Питательная среда для выделения патогенных стафилококков

 

Использование медицинская микробиология . Сущность изобретения: питательная среда используется с целью повышения селективных свойств среды, упрощения и ускорения выделения патогенных стафилококков Среда дополнительно содержит желток, при этом нативный яичный белок и желток она содержит в виде яичной взвеси. 0,1 %-ный водный раствор кристалвиолета и дефибринированную кровь при следующем соотношении компонентов агар-агар 20,0 25,0 г, хлористый натрий 100,0-102,0 г, яичная взвесь 100,0-150,0 г; 0.1 %-ный водный раствор кристалвиолета 3,0-3,5 мл, дефибринированная 100,0-150,0 мл, бульон Хоттингера до 1 л. 2 табл. о w Ё

COlO3 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4889842/13 (22) 10.10.90 (46) 30.07.92. Бюл. N 28 (71) Самарский филиал Научно-производственного объединения "Гигиена и профпатология" (72) А.В.Ставский и Н.И. Червонная (53) 576.8.093, 1(088.8) (56) Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, под ред. Биргера. М,: Медицина, 1973, с.

75-76, Авторское свидетельство СССР

N 687118, кл, С 12 N 5/00, 1977. (54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ПАТОГЕННЫХ СТАФИЛОКОККОВ

Изобретение относится к медицинской микробиологии.

Известна питательная среда для выделения стафилококков, содержащая агарагар, приготовленный на мясном бульоне, и

10% дефибринированной крови, Недостатком данной среды являются . слабые селективные свойства.

Известна питательная среда для выделения стафилококков, содержащая физиологический раствор, мясо-пептонный агар (рН 7,2) 10% хлористого натрия и 10-20% желточной взвеси.

Недостатком данной среды являются также слабые селективные свойства.

Известна также питательная среда для выделения стафилококков, содержащая агар-агар, нативный яичный белок. хлористый натрий, бульон Хоттингера.

Недостатком данной питательной среды являются ее слабые селективные свойства, сложность и длительность выделения

5Ц 1751199 Al (s>)s С 12 N 1/20, С 12 Q 1/04 (57) Использование: медицинская микробиология. Сущность изобретения: питательная среда используется с целью повышения селективных свойств среды, упрощения и ускорения выделения патогенных стафилококков. Среда дополнительно содержит желток, при этом нативный яичный белок и желток она содержит в виде яичной взвеси, 0,1%-ный водный раствор кристалвиолета и дефибринированную кровь при следующем соотношении компонентов; агар-агар 20,025,0 г; хлористый натрий 100 0 102,0 г; яичная взвесь 100,0 — 150,0 г; 0,1%-ный водный раствор кристалвиолета 3,0-3,5 мл; дефибринированная кровь 100,0-150,0 мл; бульон

Хоттингера до 1 л, 2 табл. патогенных стафилококков, так как в связи с широким применением антибиотиков и химиотерапевтическйх препаратов, оказывающих влияние на изменчивость микробов кокковой группы, в этиологии многих гнойно-воспалительных процессов большая роль стала придаваться, наряду с золотистым стафилококком, и другим видам стафилококков, относящимся к группе потенциально-патогенных. В соответствии с этим недостатком известной питательной среды является определение только одного вида стафилококков, что снижает диагностическую ценность питательной среды.

Целью изобретения является повышение селективных свойств среды, упрощение и ускорение выделения патогенных стафилококков.

Эта цель достигается тем, что среда дополнительно содержит желток,при этом нативный белок и желток она содержит в виде яичной взвеси. 0.1%-ный водный раствор

1751199

3,0-3,5 мл кристалвиолета и дефибринированную кровь при следующем соотношении компонентов:

Агар-агар . 20,0-25;0 r

Натрий хлористый 100,0-102,0 г 5

Яичная взвесь 100,0 — 150,0 г

0,1 g -ный водный раствор кристалвиолета

Дефибринированная 10 кровь 100 0 — 150,0 мл

Бульон Хоттингера До 1 л

Питательную среду готовят, например, следующим образом.

1000 мл агаровой питательной основы, 15 приготовленной из сухого питательного агара по обычной прописи с добавлением 10,,ного хлористого натрия и 3,3 мл 0,10/-ного водного раствора кристалвиолета, стерилизуют, охлаждают до 60-70 С, добавляют в 20 асептических условиях стерильно приготов- ленную яичную взвесь (куриное яйцо — белок и желток, смешанное с 200 мл стерильного физиологического раствора) в количестве 100 мл и 110 мл дефибриниро- 25 ванной крови. Среду тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. После застывания и подсушивания среду используют для проведения необходимых исследо-. ваний. Срок хранения среды после 30 приготовления 7 — 10 дней при температуре

+-4 С.

Питательная среда используется следующим образом.

Для выделения культур стафилококков 35 исследуемый материал (мазки из зева, носа, гной, раневое содержимое, вода, смывы с объектов внешней среды) рассеивают по всей поверхности питательной среды тампоном или шпателем, а при дифференциа- 40 ции уже выделенных штаммов стафилококков — штрихами на сектора чашки Петри, Учет результатов проводят через

24 — 48 ч инкубации в термостате при 37"С.

При посеве исследуемого материала на 45 предлагаемую диагностическую среду на ней вырастают, наряду с золотистым стафилококком, и другие виды стафилококков с признаками патогенности (вирулентности).

П р vi м е р 1. При прямом посеве тампо- 50 ном мазка иэ зева ребенка с подозрением на дифтерию бь|ли использованы одновременно простой мясо-пептонный агар(МПА), кровяной и желточно-солевой агары, а так- 55 . же предлагаемая диагносгическая среда, Указанный набор питательных сред применялся как при прямом посеве патологического материала, так и при проведении идентификации выделяемых иэ зева микроорганизмов. Через 18 — 24 ч все культуры с простого агара, подозрительные как стафилококки (наличие золотистого, желтого или белого пигмента колоний), пересевались вновь на кровяной агар, желточно-солевую и предлагаемую среды, Все колонии с предлагаемой питательной диагностической среды также засевались на кровяной и желточно-солевой агары, После 18 ч инкубации производился учет результатов. Иэ зева ребенка было выделено 9 штаммов стафилококков (3 — с золотистым пигментом, 6 — с белым). Дальнейшая идентификация позволила установить, что все три штамма золотистого стафил око кка обладали гемолитической и лецитиназной активностью. Из культур белого стафилококка два штамма дали на кровяном ага ре четкую зону гемолиза и один штамм обладал лецитиназной активностью, При посеве этого же материала на предлагаемую диагностическую среду было выделено 11 штаммов стафилококков (колонии фиолетового или оранжевого цвета), из которых у 4 культур наблюдали одновременно зоны лизиса зритроцитов и помутнения с радужным венчиком: у трех колоний отмечалась только зона гемолиза и у одного штамма — только зона помутнения.

Следовательно, обычными методами выделено 6 штаммов стафилококков, обладавших факторами агрессии (гемолизин, лецитинаэа), а при использовании предлагаемой диагностической среды изолировано 8 штаммов патогенных стафилококков.

Несмотря на несущественное различие в количестве выделенных штаммов, следует подчеркнуть, что исследование с применением предлагаемой диагностической среды продолжалось в течение 18-24 ч, в то время как использование обычной методики потребовало не менее 48 ч работы, Пример 2; При параллельном контрольйом посеве на МПА, кровяной агар и . предлагаемую питательную среду шести смывов и двух проб воздуха в операционной после ее профилактической обработки было обнаружено, что в одном смыве с загубника наркозного аппарата и в одной пробе воздуха присутствовали белые стафилококки, обладавшие при последующем исследовании гемолитической активностью, но не имев- шие лецитиназы. Применение обычных сред позволило получить окончательный ответ через 48 ч, а при использовании предлагаемой диагностической среды ответ был получен через сутки, Пример 3, Готовят среду, как указано, при этом компоненты берут в следующих количествах в бульоне Хоттингера. г/n:

Агар-агар 18.0

Натрий хлооистый 99.0

1751 199

Яичная взвесь - 80.0 мл

0,1 — íûé водный раствор кристалвиолета 2,75 мл

Дефибринированная кровь 80,0 мл

Золотистый стафилококк дает хороший типичный рост колоний, Зоны гемолиза и помутнения слабо различимы. Колонии белого стафилококка светло-фиолетового цвета, Наблюдается единичный рост колоний кишечной палочки и вульгарного протея. что свидетельствует о недостаточном тормозящем действии хлористого натрия и кристалвиолета в количествах, добавляемых в среду.

Пример 4. Готовят среду, как указано, при этом компоненты берут в следующих количествах в бульоне Хоттингера, г/л;

Агар-агар 20

Натрий хлористый 100

Яичная взвесь 100 мл

0,1 -ный водный раствор кристалвиолета 3 мл

Дефибринированная кровь 100 мл

При посеве золотистого стафилококка вырастают колонии оранжево-желтого цвета с явно выраженной зоной гемолиза и зоной помутнения с радужным, венчиком, размером на 1 мм более размера зоны гемолиза. Белые стафилококки дают колонии светло-фиолетового цвета с зоной гемолиза и без нее или с зоной помутнения; радужный венчик больше размеров зоны гемолиза на 1 мм, Среда позволяет дифференцировать стафилококки с признаками патогенности от непатагенных видов.

Кишечная палочка и протеи роста не дают.

Пример 5. Готовят среду, как указано, при этом компоненты берут в следующих количествах в бульоне Хоттингера, г/л:

Агар-агар 23,0

Натрий хлористый 101,0

Яичная взвесь 130,0 мл

0,1 -ный водный раствор кристалвиолета 3,25 мл

Дефибринированная кровь 130,0 мл

Рост колоний патогенных стафилококков типичный, сопровождается четкой зоной гемолиза вокруг колоний с зоной помутнения и радужным венчиком, превосходящим по размеру зону гемолиза на 3 мм.

Колонии стафилококков типичные, оранжевого или фиолетового цвета. Некоторые колонии белого стафилококка дают слабый радужный венчик, что позволяет отйесТй их к группе стафилококков с признаками патогенности..Кишечные палочки и протеи не дают роста.

Пример 6. Готовят среду, как указано. при этом компоненты берут в следующих количествах в бульоне Хоттингера, г/n:

Агар-агар 25,0

5 Натрий хлористый 102,0

Яичная взвесь 150,0 мл

0,1 -ный водный раствор кристалвиолета 3,5 мл

10 Дефибринированная кровь, 150,0 мл

Колонии золотистого и белого стафилококков типичные, оранжевого цвета с зоной гемолиза и зоной помутнения с радужным

15 венчиком по периферии, Зона помутнения превосходит размеры зоны гемолиэа на

3 мм; колонии белого стафилококка фиолетового цвета; некоторые колонии дают зону гемолиза и зону помутнения с радужным

20 венчиком, свидетельствующие о наличии факторов агрессии — гемолизина и лецитиназы. Кишечные палочки и протеи не растут.

Пример 7, Готовят среду, как указано, при этом компоненты берут в следующих

25 количествах в бульоне Хоттингера, г/л:

Агар-агар 27,0

Натрий хлористый 103,0

Яичная взвесь 170,0 мл

0,1 -н ый водный раствор кристалвиолета . 3,75 мл

Дефибринированная кровь 170,0 мл

Колонии золотистого стафилококка вы35 растают ярко-оранжевого цвета с нетипич-, ной морфологией (колонии мелкие, слегка морщинистые) со значительным количественным уменьшением числа колоний по сравнению с контрольным высевом„что сви40 детельствует о тормозящем действии избытка хлористого натрия и кристалвиолета.

Зоны гемолиза и помутнения нечеткие, едва различимые из-за слияния по цвету.c интенсивно окрашенным фоном среды. Белые

45 стафилококки темно-фиолетового цвета с нетипичной морфологией колоний, Кишечные палочки и протеи роста не дают, Указанное свидетельствует, что предлагаемая модификация питательной диагно50 стической среды позволяет сократить обьемы и срок исследований за счет преимущественного выделения стафилококков, одновременной их идентификации и определения признаков иэ вирулентности, так

55 как наличие в среде раствора кристалвиолета позволяет расти только стафилококкам;

"присутствие желтка «яйчйой взвеси в питательной среде дает возможность в этой же чашке визуально наблюдать лецитовителазную реакцию, с помощью которой определя1751199

20

50 ется наличие у исследуемого штамма микроорганизмов фермента лецитиназы; присутствие в среде дефибринированной крови дает возможность визуально наблюдать гемолитическую активность штаммов. Все отмеченное расширяет диагностические воэможности среды.

Положительный эффект доститается только лишь при строго определенной взаимосвязи существенных признаков. Исключение любого иэ них не позволяет достичь положительный эффект, Проведенные исследования предлагаемой диагностической среды с использованием выделенных и идентифицированных ранее 124 штаммов стафилококков показало, что предлагаемая диагностическая среда четко дифференцирует патогенных микробов этой группы, кэк и с использовэнием набора других сред для выделения и идентификации штаммов стафилококков, с той лишь разницей, что выделение и частичная идентификация этих бактерий проводится в одной чашке.

В результате изучения выделяемости патогенных стэфилококков с использованием различных питательных сред получены следующие результаты: всего исследовано

124 штамма стафилококков; выделено 97 штаммов стафилококков с признаками вирулентности; в том числе на обычных дифференциальных средах кровяной агар — 81, желточно-солевой агар 74: на предлагаемой диагностической среде 92.

При испытательных исследованиях на предлагаемой диагностической среде вырастали колонии только патогенных стафилококков (колонии фиолетового или оранжевого цвета). Кроме того, при наличии у микробов факторов агрессии (гемолизин и лецитинэза) вокруг колонии наблюдалась зона гемолизэ эритроцитов и зона частичного помутнения с радужным венчиком различной интенсивности по периферии зоны темолизэ или несколько ее превосходящая по размерам (на 1-3 мм). В табл. 1 приведены данные, свидетельствующие о различных рбэкцирх микроорганизмов в зависимости от дозы добавляемых в предлагэемую диагностическую среду ингредиентов, Как свидетельствует табл. 1, минимальные количества дефибринированной крови и яичной взвеси, при которых получается довольно четкий результат, определяются на уровне 100 — 150 мл по показателям чегкости зон гемолиза и помутнения с радужным венчиком и величинам размеров зон гемолиза и помутнения.

Зависимость роста стафилококков на предлагаемой питательной среде от количества добавляемого в нее раствора кристалвиолета представлена в табл. 2.

Как видно из табл. 2, доза добавляемого в предлагаемую диагностическую среду кристалвиолета существенно не оказывает влияния на культуру стафилококка, в то время кэк культура кишечной палочки не растет на среде уже в дозе кристалвиолета от 3,5 мл и выше, Таким образом, как свидетельствуют приведенные примеры, предлагаемая диагностическая питательная среда, приготовленная при строго определенных соотношениях вносимых ингредиентов, позволяет четко дифференцировать патогенных представителей стафилококков от непатогенных с одновременным определением у них в одной чашке двух ферментов агрессии (гемолизин и лецитиназа). Это позволяет в значительной мере сократить объемы И сроки исследования за счет преимущественного выделения только стафилококков с одновременной их идентификацией и определением признаков вирулентности, Кроме того, использование предлагаемой диагностической среды позволяет экономить питательные среды, необходимые по обычной методике для аналогичной идентификации (кровяной агар, желточно-солевой агар), а также рабочего времени персонала, необходимого для посева на дополнительные среды (мясопептонный агар, кровяной агар, желточносолевая среда) по обычной схеме исследования, и времени, требуемого на их раздельное приготовление и подготовку посуды, Все указанное увеличивает производительность труда персонала бактериологических лабораторий.

Формула изобретения

Питательная среда для выделения патогенных стэфилококков, содержащая агарагар, нативный яичный белок, хлористый натрий, бульон Хоттингера, о т л и ч а ю щ ая с я тем, что, с целью повышения селективных свойств среды, упрощения и ускорения выделения патогенных стафилококков, она дополнительно содержит желток, при этом нативный яичный белок и желток — в виде яичной взвеси, 0,1 -ный водный раствор кристалвиолета и дефибринированную кровь при следующем соотношении компонентов:

Агар-агар 20,0 -25,0 г

Хлористый натрий 100.0 t02,0 r

Яичная взвесь 100.0 -150.0

0,1%-ный водный раствор кристалвиолета 3.0- 3.5 ïï

1751199

Бульон Хоттингера

Дефибринированная кровь

100,0 — 150,0 мл .

До1л

Таблица "1

Зависимость размеров зон гемолиза и помутнения в предлагаемой диагностической питательной среде от дозы добавляемых ингредиентов

-ж "ччьч-

Оефибринированная кровь и яичнаб взвесь, мл"

Критерии, оценки

150 ) 170

100

130

Наличие, эоны гемолиэа зритроцитов

Наличие эоны помутнения

Четкая

Зона гемолиэа и помутнения

Четкзя

Характеристика эон гемолиэа и помутнения

Размер эон, мм:. гемолиза "

Не определя- 24 ется

24

5 помутнения Не определя- 25 . 27 2б 2 1 ется

Оранжевый Фиолетовый Фиолетовый Фиолетовый

Цвет колоний

Желто-оранжевый

Йчьччччэч таблица

Количество колоний эолотистого стафилококка на предлагаемой млагностической среде в зависимости от концентрации кристалвиолета ч ч »ч » ь »

Культура микроорга- низмов

Посевная доза

Количество добавляемого о среду кристалвиолета (0, 14-ный водный раствор), мл

Чистая культура золотистого стафилококка

98 колоний

100 кл/мл

93 колонии

96 колоний чч коло» оо яий

97 колоний

По 50 кл/мл обеих культур

17 колоний кишечной палочки.

6месь стафилококка и кишечной палочки

42 колойии стафилококка

Й 4» Ъ Мй

Составитель А. Ставский

Редактор Н. Швыдкая Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор И, Муска

Подписное

ВНИИПИ Государственного кг1митета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР i13035, Москва, /К-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Расплывчатая беэ четкой границы; очень слабое помутнение 1oHl гепо: лиза; Помут- нение с радужным венчнкпм

Четкая зона гемолиээ; пойутнение с радужным венчиком

Четкая эона гемолиэа; помутнение с радужным венчиком

Питательная среда для выделения патогенных стафилококков Питательная среда для выделения патогенных стафилококков Питательная среда для выделения патогенных стафилококков Питательная среда для выделения патогенных стафилококков Питательная среда для выделения патогенных стафилококков 

 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к способам определения способности холерных вибрионов к деструкции лецитина куриного желтка с использованием этого эффекта для идентификации возбудителя и для оценки его патогенных свойств

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к диагностике сыпного тифа

Изобретение относится к медицинской и ветеринарной микробиологии и может быть использовано при определении чувствительности бактерий к антимикробным препаратам

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской паразитологии

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в лабораторной практике для выделения чистой культуры возбудителя сибирской язвы

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в нефтеперерабатывающей и военной промышленности при разработке состава смазочных материалов для оценки их бактериостойкости

Изобретение относится к промышленной и сельскохозяйственной микробиологии и может быть использовано для защиты злаковых культур от болезней, вызываемых фитопатогенными грибами

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения штамма бактерий, осуществляющего микробиологическое разрушение 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) и ее аминной соли, используемых в качестве гербицидов для борьбы с сорняками на посевах хлебных злаков
Наверх