Способ количественного определения @ -экзотоксина и инсектицидного экзогенного метаболита в энтомоцидных бактериальных препаратах

 

Использование: производство энтомопатогенных бактериальных препаратов, контроль инсектицидной активности. Сущность изобретения: препарат растворяют в воде, удаляют твердые частицы центрифугированием , в фугат вносят аммиак до рН 7.1- 7,3, раствор центрифугируют, при этом в твердой фракции (осадке) содержится экзогенный метаболит, в жидкой -/ -экзотоксин . В жидкую фракцию вносят хлористый барий для связывания / -экзотоксина, отделяют осадок в виде бариевой соли экзотоксина центрифугированием. К осадку добавляют раствор серной кислоты, затем рН доводят до 7,2 раствором аммиака и центрифугируют , отделяя жидкую фракцию, содержащую -экзотоксин, и вводят в нее соляную кислоту до рН 4,6-4,8.0садок, содержащий экзогенный метаболит, растворяют подкисленным соляной кислотой этиловым спиртом, центрифугируют, отделяют осадок, затем его растворяют и доводят рН раствора до 3,4-3,6. Водные растворы /3-экзотоксина и экзогенного метаболита фотометрируют и определяют оптическую плотность растворов при 259, 310, 340 нм, Затем рассчитывают количества экзотоксина и метаболита. Способ позволяет повысить точность определения содержания компонентов в энтомоцидном препарате . 2 табл.

СОЮЗ СО8ЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК.

ГОСУДАРСТВЕ ННЬ!Й КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ,И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР i 709 2

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4720982/13 (22) 21.07.89 (46) 07.07.92. Бюл. N. 25 (71) Московский лесотехнический институт (72) Е.И.Ефимцев и Г.П.Буров (53) 576.8 (088,8). (56) Авторское свидетельство СССР

М 1355974, кл. 6 01 N 33/50, 1985. (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ )3-ЭКЗОТОКСИНА И ИНСЕКТИЦИДНОГО ЭКЗОГЕННОГО МЕТАБОЛИТА

В ЭНТОМОЦИДНЫХ БАКТЕРИАЛЪНЫХ.

ПРЕПАРАТАХ (57) Использование: производство энтомопатогенных бактериальных препаратов, контроль инсектицидной активности. Сущность изобретения: препарат растворяют в воде„удаляют твердые частицы центрифугированием, в фугат вносят аммиак до рН 7,17,3, раствор центрифугируют, при этом в твердой фракции (осадке) содержится экзо енный метаболит, в жидкой - P -зкзоток- син. В жидкую фракцию вносят хлористый

Изобретение относится к способам анализа нуклеотидных инсектицидных компонентов биопрепаратов и может быть использовано для контроля содержания рэкзотоксина и дополнительно инсектицидного компонента в биопрепаратах, при отборе штаммов — продуцентов микроорганизмов, подборе питательных сред, контроле биосинтеза экзогенных метаболитов, оптимизации параметров биотехнологического процесса получения инсектицидного биопрепарата иа всех этапах промышленного производства, контроле его состояния в процессе хранения, при оценке характера воздействия на растения с целью установле... Ы,, 1745172 А1 (si>s A 01 N 6ЗГ00. С 12 0 1 00, G 01 и барий для связывания j3--экзотоксина, отделяют осадок в виде бариевой соли экзотоксина центрифугированием, К осадку добавляют раствор серной кислоты, затем рН доводят до 7,2 раствором аммиака и центрифугируют, отделяя жидкую фракцию, содержащую Р-.экзотоксин, и вводят в нее соляную кислоту до рН 4,6-4,8.Осадок, cqдержащий экзогенный метаболит, растворяют подкисленным соляной кислотой этиловым спиртом, центрифугируют, отделяют осадок, затем его растворяют и доводят рН раствора до 3,4-3,6, Водные растворы Р-экзотоксина и экзогенного метаболита фотометрируют и определяют. оптическую плотность растворов при 259, 310, 340 нм, Затем рассчитывают количества экзотоксина и метаболита, Способ позволяет повысить точность определения содержания компонентов в энтомоцидном препарате. 2 табл.

«4 ния его экологической безопасности M научно-исследовательской практике. (л

Известен способ определения Р-экзо- а токсина в инсектицидных биопрепаратах, с включающий в себя осаждение смеси нуклеотидов, растворение осадка с последующим хроматографическим разделением на пластинах в системе растворителей прапанолвода-аммиак, взятых в соотношении 13:5:2.

Элюцию пятен проводят водой с рН.3-6,6 и измерение оптической плотности при 254 нм или 267 нм.

Недостатками известного способа являются трудоемкость, связанная с использованием хроматографии, высокая абсолютная погрешность вследствие по1745172 терь определяемого вещества на поверхности хроматографической пластины, потерь в . процессе его выделения из препарата, падение фотометрической точности измерений вследствие значительного вклада в абсолютную величину измеряемой оптиче-. ской плотности раствора светорассеяния, возникающего от смываемых в кювету частиц силикагеля с пластин SIIufo1-254, а также отсутствие представлений по механизму взаимодействия P-ýêçoòoêñèíà с другим инсектицидным метаболитом, близкой ему природы, в литературе, зависящего от изменения рН среды в процессе ферментации и анализа.

Цель изобретения — повышение точности способа.

Способ заключается в следующем.

Этап I. Операция 1. Навеску препарата (1 г), взвешенную с точностью до 0,001 r растворяют в 20 мл воды или берут 20 мл культуральной жидкости и доводят их рН соляной кислотой до 4,7 «-0,1, затем центрифугируют (6000 об/мин) и отбрасывают твердые остатки.

В надосадочной жидкости остаются Рэкзотоксин (ЭТ-1), инсектицидный метаболит — экзотоксин-2 (ЭТ-2) адениновой природы, близкой ЭТ-1, а также и другие метаболиты. Операция 2. Проводится отделение ЭТ2 от. ЭТ-1 путем, смещения рН надосадочной жидкости до 7,2+ 0,1 водным раствором аммиака (15;ь), раствор центрифугируют . {6000 об/мин), в осадке — 3T-2, в надосадочной жидкости 3Т-1 и другие метаболиты.

Операция 3, ЭТ-1 в надосадочной жид.кости связывают хлористым барием (BaCI2, 20 j, 4 мл), центрифугируют (6000 об/мин), в осадке бариевая соль экзотоксина. К осадку добавляют 4 мл 0,1 н.раствора серной кислоты, перемешивают и доводят рН раствором аммиака (25 /,) до 7,2 и центрифугир у ют (6000 об /м и н}. В растворе

Р -экзотоксин, который доводят 1 н.соляной кислотой до рН 3,6 +.0,1, Операция 4. ЭТ-2 растворяют (после операции 2) в 20 мл подкисленного НО 96 этиловым спиртом (рН 5,4 0,1), перемешивают, центрифугируют (6000 об/мин), в осадке 3Т-2, очищенный от примесей,поглощающих около 280 нм.

Операция 5. ЭТ-2 растворяют в 20 мл дистиллированной воды и соляной кислотой доводят рН до 3,6+ 01.

Этап П. Водные растворы ЭТ-1 и ЭТ-2 в объеме 20 мл и рН 3,6 0,1 используют при спектрофотометрировании. Измерения проводят в кювете с длиной оптического пути 1 см.

Операция 1. В кювету вносят 3 мл дистиллированной воды, подкисленной соля5 ной кислотой до рН 3,6 "=0,1, и добавляют 200 мкл ЭТ-1.или ЭТ-2 и перемешивают.

Операция 2. Определяют величину оптической плотности растворов ЭТ-1, ЭТ-2 при 259, 310, 340 нм.

10 Операция 3. Обработка результатов спектральных измерений проводится по формуле (1); выведенной на основе графического расчета вклада светорассеяния раствора в спектр его оптической плотности, 15 Учет величины светорассеяния при Л=

=259 нм (в области максимального поглощения растворов ЭТ-1 и ЭТ-2) проводят путем линейной экстраполяции результатов измерения величины оптической плотности рас20 творов при Л-310и Л=340нм(поглощение

ЭТ-1 и ЭТ-2 отсутствует). Для выполнения графического расчета шкала длин волн должна быть равномерной в области 220-340 нм, для чего нм надо перевести в см, Для пе25 ревода нм используют известное соотношение г †(см ). Из подобия треугольников

10 нм на графике записывают равенство

0 з10 — О з4О . 0 259 — 0 з40

107 107 . 107 107

31 )40 259 340 где Do 1; Do — оптическая fllloTHOGTb фоЗ4О тометрируемых растворов при Л = 310 и Л =

35 =340 нм .

002 9 — рассчетная величина светорас сеяния при Л- 259 нм.

После преобразования выражения (1) пол. учаем

40 0 25 =3230 ю-2230 34О Р)

Истинное поглощение растворов ЭТ-1 и ЭТ2 находят по выражению

0эт-@т-2=0 -Dp =0 -3,23Do

259 259 259 ЗИМ+2,23 Оо (3)

45 где 0259 — измеренное значение оптической плотности фотометрируемых растворов при

Л= 259 нм.

Полученное значение оптической плот-. ности служит основой расчета концентра50 ций по формуле (3) согласно закону

Ламберта-Бера

0*эт-, -2- е С I, где я- коэффициент молярной экстинкции, еэт-1-13,4 10 (л/моль см);

55 С вЂ” концентрация;! — 1 см, или его иной записи Р+рт-1,эт-2 = е 1см С Г

1 тДе .е1см - — коэффиЦиент поглоЩениЯ 17

1, раствора чистого вещества ЭТ-1, равный

194 ч-4.

1745172

Определение концентрации экзотоксинов производится по формуле

С, г/л, (4)

0 К м где К вЂ” коэффициент;

К=М/н . В/ЩА, где M — количество дистиллированной воды в кювете при измерении ЭТ-1, ЭТ-2; н — количество вносимого вещества в кювету;

 — обьем раствора при измерении; А— коэффициент пропорциональности, получаемый при введении размерности (г/л) для

8 1ñì

Сэт-1,эт--2 = 3,125 Ьэт-1,эт-2 (мг/г), для сухого препарата, С3Т-1,3Т-2 = 0,781 0эт-1,зт-г (г/л), для культуральной жидкости.

Примечание *, е « - для ЭТ-2 пока

1ж, неизвестен и поэтому принят равным ЭТ-1 на том основании, что поглощение света молекулой каждого из двух токсинов осуществляется главным образом адениновым основанием.

Величина 0эт-1 или 0эт-2 не должна превышать 0,8 ед. при А = 259 нм.

Пример 1. Расчет ЭТ-1 и ЭТ-2 в сухом биопрепарате. Берут навеску сухого биопрепарата 1 г(Битоксибациллина, Лепидоцида или Дендробациллина) и проводят операции, указанные в этапах! и 1I, затем определяют оптическую плотность (3T-1 и

ЭТ-2) в точках спектра с длиной волны 259, 310 и 340 нм и осуществляют расчет,по формулам (3) и (4).

>ж9 = p 87 0 310 = p pg 0 340 = p p3

D = 0,224 — по расчету

0зт = 0,646; Сэт = 2,018 мг/г (0,2 ф).

Пример 2. Расчет ЭТ-1 или ЭТ-2 в культуральной жидкости. Берут 20 мл культуральной жидкости при производстве Битокаибациллина, Лепидоцида или

Дендробациллина и проводят- операции, указанные в этапах 1 и II, затем определяют оптическую плотность каждого из двух экзотоксинов в точках спектра с длинами волн

259, 310 и 340 нм, Проеодет расчет оо формуле 31

0 = 0,73; Dî = 0,06: 0о =,0,03;

0.2 5" 9 =0,13.

0эт-1 или эт-г = 0,6:

Сэт-1 или эт-2 = 0,469 г/л.

В ы в о д. Примеры 1 и 2 иллюстрируют порядок проведения расчетов и величин оптических плотностей при определении концентрации токсинов в энтомоцидных биологических препаратах, один иэ которых (Битоксибациллин) содержит два токсина, а два других — только ЭТ-2..

10

Вывод. Пример 3 показывает повышение точности определения бетаэкзотоксина за счет увеличения растворения и диссоциации комплекса ЭТ-1 и ЭТ-2 при рН

15 4,7 «-0,1.

Определяется количественно второй экзотоксин за счет его разделения с ЭТ-1 и удаления иэ раствора осаждением в щелочной среде. Этот токсин найден в ряде других

20 препаратов и определен впервые, что иллю50

Пример 3, Берут по 3 навески каждого из 3-х препаратов по 1 г и определяют ЭТ-1. и ЭТ-2 при различных двух фиксированных рН (6 и 4,7). Пример иллюстрирует повышение точности способа за счет растворения сухого препарата при фиксированном (4,7 + 0,1) рН среды с одновременным расширением его функциональной возможности — количественного определения ЭТ-2 (см.табл,1). стрирует расширение функциональной возможности способа.

Пример 4. Берут 15 навесок препарата битоксибациллина по 1 г и растворяют по 5 навесок в каждой из 3-х серий при 3-х различных рН.

В табл, 2 показана зависимость количественных показателей определения содержания ЭТ-1 в пробах битоксибациллина одной партии от рН среды при его растворении и отделении экзотоксинов друг от друга, Выводы. Пример демонстрирует увеличение точности определения количества ЭТ1 за счет более полного его выделения и отделения от ЭТ-2 с помощью использования фиксированных значений концентраций водородных ионов при растворении биопрепарата (4,7 -0,1) и разделении двух токсинов в их смеси (7,2 +. 0,1).

Формула изобретения

Способ количественного определения j3 экзотоксина и инсектицидного экзогенного метаболита в энтомоцидных бактериальных препаратах, предусматривающий добавление в раствор препарата кислоты, удаление нерастворимых веществ, .осаждение Р-экзотоксина хлористым барием, растворение бариевой соли Р-экзотоксина кислотой, определение оптической плотности раствора с последующим расчетом количества определяемых веществ, отл и ча ю щи йс я тем, что, с целью повышения точности способа,добавление кислоты в раствор препарата осуществляют до значения рН 4,6-4,8, после удаления нерастворимых веществ рН раствора устанавливают 7,1-7;3, затем разделяют на растворимую фракцию, содержащую

Р-экзотоксин, и нерастворимую, содержащую инсектицидный экзогенный метаболит, 1745172

Таблица 1

Таблица 2

Составитель Е.Ефимцев

Техред М.Моргентал Корректор ЭЯончакова

Редактор M.ßíêoâè÷

Заказ 2336 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва. Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород. ул. Гагарина, 101 хлористый барий вносят в растворимую фракцию, после растворения бариевой соли

Р-экзотоксина кислотой рН раствора устанавливают 7,1-7,3, отделяют раствор и доводят его рН до 3,5-3,7, далее в 5 нерастворимую фракцию, содержащую экзогенный метаболит, вносят соляную кислоту до рН 3,5-3,7, затем удаляют нерастворимые компоненты и в полученный раствор вносят этиловый спирт с рН 5,3-5,5, отделяют образовавшийся осадок, растворяют его в воде при рН 4,6-4,8 и затем устанавливают рН 3,5-3,7 и оптическую плотность полученных растворов Р-экзотоксина и экзогенного метаболита определяют при длинах волн 259, 310 и 340 нм,