ПЕ/мл, осажденного препарата 68 ПЕ/мг. Фибринолитическая активность культуральной жидкости по Аструпу 2900 ед,/мл, препарата 4800 ед,/мг.

Лизис тромба донорской крови in vitro куль55 туральной жидкостью проходит за 30 мин, а препаратом (1 мг, 740 мкг белка) — за 10 мин, Пример 2. Штамм Streptomyces

lavendulae ВКПМ-S-910 выращивают на питательной среде, г/л, кукурузная мука 15,0; пептон 0,7; сухие кормовые дрожжи 0,08;

1735364

35

45

Составитель А. Имшенецкий

Редактор Н. Гунько Техред М.Моргентал Корректор Т. Малец

Заказ 1793 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.; 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

MgSO4 0,03; вода водопроводная, рН 7,0.

Культивирование в течение 48 ч. Обработку культуральной жидкости и определение активностей проводят по примеру 1.

Протеолитическая активность культуральной жидкости 97 ПЕ/мл, а лиофилизирован ного препарата 80 ПЕ/мл.

Фибринолитическая активность культуральной жидкости достигает 3000 ед./мл, а препарата 5000 ед./мг. Лизис тромба культуральной жидкостью проходит за 25 мин, препаратом — за 5 мин.

Пример 3. Штамм Streptomyces

lavendulae ВКПМ-S-910 выращивают на питательной среде, г/л; кукурузная мука 20; пептон 1,0; сухие кормовые дрожжи 1,0;

MgS04 7HzO 0,05; вода водопроводная, рН 6,8. Среду разливают в колбы на 250 мл по 50 мл. Культивирование проводят на качалке (200 об/мин) при 28 С в течение 72 ч.

Отделяют культуральную жидкость и осаждают из нее ферменты сульфатом аммония

80 насыщения. Осажденный осадок диализуют и лиофилизируют, Протеолитическая активность культуральной жидкости 90 ПЕ/мл, препарата 63

ПЕ/мг. Фибринолитическая активность культуральной жидкости 2800 ед./мл, препарата 4700 ед./мг. Лизис тромба культуральной жидкостью проходит за 35-40 мин, 5 а препаратом (1 мг, 800 мкг белка) — за 5 мин.

Предлагаемый штамм позволяет получать высокую протеолитическую активность в культуральной жидкости и препарате при использовании дешевой, 10 экономически доступной питательной среды. Разрушение экспериментально полученных тромбов крови in vitro культуральной жидкостью проходит за 2040 мин, а препаратом — за 5-10 мин.

15 Протеазы, полученные с помощью предлагаемого штамма Streptomyces lavendulae

ВКПМ-S-910, могут быть использованы в кожевенной промышленности для обработки шкур крупного рогатого скота, а также в

20 медицине для лечения тромбоэмболитических заболеваний, для обработки ожоговых и гнойных ран, медицинских инструментов.

Формула изобретения

Штамм актиномицета Streptomyces

25 lavendulae ВКПМ-S-910 — продуцент протеолитических ферментов.