Способ оценки фагоцитарной активности нейтрофилов

 

Использование: в клинической практике и в научных целях для определения фагоцитарной активности нейтрофилов. Цель: повышение точности способа. Сущность изобретения: из венозной гепаринизированной крови выделяют нейтрофилы. Получают монослой адгезированных клеток, в который вносят взвесь убитой культуры золотистого стафилококка. После инкубации проводят окраску препарата акридиновым оранжевым в конечной концентрации 1:4000 - 1:5000. Затем проводят микрофлуориметрическое измерение интенсивности свечения отдельных нейтрофилов. При среднем значении интенсивности флуоресценции клетки свыше 3,03 констатируют повышение фагоцитарной активности, при значении меньше 2,67 - снижение Положительный эффект: сокращение времени исследования до 5-10 мин и снижение трудоемкости, точность определения повышается за счет количественен оценки результатов .

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК ((Ð) (И) ГОСУДАРСТВЕ(+1ЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (я)з G 01 N ЗЗ/533

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4634160/14 (22) 09.01.89 (46) 23.07.92. Gen. ЬЬ 27 (71) Челябинский государственный медицинский институт (72) С.H.Òåïëîâý, Л.И,Крюкова и В.АьЧернов (56) Биологические препараты и иммунологическая реактивность организма, Томск, 1970, с. 89. (54) СПОС06 ОЦЕНКИ ФАГОЦИТАРНОЙ

АКТИ6НОСТЙ НЕИТРОФИЛОВ (57) Использование: в клинической практике и в йафчных целях для определения.фагоци. тэрнчой активности нейтрофилов, Цель; повышение точности способа. Сущность изобретения: из венозной гейаринизированной крови выделяют нейтрофилы, ПолИзобретение относится к медицине, точнее к иммунологии, и предназначено для определения нарушений фагоцитарной функции нейтрофилов.

Известен способ оценки фагоцитарной активности лейкоцитов f I i. включающий забор крови из пальца в 2 -ный раствор цитрэта натрия с последующим внесением живой культуры золотистого стафилококка, инкубировэние взвеси в течение 30 мин при 37 С, приготовление мазка, его фиксацию и окраску по Романовскому-Гимза, микроскопический учет, при котором определяют процент клеток, участвующих в фэгоцитозе, 9f количестве микробных клеток. фэгоцитированных каждым лейкоцитом (оценивают не менее 100 лейкоцитов).

К недостаткам известного способа следует отнести субъективность оценки и свя2 учэют монослой адгезированных клеток, в который вносят взвесь убитой культуры 30лотистого стафилококка. После инкубации проводят окраску препарата акридиновым оранжевым в конечйой концентрации

1;4000 — 1:5000. Затем проводят микрофлуориметрическое измерение интенсивности свечения отдельных нейтрофилов. При среднем значении интенсивности флуоресценции клетки свыше 3.03 констатируют повышение фагоцитарной активности, при значении меньше 2,67 — снижение. Положительный эффект: сокращение времени исследования до 5-10 мин и снижение трудоемкости, точность определения повышается за счет количестввной оценки результатов. занную с ней низкую точность результатов, особенно в тех случаях, когда захват микробов велик и микробные клетки трудно раз- . личимы глазом в- цитоплазме лейкоцитов, высокую трудоемкость способа: 20 мйн ра- о бочего времени уходит на подсчет 1 мазка. Ю

Следует отметить также утомляемость исс- (д3 ледователя при подсчете в каждом мазке ф, состчитывается 100 лейкоцитов, а также число микробов, ввхввчвнных отдельными )ьь метками. Кроме того, необходимость со-блюдать правила работы с живыми микробными культурами также увеличивает трудоемкость исследования., Целью изобретения является повышеwe точности способа, Поставленная цель достигается тем, что в способе оценки фагоцитэрной активности нейтрофилов, включающем забор крови с

1749834 последующим введением в нее культуры золотистого стафилококка, приготовление препарата и его окраску с дальнейшим определением поглотительной способности клеток, согласно изобретению из венозной гепаринизированной крови готовят монослой адгеэированных лейкоцитов, к которому добавляют убитую культуру золотистого стафилококка. окраску препарата осуществляют акридиновым оранжевым, а оценку поглотительной способности проводят путем микрофлуориметрического измерения интенсивности красного свечения нейтрофилов и при значении интенсивности свечения одной клетки свыше 3,03, определяют повышение фагоцитарной активности, а при значении этого показателя меньше 2,67 — снижение фагоцитарной активности клеток.

Способ оценки фагоцитарной активности нейтрофийов осуществляют следующим образом.

Из веноэной гепаринизированной крови выделяют путем центрифугирования слой лейкоцитов (содержащий до 60 )ь нейтрофилов). Полученную обогащенную взвесь {концентрация клеток 2х10", кл/мл) вносят по 1 мл на среде 199 в пробирки типа сапожок с помещенными в них покровными стеклами и инкубируют s течение 1 ч при

37 С для получения монослоя адгеэированных нейтрофилов. Монослой адгезированных на покровных стеклах нейтрофилов после инкубации трижды отмывают средой

199, добавляют 0,1 мл взвеси суточной культуры золотистого стафилококка убитой нагреванием и инкубируют в течение 1 ч при

37 С.

После инкубации покровные стекла трижды отмывают средой 199 и проводят окраску монослоя раствором акридинового оранжевого в разведении 1:5000 в течение

30 с. Окрашенное таким образом покровное стекло с монослоем помещают на предметное стекло клетками вниз, удаляют фильтром избыток жидкости, на.препарат наносят каплю нейфлуорисцирующей иммерсионной жидкости (диметилфталат). Затем проводят микрофлуориметрическое измерение интенсивности красного свечения отдельных нейтрофилов под лименесцентным микроскопом ЛЮМ-АМ-ИЗ со светофильтрами СС-1 и БС-8 (регистрируеМое возбуждаемое свечение в пределах

600-700 нм). при этом осуществляют флуориметрию свечения 50 нейтрофилав, поглотивших и нейоглотивших стафилококк, проводя запйсь результатов с помощью самописца H-3010-1.

Определяют средний показатель свечения одного фагоцитирующего лейкоцита и при значениях его, меньших 2,67 определяют снижение фагоцитарной активности. при

5 значениях этого показателя превышающих

3,03 — усиление ее.

Пример 1. Донор А, Готовят монослой лейкоцитов на покровном стекле путем инкубации лейковзвеси при 37 C в течение 1

10 ч. К монослою добавили 0,1 мл убитой суточной культуры золотистого стафилококка в концентрации 2 млрд в 1 мл и инкубировали в термостате еще в течение 1 ч, Стекло трижды отмывали средой 199 и прокрашивали

15 раствором акридинового оранжевого (в разведении 1:5000) в течение 30 с. Монослой клеток вновь отмывали средой 199, поместили на предметное стекло клетками вниз, . удаляя избыток влаги фильтровальной бума20 гой.

Затем осуществляли микроскопироваwe, проводя флуориметрию свечения фаго. цитирующих и нефагоцитирующих фоновых . лейкоцитов в количестве 50 штук и эаписы25 вая оеэультвт с помощью самописца Н3010-1 Графическую запись результата оценивали путем измерения высоты зубцов . в 50 клетках, определили среднюю интенсивность свечения 1 лейкоцита.

30 Значение фагоцитарной активности у обследуемого донора А составило 2,9 в. В соответствии с предлагаемым способом это свидетельствует о нормальной фагоцитарной активности лейкоцитов у донора А.

35 Пример 2. Больной Н. Диагноз: стафилококковач инфекция, эмпиема легких. При оценке фагоцитарной активности с помощью способа-прототипа у больного обнаружено, что стадия захвата объектов фа40 гоцитоэа настолько велика. что сосчитать глазом количество захваченных стафилококков не представляется возможным.

Фагоцитарную активность в предлагаемом способе оценивали в соответствии с

45 предложенной схемой; сняли показатель свечения в с 50 профагоцитировавших и непрофагоцитировавших клеток, нашли среднее значение свечения 1 клетки — оно составило 4,0 в. В соответствии с предлага50 емым способом (так как показатель нормального свечения составляет 2,85 0,18) сделан вывод о резком повышении фагоцитарной активности лейкоцитов у данного больного.

55 Проведенные испытания способа подтвердили такие преимущества перед известным способом как повышение объективности, что достигнуто благодаря, переходу от полуколичественной виэуаль1749834

Составитель В.Брусиловская

Техред M.Ìîðråíòàë Корректор M.Максимишинец

Редактор М.Бланар

Заказ 2593 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва. Ж-Э5, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский кдмбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 ной оценки к количественной микрофлуориметрической.

Сокращение времени исследования: в известном способе на подсчет 1 мазка уходит 20 мин рабочего времени, в предлагаемом способе — в среднем от 5 до 10 мин, что связано, в частности. с возможностью проведения оценки реакции в меньшем количестве лейкоцитов: не в 100 клетках (как в известном способе). а в 50.

Важным преимуществом является улучшение условий труда исследователя, использование убитой культуры золотистого стафилококка обеспечило его безопасность, снизилась трудоемкость способа за счет исключения необходимости соблюдения правил работы с живыми микробными культурами, уменьшилась утомляемость исследователя за счет перехода от визуальной оценки к автоматизированной (утомляемость известного способа обусловлена, в частности, тем, что в соответствии а ним необходим подсчет числа объектов фагоцитоза в каждой из 100 клеток), Предлагаемый способ может быть использован с целью оценки фагоцитарной активности лейкоцитов для научных целей, а также в клийической практике. В связи с тем, что при гнойно-воспалительных и инфекционных заболеваниях е подавляющем большинстве случаев наблюдается nîiûøåwe фагоцитарной реакции лейкоцитов, необходимо отметить особую значимость предлагаемого способа при повышении эк5 тивности фагоцитоза. Способ необходим в клинической иммунологии как для постановки диагноза, так и для назначения иммунокорригирующей терапии;

Формула изобретен и я

10 Способ оценки фагоцитарной активности нейтрофилов при гнойно-септических состояниях, включающий забор крови, введение в нее культуры золотистого стафилококка. приготовление препарата и его

15 окраску с последующим определением . поглотительной способйости нейтрофилов, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, проводят забор веноэной крови и убитую культуру золо20 тистого стафилококкэ вводят в монослой адгезировэнных нейтрофилбв, окраску препарата осуществляют акридиновым оранжевым в конечной концентрации 1:4000—

5000 и оценку поглотительной способности

25 проводят микрофлуориметрически, при атом при среднем значении йнтейсивности флуоресценции одной .клеткИ свйше 3,03 констатируют повышение фагоцитарной активности, при значении меньше 2,67 — сни30 жение.