Способ выделения глутамина

 

Использование: в биотехнологии при получении глутамина, применяемого в пищевой и медицинской промышленности. Сущность изобретения: культуральную жидкость нейтрализуют при перемешивании фосфорной кислотой и фильтруют. Обессоленный фильтрат пропускают через колонку , заполненную катионитом КУ 2x8 в Н+-форме. Отсорбированный глутамин элюируют с колонки раствором щелочи и затем выделяют его кристаллизацией из щелочного элюата. Выход продукта 75 - 80%, чистота не менее 98,5%.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (sl)s С 12 P 13 14

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4869320/13 (22) 27.09.90 (46) 15.06.92, Бюл, ЬЬ22 (71) Всесоюзный научно-исследовательский проектно-конструкторский институт прикладной биохимии (72) Э.M.Тер-Саркисян, Н.Н.Петухова, P,О.Алиева, Л.Н,Макаренко и А.М.Кузьмин (53) 547.965 (088.8) (56) Патент Франции

М 1470219, кл. С 12 P 13/14, 1965.

Заявка Японии

М 49-18828, кл. С 12 P 13/14, 1982.

Регламент на способ выделения глутамина на Бердском химическом заводе, утв.

05.08.88.

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения глутамина, используемого в пищевой и медицинской промышленности, конкретно выделения его из культуральной жидкости.

Известен способ ионообменного выделения глутамина, заключающийся в том, что культуральную жидкость подкисляют Н С1 до рН 3,5 и фильтруют. Фильтрат пропускают через колонну с сильнокислотным катионитом для сорбции глутамина, последний элюируют слабым раствором аммиака, который отпаривают под вакуумом; раствор концентрируют при дальнейшем упаривании, очищают углем и дважды кристаллизуют из спирта.

Недостатки этого способа состоят в том, что будучи неустойчивым в кислой среде.глутамин частично разлагается в процессе сорбции, так как рН в фазе сильнокислотного катиона достигает 0,5 — 0,7. Упаривание расÄÄ5UÄÄ 1740419 А1 (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ГЛУТАМИНА (57) Использование: в биотехнологии при получении глутамина, применяемого в пищевой и медицинской промышленности.

Сущность изобретения: культуральную жидкость нейтрализуют при перемешивании фосфорной кислотой и фильтруют. Обессоленный фильтрат пропускают через колонку, заполненную катионитом КУ 2х8 в

Н -форме. Отсорбированный глутамин элюируют с колонки раствором щелочи и затем выделяют его кристаллизацией из щелочного элюата. Выход продукта 75 — 80%, чистота не менее 98,5О . твора также приводит к частичному разложению глутамина. В результате перечисленных факторов в процессе очистки теряют

30 — 40 препарата.

Известен способ выделения глутамината из растворов, состоящий в том, что раствор глутамина очищают от неорганических солей в электродиализаторе при рН 5,5 — 5,6 и затем кристалл изуют.

Однако злектродиалиэ не освобождает глутамин от органических и пигментных примесей культуральной жидкости, которые препятствуют кристаллизации. Поэтому данный метод не может самостоятельно быть использован в качестве промышленного способа производства глутамина, Наиболее близким к предлагаемому является способ выделения глутамина, предусматривающий ионообменную колоночную хроматографию фильтрата культуральной жидкости, очистку от приме1740419 сей полученного глутаминсодержащего элюата и кристаллизацию целевого продукта.

Основной недостаток способа состоит в многостадийности процесса и больших потерях целевого продукта вследствие разложения в процессе сорбции на катионите и вы парки, Целью изобретения является упрощение способа и повышение выхода целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения глутамина, предусматривающему ионообменную колоночную хроматографию фильтрата культуральной жидкости, очистку от примесей полученного глутаминсодержащего элюата и кристаллизацию целевого продукта, после очистки из глутаминсодержащего элюата сорбируют глутамин на смоле Ку 2х8 в Н+форме и элюируют его раствором щелочи, а кристаллизацию проводят непосредственно из щелочного элюата.

Сущность предложенного способа состоит в следующем.

Культуральную жидкость нейтрализуют при перемешивании фосфорной кислотой до рН 5,5 — 6. При этом суспензия расслаивается и ее фильтруют. Фильтрат пропускают через колонну с катионитом в Н -форме и глутамин сорбируется вместе с посторонними катионами. Затем через колонну пропускают 2,5 — 3,5 ф,-ный аммиак и получают элюат глутамина, не содержащий солей. Аммиак отпаривают под вакуумом. Нативный раствор можно обессолить другим методом — пропуская его с высокой скоростью через ряд последовательно соединенных пар: катионит Ку 2х20 в Н -форме и анионит ЭДЕ10 п в ОН форме, В этом случае происходит и частичное осветление нативного раствора. Расход смолы в обоих вариантах обессоливания почти одинаков, Обессоленный раствор пропускают через осветляющую колонну с ионитом ИА-1 и затем через колонну с катионитом Ку 2х8 в Н -форме, который полностью насыщается глутамином. Последний элюируют 1 — 2 н.щелочью, причем рН элюата держится на уровне 5,6 — 6,0, что соответствует изоэлектрической точке глутамина. Поскольку концентрация глутамина в элюате превышает в 6 — 8 раз его растворимость, а раствор не содержит посторонних примесей, начинается кристаллизация.

Выпавшие белые иглообразные кристаллы центрифугируют до влажности 18 — 20 .

Чистота продукта не менее 98,5 . Конец сбора глутамина при элюции — бедную фракцию вместе с маточником присоединя5

3О

55 ют к обессоленному раствору перед осветлением. Общий выход продукта 75 — 807.

Пример 1. 5 л культуральной жидкости с концентрацией глутамина 38 г/л заливают в емкость с мешалкой и постепенно вводят концентрированную фосфорную кислоту (55 мл) до рН 6,0. В результате суспензия расслаивается за счет превращения мела в фосфат кальция. Суспензию фильтруют на нутч-фильтре и промывают осадок 200 мл воды. Получают 320 r осадка влажностью

62 и 4,9 л фильтрата с концентрацией глутамина 35 г/л и содержанием посторонних катионов 700 мг-экв/л. Для обессоливания используют систему последовательно соединенных стеклянных колонн емкостью 10 мл каждая. Соединялись последовательно пары: катионит Ку 2х20 в Н -фрме — анионит

ЭДЕ-10 и в ОН - форме, Скорость раствора в системе 5,0 л/ч. Глутамин не сорбируется на смоле Ку 2х20 и, учитывая малое время контакта (3 — 4 мин) не разлагается в зоне ионита. Сохранность глутамина подтверждается методом тонкослойной хроматографии. Раствор с колонн вытесняется водой.

Начало и конец сбора обессоленного нативного раствора согласуют с коэффициентом рефракции, который должен в начале достигать значения 1,334 и в конце опускаться до

1,335. После обессоливания получают 6,1 л раствора с концентрацией глутамина 26,6 г/л и солей 25 мг-экв/л. Затем его пропускают со скоростью 4 объема через стеклянную колонну емкостью 4 мл со смолой ИА-1 в

CI-форме. Сбор осветленного раствора контролируют также как при обессоливании.Получают 6,5 л бесцветного раствора с концентрацией глутамина 24,2 г/л. Раствор пропускают через ионообменную колонну емкостью 600 мл со смолой Ку 2х8 в Н+-форме, Глутамин на выходе с колонны контролируют количественно методом ТСХ. B процессе сорбции глутамин полностью заполняет колонну без проскока в фильтрат.

Колонну промывают одним объемом воды и элюируют 1 л 1 н, раствора щелочи. Сбор богатой фракции начинают при значении коэффициента рефракции 1,335 и заканчивают при значении 1,338. Получают 930 м раствора глутамина с рН 6,1 и концентрацией 158 г/л, Далее отбирают бедную фракцию до значения 1,334. Всего собирают 170 мл бедной фракции с концентрацией глутамина 35 г/л. Богатая фракция охлаждается до +5OC и через 10 ч из нее выпадают кристаллы. Их отжимают на центрифуге. Получают 160 r кристаллов с влажностью 190.

Продукт подсушивают при 30 С под вакуумом до влажности 1;ь. В итоге получают 131 г препарата с содержанием глутамина

1740419

Составитель О.Комарова

Редактор Т.Лазоренко Техред М.Моргентал КоРРектор О Кравцова.

Заказ 2051 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

98,5$. Продукт мало отличается по внешнему виду, физико-механическим и химическим характеристикам от препарата фирмы

"Серва". Выход от исходного количества глутамина 70 . Но поскольку 780 мл мэточника с концентрацией глутамина 22 г/л и

170 мл бедной фракции направляются снова в процесс на стадии.осветления нативного раствора и не являются потерями, реальный выход продукта составляет 80 .

Пример 2. 5л культуральной жидкости с активностью 36 г/л обрабатывают и фильтруют как в примере 1. получив 4,8 л нативного раствора с концентрацией глутамина

34 г/л. Раствор пропускают со скоростью

2,5 л/ч через стеклянную колонну диаметром 7 см, высотой 65 см, в котоочю было загружено 2,5 л смолы Ку 2х8 в Н+- форме, В фильтрате глутамина не обнаружено.

3люцию глутамина осуществляют 2,5 ным раствором аммиака в количестве 3 л.

Получают 2,6 л раствора с рН 10,8, концентрацией глутамина 46 г/л и содержанием посторонних катионов 20 мг-экв/л. Раствор упаривают до 1,5 л и концентрации 92 г/л и пропускают через колонну емкостыс 400 мл со смолой ИА-1 в СГформе. Получают 1,8 л полностью обесцвеченного раствора с концентрацией глутамина 74 г/л. Осветленный раствор пропускаютдо полного поглощения глутамина через колонну с 600 мл смолы Ку

2х8 в Н -форме. Глутамин элюируют 0,9 л 1 н.раствора щелочи. Собирают 780 мл бога5 той фракции с концентрацией 155 г/л и 220 мл бедной фракции с концентрацией 36 г/л.

После кристаллизации глутамина из богатой фракции получают 103 г сухих кристаллов чистоты 98,5$ с выходом 57 jf от исходного

10 количества. 280 мл бедной фракции с концентрацией 38 г/л и 67 мл маточника с концентрацией 27,8 г/л возвращают в процесс, Таким образом, полный выход продукта

72 .

Формула изобретения

Способ выделения глутамина, предусматривающий ионообменную колоночную хроматографию фильтрата культуральной

20 жидкости, очистку от примесей полученного глутаминсодержащего элюата и кристаллизацию целевого продукта, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения способа и повышения выхода целевого продукта, по25 сле очистки из глутаминсодержащего элюата сорбируют глутамин на смоле Ку 2х8 в

Н -форме и элюируют его раствором щело+ чи, а кристаллизацию проводят непосредственно из щелочного элюата.