Способ активации галактозооксидазы

 

Использование: пищевая промышленность и медицина. Сущность изобретения: для повышения активности галактозооксидазы готовят растворы этого фермента в 0,05М фосфатном буферном растворе (рН 7,0), содержащем в качестве активатора этилендиаминтетраацетатный комплекс меди (Cu-ЭДТА) в концентрации - моль/л. В пределах данного интервала концентрации Cu-ЭДТА в растворе фермента коэффициент повышения активности последнего превышает известный в 1,5 - 2,0 раза. В присутствии Cu-ЭДТА фермент сохраняет активность при комнатной температуре в течение 2-3 сут. Предлагаемый способ позволяет повысить точность и достоверность определения галактозы в биологических жидкостях. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4844241/13 (22) 25,06.90 (46) 23.06.92. Ьюл. М 23 (71) Институт химии поверхности АН УССР (72) Л.В. Кондакова, B.В. Янишпольский, В.А. Тертых и Т.Т. Буглова (53) 577.15(088.8) (56) Патент США М 4220503, кл. С 12 Q 1/54, 1980..

F. Copper. $ирегохЫе апб galactoze

oxldase — G. Апиг. Chem. Soc., 1978, 100, 6, р. 1899 — 1912. (54) СПОСОБ АКТИВАЦИИ ГАЛАКТОЗООКСИДАЗЫ (57) Использование: пищевая промышленность и медицина. Сущность изобретения:

Изобретение относится к биохимии, в частности к способам активирования ферментов, и может быть использовано в пищевой промышленности и медицине.

Известно активирующее воздействие на галактозооксидазу феррицианида калия, Известен способ активации фермента галактозооксидаэы в растворе, при котором в качестве активирующих агентов использу ют NaJOs, К2СГ207, NaJ04, Кз(Со(й02))6in йа2Мо04 2H20 и дополнительно идны меди, При этом наблюдается повышение активности фермента галактозооксидазы в растворе относительно исходной в 3 раза.

Известны способы активации галактозооксидазы в растворе, включающие введение в раствор фермента трилона Б,.или смеси феррицианида калия с каталазой, или смеси феррицианида калия с ЭДТА.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предла Ы Il 742328 Al (и)э С 12 N 9/04, 13/00, 1/38 для повышения активности галактозооксидазы готовят растворы этого фермента в

0,05М фосфатном буферном растворе (рН

7,0), содержащем в качестве активатора этилендиаминтетраацетатный комплекс меди (Cu — ЭДТА) в концентрации 4 10 — 4 ° 10 моль/л, В пределах данного интервала концентрации Си-ЭДТА в растворе фермента коэффициент повышения активности последнего превышает известный в 1,5 — 2,0 раза. В присутствии Си-ЭДТА фермент сохраняет активность при комнатной температуре в течение 2 — 3 сут. Предлагаемый способ позволяет повысить точность и достоверность определения галактозы в биологических жидкостях. 1 табл. гаемому является способ активации галактозооксидаэы раствором хлороиридата натрия, К раствору галактозооксидазы в

° виай фосфатном буферном растворе (рН 7,0) прибавляют раствор хлороиридата натрия (Na2lrClg), Полученный раствор обладает повышенной ферментативной активностью, В интервале концентраций хлороиридата 1 Сд

-I 0+-1 10 моль/л в растворе активность фермен..-та увеличивается в 30,7 — 32,1 раз. Этот (ф коэффициент повышения активности галактозооксидазы является максимальным для известных активаторов галактозооксидаэы.

Недостатком известного способа является небольшой коэффициент повышения активности галактозооксидазы.

Целью изобретения является повышение активности галактозооксидазы, Поставленная цель достигается тем, что согласно способу активации галактозооксидаэы, включающему введение в буферный

1742328

3 раствор фермента добавки, в качестве добавки берут этилендиаминтетраацетатный комплекс меди с концентрацией 4 10

-5

-4 10 моль/л в активируемом растворе галактозооксидазы.

Для реализации способа используют

QuClz 2H20 квалификации х.q., этилендиаминтетраацетат натрия (трилон Б), ЭДТА квалификации х.ч., галактозу квалификации х.ч., фермент галактозооксидазы, выделенный из FusatIum graminearum

ИМВ-F-1060, в качестве .буферного раствора используют 0,05 M Na фосфатный буфер (рН 7,0);

Фермент галактозооксидаза получен по известному методу.

Активность лиофильно высушенного порошка фермента составляет 0,1 ед/мг.

Активность раствора фермента регистрируют по проявляемой активности. Активность галактоэооксидазы определяют в растворе гапактозы с концентрацией 0,1 моль/л в

0,05 M фосфатном буферном растворе (рН

7.0). Для этого в термостатированную при

25 С ячейку с кислородным электродом

Кларка помещают 5,5 мл соответствующего раствора галактоэы. После термостатирования прибавляют 0,5 мл раствора фермента и регистрируют на ленте самописца кинетику потребления кислорода (1 ед. активности соответствует количеству фермента, катализирующего окисление 1 мкмоль субстрата за 1 мин).

Активность фермента в присутствии солей меди (II) осуществляют следующим образом, Готовят растворы галактозооксидазы в

0 05 М фосфатном буферном растворе (рН

7,0), дополнительно содержащие этилендиаминтетраацетатный (ЭДТА) комплекс меди с различными концентрациями (3 10 — 1

«10 моль/л). К 5,5.мл 0,1 M. раствора галактозы в термостатируемой ячейке с кислородным электродом Кларка прибавляют 0,5 мл раствора фермента с добавкой. Активность определяют как и для раствора без добавок.

Для характеристики эффекта повышения активности фермента с активирующими добавками в растворе по отношению к активности исходного раствора используют коэффициент повышения активности(К), который равен отношению активности фермента в активируемом растворе к исходной активности фермента в растворе.

Пример 1. В термостатированной при 25ОC ячейке определяют активность галактозооксидазы в буферном растворе, который содернсит 0,1 моль/л галактозы и 1.

5 10 моль/л ЭДТА комплекса медиДля расчета коэффициента повышения активности параллельно определяют активность галактозооксидазы в 0,1 моль/л растворе галактозы без добавки ЭДТА комплекса ме10 ди.

П р им е р ы 2 — 7..Проводят по примеру

1, но изменяют концентрацию ЭДТА комплекса меди в растворе фермента.

Пример 8, В термостатированной

15 ячейке к 5,5 мл раствора галактозы прибавляют 0,5 мл раствора фермента с добавкой хлороиридата натрия.

Данные влияние ЗДТА комплекса меди на активность галактозооксидазы по приме20 рам 1 — 8 приведены в таблице.

Приведенные в таблице данные показывают, что в пределах предлагаемого интервала концентрации ЭДТА комплекса меди в растворе фермента коэффициент повыше25 ния активности фермента выше, чем у известного (примеры 2 — 4). 3а пределами предлагаемого интервала (примеры 1, 5 и 6) цель не достигается.

Дополнительными опытами, в которых

30 Си-ЭДТА добавляют непосредственно в раствор галактозооксидаэы обнаружен неожиданный эффект повышения стабильности раствора фермента в присутствии Си-ЭДТА.

Если раствор фермента без добавки Си-ЗД35 ТА теряет свою активность за 7 — 8 ч, то в присутствии Си-ЗДТА фермент сохраняет активность при комнатной температуре в течение 2 — 3 сут.

Таким образом, предлагаемый способ

40 активирования галактозооксидазы позволяет получить высокоактивный фермент в растворе. Применение предлагаемого способа позволит повысить точность и достоверность определения галактозы в биологиче45 ских жидкостях.

Формула изобретения

Способ активации галактозооксидазы введением активатора в раствор фермента в 0.05 М фосфатном буфере с рН 7,0. о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения активности целевого продукта, в качестве активатора используют этилендиаминтетраацетатный комплекс меди в концентрации 4 10 — 4 10 моль/и.

1142328

*Хлороиридат натрия

Составитель Л,Кондакова

Техред М.Моргентал Корректор М.Демчик

Редактор И.Дербак

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 2262 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5