Способ получения ферментного препарата нигедазы

 

Изобретение относится к биотехнологии , в частности к способу получения ферментного препарата нигедазы. Цель изобретения - повышение липолитической активности и выхода целевого продукта, снижение его себестоимости. Способ заключается в том, что семена активируют водой , измельчают, обрабатывают ацетоном, экстрагируют, экстракт подвергают концентрированию ультрафильтрацией при 5 - 9°С и одновременно фракционированию на фракции, содержащие целевой продукт с мол.м. 15 - 100 тыс. дальтон и пермеат, который используют в качестве экстрагента в соотношении 2:1 с водно-аммиачным раствором . 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 9/18

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИ4ЕТЕЛЬСТВУ

2 (21) 4801266/13 (22) 12,03,90 (46) 15.06,92, Бюл,¹22 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии (72) В.И,Федоренко, Б,А.Устинников, Т.В.Сушинская, Л.M.Гухман и А.Н.Переяславец (53) 577.15 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

¹ 1118673, кл. С 12 N 9/18, 1982.

Авторское свидетельство СССР № 142090, кл. С 12 N 9/18, 1986. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА НИГЕДАЗЫ

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения ферментного препарата нигедазы.

Известен способ получения ферментного препарата нигедазы из семян чернушки дамасской (Nigella damascena L.), предусматривающий измельчение сырья, обработку его ацетоном и экстракцию фермента из полученного ацетонового порошка водным раствором аммиака с последующей лиофилизацией целевого продукта.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения ферментного препарата нигедазы из семян растений вида

Nigella damascena „предусматривающий активацию семян водой, измельчение их, обработку ацетоном, экстракцию фермента водно-аммиачным раствором и сублимационную сушку.

Однако по известному способу получают нигедазу с недостаточно высокой липолитической активностью, поскольку в

„„!Ы „, 1740417 А 1 (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения ферментного препарата нигедазы. Цель изобретения — повышение липолитической активности и выхода целевого продукта, снижение его себестоимости. Способ заключается в том, что семена активируют водой, измельчают, обрабатывают ацетоном, экстрагируют, экстракт подвергают концентрированию ультрафильтрацией при 5 — 9 С и одновременно фракционированию на фракции, содержащие целевой продукт с мол,м, 15 — 100 тыс. дальтон и пермеат, который используют в качестве экстрагента в соотношении 2:1 с водно-аммиачным раствором. 2 табл, экстракте содержится много балластных сухих веществ, которые снижают активность целевого продукта, а также имеет место загрязнение окружающей среды продуктами продувки водно-аммиачного экстракта, содержащими активную субстанцию фермента нигедазы.

Цель изобретения — повышение липолитической активности и выхода целевого продукта, а также снижение его себестоим сти.

Для достижения указанной цели концентрирование водно-аммиачного экстракта фермента осуществляют путем ультрафильтрации при 5 — 9 С с одновременным разделением экстракта на фракции, одна из которых содержит целевой продукт с мол,м, 15 — 100 тыс.дальтон, а другая — пермеат, который рециркулируют на стадию экстракции в качестве экстрагента в смеси с водно-аммиачным раствором в соотношении 2:1.

1740417

Способ заключается в следующем.

Семена Nigella damascena L. взвешивают и загружают в аппарат, имеющий термостатирующее устройство, Слой семян заливают водой и выдерживают при

37 + 2 С в течение 24 ч, проводят активацию семян. После этого воду сливают, влажные семена выгружают и подают на измельчение до частиц размером 0,3 — 0,4 мм. Измельченные семена загружают в аппарат и заливают ацетоном для их обезжиривания в течение 30 мин при 7 +.2 С.

После этого ацетон сливают, семена вакуумируют для удаления следов ацетона, Обезжиренные семена загружают в аппарат с мешалкой, в который подают десятикратный объем дистиллированной воды с добавкой водного раствора аммиака (экстрагент имеет рН 10,5), Процесс экстракции ведут при 5 — 9 С в течение 35 5 мин. После этого содержимое аппарата подают на фильтрацию для отделения отработанных измельченных семян и получают слабый водно-аммиачный экстракт с содержанием сухого вещества около 1 /,. Полученный экстракт поступает на УФ-установку, где его подвергают концентрированию до содержания сухих веществ 8 — 8,5% при температуре экстракции 5 — 9 С с одновременным фракционированием и получением двух продуктов; целевого с липолитической активностью 750 Л Е! мг и мол,м, 15 — 100 тыс,дальтон и фильтрата, содержащего балластные вещества, не обладающие липолитической активностью, который возвращают на стадию экстракции семян в смеси с водно-аммиачным раствором в соотношении 2:1.

Пример 1. Семена в количестве 500 г экстрагируют смесью водно-аммиачного раствора в количестве 630 см и фильтрата в количестве 1260 см . Получают 1780 см экстракта с содержанием сухого вещества

0,96%. Данный экстракт направляют на фракционирование и коцентрирование в

УФ-установку полуволоконного типа с мембранами ВПУ-15 на основе фенилона. Эти мембраны задерживают растворение вещества с минимальной мол,м, 15 тыс.дальтон при селективности 98 . Процесс фракционирования и концентрирования осуществляют при 5 С и 0,015 МПа до содержания сухих веществ в концентрате 8,1 с переходом в фильтрат растворенных веществ с мол.м. 10 тыс,дальтон, не обладающих липолитической активностью и являющихся балластом, Полученный фильтрат в количестве 1580 см возвращают на стадию экстракции, целевой продукт в количестве 200 см с содержанием сухих веществ 8,1 u з активностью 750 ЛЕ/мг направляют на сублимационную сушку, которую проводят ступенчато при температуре от минус 45 до

5 плюс 30 С. Из 700 см исходного экстракта о з получают 6,7 r готового препарата с актив ностью 121 Л Е/мг, Из 200 см концентрированного экстракта получают 16,5 г готового препарата с активностью 750 ЛЕ/мг. В

10 фильтрат перешло 0,5 r растворенных сухих веществ, не обладающих липолитической активностью, Таким образом, при повышении липолитической активности препарата

s 6 раз удельный выход его с единицы высу15 шиваемого сублимацией экстракта увеличился с 6,7:0,7 = 9,57 г/дм до 16,5:0,2 = 82,5 г/дм, т,е. в 8,62 раза. Соответственно в 8;62 раза сократятся энергозатраты на сублимационную сушку.

20 Пример 2. Процесс экстракции и сушки ведут по примеру 1, а фракционирование и концентрирование осуществляют на УФ-установке с мембранами ВПУ-50 на основе фенилона при 9 С до содержания

25 сухого вещества 8,0 . Эти мембраны задерживают растворенные вещества с минимальной мол.м. 50 тыс.дальтон, Целевой продукт имеет активность 520 ЛЕ/мг, а фильтрат — 240ЛЕ/мг, Из700см исходного

30 экстракта получают 6,8 г готового продукта с активностью 124 ЛЕ/мг, из 140 см концентрированного экстракта получают 11,5 r готового препарата с активностью 520

Л Е/мг. В фил ьтрат перешло 5,5 г растворен35 ных сухих веществ и его липолитическая активность составила 240 ЛЕ!мг, что недопустимо.

Пример 3. Процесс экстракции и сушки ведут по примеру 1, а фракциониро40 вание и концентрирование осуществляют при 7 С до содержания сухих веществ 8,0% на УФ-установке с мембранами ВПУ-100 из фенилона. Эти мембраны задерживают растворенные вещества с минимальной мол.м.

45 100 тыс,дальтон, Из 700 см исходного экстракта получаз ют 7 г готового препарата с активностью 126

ЛЕ/мг, Из 30 см концентрированного эксз тракта получают 2,5 г готового препарата с

50 активностью 12 ЛЕ/мг. В фильтрат перешло

14,5 r растворенных сухих веществ и его липолитическая активность составила 124

ЛЕ/мг, т,е. практически все растворенные вещества, определяющие активность пре55 парата, перешли в фильтрат. Таким образом, верхний предел молекулярных масс растворенных веществ, определяющих активность препарата, составляет 100 тыс,дальтон, 1740417

Указанные параметры являются оптимальными, так как, если вести процесс фракционирования и концентрирования до содержания сухого вещества, с мол.м. менее 15 тыс. и более 100 тыс,дальтон, то в целевом продукте накапливаются балластные вещества, что снижает активность препарата. Балластные вещества с мол.м, свыше 100 тыс.дальтон при концентрировании свыше 1% сухих веществ слипаются и образуют коллоидную фазу, которая отделяется на стадии предварительного фильтрования. Температура 5 — 9 С является также оптимальной, так как при температуре меньше 5 С резко снижается скорость ультрафильтрации, а при температуре выше

9 С снижается стабильность нигедазы-субстанции вследствие ее закисания.

В табл, 1 и 2 приведены показатели процесса.

Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает высокий выход продукта с высокой липолитической активностью.

Таблица 1

Степень концентрирования, содержание сухих веществ в концентрате, %

Фильтрат

Целевой продукт

50

126

126

100

20

16

0,5

Степень фракционирования, максимальная молекулярная масса растворенных веществ, перешедших в фильтрат, тыс. дальтон

Температура, С 5

Время хранения, ч 40

0,7

1,1

2,8

3,6

5,4

6,4

7,2

8,3

0,96

2,4

3,7

5,0

6,2

7,4

8,1

0,94

1,6

2,8

4,2

6,0

7,2

8,0

0,98

3,2

5,8

7,0

Формула изобретения

Способ получения ферментного препарата нигедазы из семян растений вида

Nigella damascena L., предусматривающий

5 активацию семян водой, измельчение их, обработку ацетоном, экстракцию фермента водно-аммиачным раствором, фильтрование, концентрирование. и сублимационную сушку экстракта, отличающийся тем, 10 что, с целью повышения липолитической активности и выхода целевого продукта, а также снижения его себестоимости, концентрирование водно-аммиачного экстракта фермента осуществляют путем уль15 трафильтрации при 5 — 9 С с одновременным разделением экстракта на фракции, одна из которых содержит целевой продукт с мол.м. 15 — 100 тыс.дальтон, а другая — пермеат, который

20 рециркулируют на стадию экстракции в качестве экстрагента в смеси с водно-аммиачным раствором в соотношении 2:1.

Липолитичечкая активность, ЛЕ/мг

112

121

118

126

126

126

124

124

1740417

Таблица 2

Составитель Э.Шахтимир

Техред М.Моргентал КоРРектоР О.Кравцова

Редактор Т.Лазоренко

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 2051 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5