Средство для реконструкции мембран in viтrо

 

Изобретение относится к биохимии и касается средств для реконструкции мембран In vitro. Цель изобретения - повышение специфической активности. Предлагаемое средство состоит из фосфатидилхолина хлопчатника и тринатриевой соли глицирризиновой кислоты при соотношении 1,0:0,1- 0,2. Полученное средство применяется как реактив для реконструкции мембран при биохимических исследованиях. 4 табл.

СОЮЗ СОБЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (sijs А 61 К 31/685, 37/22

ГОСУДАР СТОЕ ННЫ Й КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ а.ЯБ) lyitl L L6, 1

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4832451/14 (22) 02.04.90 (46) 15.07.92, Бюл, N. 26 (71) Научно-исследовательский институт педиатрии Республиканского научного центра охраны здоровья матери и ребенка (72) А.Н. Арипов, T.À. Даминов, А,Ш, Исамухамедов, Г.И. Бачманова. Л.М. Фесенко, М.А Абдугафурова, Н.В. Домбровская и Л.Л. Ахунджанова (53) 612. 015(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

¹ 1673969, 1987, Изобретение относится к биохимии и касается реактива — средства для реконструкции мембран in vitro.

Цель изобретения — повышение специфической активности.

Пример 1, В круглодонную колбу объемом 500 мл помещают 2 r фосфатидилхолина хлопчатника, добавляют 20 мл диэтилового эфира. закрывают колбу пробкой и перемешивают содержимое до полного растворения фосфадилхолина (ФХхл), Диэтиловый эфир упаривают досуха на роторном испарителе при T=40 С, приливают к содержащемуся на станках колбы ФХхл 100 мл

0,2%-ного раствора тринатриевую соль глицирризиновой кислоты (йазГК) в 130 мм трио-буфера (рН-7,4), содер кащего 200 мг йазГК, Интенсивно перемешивают содержимое до полного отделения ФХхл от стенок колбы и его солюбилизации.

Образовавшуюся мутную жидкость переносят порциями по 4,0 мл в стеклянные стаканы, помещают их в емкость со льдом и воздействуют ультразвуком с частотой 44. Ж» 1747072 А1 (54) СРЕДСТВО ДЛЯ РЕКОНСТРУКЦИИ

МЕМБРАН IN VITRO (57) Изобретение относится к биохимии и касается средств для реконструкции мембран ln vitro, Цель изобретения — повышение специфической активности. Предлагаемое средство состоит из фосфатидилхолина хлопчатника и тринатриевой соли глицирризиновой кислоты при соотношении 1,0:0,1—

0,2. Полученное средство применяется как реактив для реконструкции мембран при биохимических исследованиях. 4 табл. кГц на ультразвуковом дезинтеграторе до получения прозрачной опалесцирующей жидкости. Общее время воздействия ультразвука составляет 15 мин. Полученную жидкость центрифугируют при 30 000 об/мин в течении 15 мин, Центрифугат использовали для репарации поврежденных мембран клеток печени. Получившая суспензия содержит 20 мг ФХхл и 2 мг йазГК в

1 мл, рН суспензии7,4; размерчастиц36 — 40 нм, осмолярность 210 мосмоль, оптическая плотность при 1=660 нм составила 0,057. адсорбции суспензии при il =660 нм — 91 j, прозрачность максимальная, Пример 2. По примеру 1 в круглодонную колбу вносят 2 гр, ФХхл и растворяют его в 20 мл органического растворителя. После полного растворения ФХхл диэтиловый эфир упаривают на роторном испарителе при T=40 С. 3атем к ФХхл, выкристаллизовавшемуся на стенках колбы, приливают

100 мл 130 мМ трис-HCI буф.раствора, содержащего 300 мг йазГК. Интенсивно перемешивают до его полной солюбилизации, 1747072

35

Образовавшуюся мутную жидкость в стаканы для ультразвукового озвучивания и на холоду воздействуют ультразвуком с частотой 44 КГц в течении 15 мин. Полученную прозрачную жидкость центрифугируют при

30 000 об/мин в течение 15 мин. Полученная суспензия содержала 22 кг Фххл и 3 кг мг

НазГК в 1 мл и имела следующие физико-химические свойства, рН-7,38. размер частиц

35-40 нм, осмолярность 210 мосмоль, оптическая плотность при il.-660 нс 0,06; адсорбция суспензии при il 660 нм составила

89,0О, прозрачность максимальная.

Пример 3. По примеру 1, 2, 5 г ФХхл растворяли в 20 мл органического растворителя, высушивали его на роторном испарителе и солюбилизировали в 100 мл 130 мм трис-HCI буф, раствора, содержащего 400 мг МазГК. При выборе оптимальных концентраций составных частей суспензии испытаны следующие концентрации тринатриевой соли глицирризиновой (йазГК):0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,25 мас.ч. на 1,0 мас,ч. фосфатидилхолина.

Об эффективности действия препарата судили по замедлению инактивации цитохрома P-450 в поврежденных микросомах после инкубации их с суспензией (повреждение микросом вызывали введением крысам гепатотоксинов СС(4 и гелиотрина).

Количественно замедление инактивации цитохрома Р-450 определяли по времени полуинактивации его t >I„.

Результаты исследований представлены в табл. 1.

Из таблицы видно, что концентрация

КазГК 0,05 мас.ч. недостаточна для максимального проявления репарирующей способности препарата, при концентрации

МазГК от 0,1 до 0,2 мас,ч. наблюдали максимальный репарирующий эффект препарата. а при концентрации 0,2 и выше эффективность препарата оставалась без изменений, что явилось обоснованием для выбора концентрации МазГК: 0,1 — 0,2 мас,ч. на 1,0 мас.ч. фосфатидилхолина хлопчатника.

Конкретные примеры применения средства.

Об эффективности реконструкции мембран микросом печени в экспериментах in

vitro судят по скорости инактивации циотохрома Р-450 скрининг тесту, специфичному для повреждения эндоплазматического ретикулума печени.

Острые токсические повреждения печени вызывали введением гепатотропных

55 агентов: четыреххлористый углерод и гелиотрина.

Фосфолипидными препаратами взятыми для сравнительного изучения их эффективности явились; 1) фосфотидилхолин хлопчатника с тринатриевой солью глицирризиновой кислоты (по предлагаемой суспензии для реконструкции мембран)

ФХхл+КазГК; 2) фосфадилхолин хлопчатника с солодковым пенообразователем

ФХхл+ГК; препарат Эссенциале-фирмы Наттерман, ФРГ.

С целью репарации мембран микросхем, а также сравнения эффективности фосфолипидных препаратов фракцию мембран микросом выделяли из печени крыс с острым токсическими гепатитами, затем инкубировали их с препаратами фосфолипидов и регистрировали скорость инактивации цитох рома P-450.

Инактивацию цитохрома P-450 использавали как тест для определения состояния мембран. Инактивацию регистрировали в течение 20 мин при 37 С, Из таблицы видно, что время полуинактивации фермента при острых токсических воздействиях на печень резко снижается (58 мин). О хорошем репарирующей действии препаратов ФХхл+МазГК и ФХхл+СП можно судить по возрастанию времени полуактивации цитохрома Р-450, тогда как препарат эссенциале не оказывал репарирующего действия на поврежденные микросомы печени.

Репарация мембран эндоплазматического ретикулума печени крыс, поврежденных фосфолипазой Аг.

В опытах in vitro использовали фосфолипазу А2(уА2) из пчелиного яда (ех Bre

venum) фирмы "Caltiochem" (США) удельная активность которой равнялась 1000 ед, в мг, фосфолипаза А2 — фермент, гидрализующий фосфолипиды (в основном фосфатидилхолин в Р -положении). Микросомы в этой серии выделяли из печени здоровых крыс.

Микросомы инкубировали с А2, B табл. 3 определено время полуинактивации (t 1/2 цитохрома Р-450 в микросомах, поврежденных фосфолипазой Аг, Предлагаемое средство позволяет повысить уровень времени полуинактивации цитохрома Р-4500, что свидетельствует о репарационной активности предлагаемого средства, Изучение восстановления функциональной активности поврежденных мембран.

1747072

Таблица 1

Время полуинактивации цитохрома P-450 в поврежденных микросхемах печени крыс и проинкубированных с суспенэизй

П р и м е ч а н и е: t 1/2 цитохрома P-450 в поврежденных микросхемах беэ инкубации с суспенэией при СС!д гепатите

5 мин., при гелиотриновом 8 мин.

Таблица 2

Реконструкция поврежденных мембран эндоплазматического ретикулума фосфолипидными препаратами

О состоянии функциональной активно-. сти поврежденных мембран судили по скорости окисления субстратов цитохрома

P-450 анилина и аминопирина, Для изучения включения предлагаемого средства на скорость гидроксилирования анилина и диметилирования аминопирина испольэовали микросомы, поврежденные ф Аг.

Из табл. 3 видно, что в поврежденных микросомах скорость окисления обоих субстратов снижена. Инкубация поврежденных ФАг микросом с укаэанным средством приведена к увеличению скорости окисления субстратов, что свидетельствует о восстановлении функциональной активности поврежденных мембран эндоплаэматического ретикулума.

Скорость окисления анилина и аминопирина в микросомах печени крыс, поврежденных фосфолипазой Az и инкубированных с суспенэией ФХхл 1- ГК (нмоль) образовавшегося продукта в мин, мг белка приведена в табл.4.

Формула изобретения

Средство для реконструкции мембран

1p in vitro, содержащее фосфатидилхолин хлопчатника и детергент, о т л и ч а ю щ е ес я тем, что, с целью повышения репарационной активности, в качестве детергента используют тринатриевую соль глицирриэи15 новой кислоты при соотношении фосфатидилхолин: детергент 1.0,1-0,2.

1747072

Таблица 3

М икр осо кубации

Ххл - ГК

О» 0,5

Таблица 4

П р и м е ч а н и е: Инкубацию микросом, обработаннь х cOAz, с суспензией проводили на 3 мл фосфолипидной суспензии на 1 нмоль цитохрома Р-450 в течение

1 ч при 40С.

Составитель С.Мег ьникова

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректср Н.Король

Редактор А.Долинич

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Закаэ 2453 Тираж Подписнэе

ВНИИПИ Государственного комитета Ilo изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5