Способ получения ремантадинзависимого варианта вируса гриппа
Использование: вирусология, изучение процессов изменчивости вирусов под влилнием химиопрепаратов. Сущность изобр етения: в поддерживающую среду добавляют ремантадин в концентрации 6-25 мкг/мл и рибавирин в концентрации 3-25 мкг/мл. 1 табл. СЛ
СО)03 СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУВЛИК
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
1 . : . .:.:::. 2 (21) 4865079/13 . ..; . .:: - . (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕМАНТАДИН(22) 11.09.90 ....,... .. ..; . ЗАВИСИМОГО, ВАРИАНТА ВИРУСА: ГРИП(46) 30.07.92. Бюл. И. 20 .:.:.,; ПА (71) Белорусский научно-исследовательский . (57) Использование : вирусология,.изучение ийститут эпидемиологии и микробиологии, .:. процелссов изменчивости вирусов под влиа(72) Е, И. Бореко, k. И, Карако, В, И. Вотяков . нием химиопрепаратов. Сущность изобреи П. Г. Рытик ..:,.... тения . в поддерживаюгщуа средудобавляют (53) 576,0.094,29(088.0) : - : ремантадин в концентрации 6-25 мкг/мл и (56)Бореко Е; И,и КаракоН;И,Перспективы .рибавирин в концентрации 3-25 мкг/мл. развитйя химйи каркасных соединений и их" . 1 табл, применение в народном хозяйстве. Всес. конф., 19-21 апр. 1989, теэйсы докл., Куйбы. шев, 1989, с. 7, Вотяков В. И;, Бореко Е. И., Запорожец
Л, К. Судник !О. M. Нуклеозиды, производные бициклогептана и адаманта а и другие интивирусные вещества. Минск, 1981, с. 3-9 ° ЮЪ ви т ° ч Г
Изобретение отйосится к вирусологии и: дйфференциация этих вариантов от родиможет быть использовано, например, в изу- .:. Тельских вирусов. ченйипгроцессовизменчивостйвирусовпод, В то же время ремантадинзависимый влияйием химиопрепаратов; .... :: -.. вариант вируса грипйа малостабилен, легко (Л
Возможность возникновения химиоп- . ревертирует при пассировании на клеточ- а репаратзависимых вариантов вирусов хоро- . ной культуре в отсутствии ремантадина, его ) шо известна йз истории химиотерапии дифференциация от родительского вируса С1 вирусных инфекций в связи с такими высо-, затруднена, особенно при высокой множекозффективнымй препаратами tI:GK произ- ственности инфицирования. Это в свою очеводные бксибензилбензимидазола. редь не позволяет получать большие гузнидино, извтин-Ь-тиосемикзроезонв. 3е- количества ремвнтедиензевисиглоговирусе.,ри висимые BBpMAHTbl вирусов в присутствии Известенспособ получения ремантадиэтих веществ могут быть легко получейы в ензавйсимого(измененного) варианта вируколичествах, достаточцых для большинства са, заключающийся в том. что монослойную биохимических и биофизических йсследова- тканевую культуру фибробластов эмбрионий. Это связано с относительно высокой f108 кур (ФЭК) инфицируют 0,00002 стабильностью в ходе пассирования, что БОЕ/клетка вируса гриппа A/FPV/Éîñtîñk. приводит в итоге к практически полной ги- покрывают питательной средой на основе бели варианта вируса в отсутствии химиоп- концентрата среды 199 с добавлением 17; репарата. Следовательно. возможна четкая бактагара и 0,005$-нейтрального красного, чв
35
40 устанавливают в лунку, вырезанну а в покрытии после затвердевания, отрезок стеклянной трубки и заполня от ее просвет 0,05 мл раствора ремантадина (5 мг/мл), инкубируют в 57. СОг атмосфере при 37 С в течение 48 4. Препарат ремантадиензависимага варианта вируса получают путем "выкалыоания" бляшек, образовавшихся на чашке в . непосредственной близости вокруг зоны токсичности и отделенных от бляшек родительского вируса зоной подавления образования бляшек.
Недостатком способа является малое количество вируса в препарате. Попытка повысить множественность инфицирования для увеличения выхода приводит к образовани о сливных бляшек и невозможности их четкой дифференциации вследствие исчеэновения зоны подавления образования бляшек. Способ имеет скорее демонстрационное, чем препаративнае значение. Накапливание с его помощью количества вируссодержащега материала. необходимых, например, для электронной микроскопии, злектрофоретического исследования 25 компонентов вибрионов практически невозможно, Наиболее близким к изобретению является способ получения ремантадинзависимого варианта вируса путем инфицирования монослойной культуры ФЭК
0,0001-0,001 ТЦД50/клетка вируса гриппа . A/FÐ×/RoûocÊ нанесения паддер>кивающей среды(среда 199) с растворенным в ней
6-25 мкг/мл ремантадина, инкубации в те: чение 48 ч при 37 С и сбора культуральнай жидкости как материала, содержащего необходимый вариант вируса. Способ позволяет. получить более значительные количества ремантадинзависимого варианта вируса, который может быть подвергнут дальнейшей обработке с помощью обычных приемоо очистки и концентрирования вируссадержащего материала.
Недостатком способа является малый выход ремантадинзависимого варианта вируса. Это связано с плохой дифференциацией э ого варианта от родительского(инфицирующего) вируса, основанной только на вирусингибирующих свойствах испаль- 50 зованных и более низких концентраций ремантадина в отношении. инфициру ащего вируса. Если же создаются условия для получения материала в больших количествах (задается высокая множественность инфек- 55 ции), становится невозможным разделение, . поскольку размножаются оба — ремантадинэависимый вариант и родительский оирус. Ингибирующее действие ремантадина недостаточно в этих условиях как разделя1otltwi (f1 0Jji> Bf1 kна щи и p s o (o to родительского вируса) фактор. В связи с. этим возможна только низкая лнажественнасть инфицирования, что недостаточно для некоторых видов исследования. например автарадиографическаго изучения инфициpoBGHHblx клеток в течение первого цикла репродукции вируса. Кроме того, невозможно накапливание ремантадинзависимого оарианта при инфицирооании вирусом, устойчивым к дейстои о ремантадина, так как вирусингибирующие соойвтва о отношении родительского вируса и, следовательно, .дифференциация материала от исходных частиц ослаблены.
Целью изобретения является увеличение выхода и пооышение однородности получаемых препаратов ремантадинзависимаго варианта вируса гриппа.
Поставленная цель достигается добавлением в поддерживающу о сроду ремантадина в концентрации 6-25 мкг/мл и рибавирина в концентрации 3 — 25 мкг/мл.
Новизна изобретения заключается о сочетаннам использовании ремантадина и рибавирина для получения ремантадинзависимого варианта вируса, было известно, что ремантадин и рибавирин при совместном использовании проявляют синергидный ингибирующий эффект на размна;кение вирусов гриппа. Не было известно и явилось неожиданным отсутствие ингибирующего эффекта рибавирина в отношении ремантадинзависимого варианта вируса при егб получении о условиях одновременного присутствия ремантадина и рибавирина о среде поддержки. Нельзя было предполагать оозможность образования ремантадинзависимого варианта вируса в присутствии. ремантадина и рибавирина. Напротив, име. ющиеся данные свидетельствуют о затрудненном образовании даже устойчивости вируса гриппа к комбинации ремантадин + рибавирин вследствие разноплановости способа антивирусного действия обоих ин- . гибиторов.
Положительный эффект изобретения заключается в повышении надежности-дифференциации материала ремантадинзависимого варианта вируса от родительского вируса, что позволяет значительна увеличить множественность инфицирования и получить таким образом высокий урожай при инфицирооании тканевой культуры даже оируссом, устойчивым к.действию ремантадина.
Пример 1. Монослайнйе тканевые культуры ФЭК инфицируют 0,01 бОЕ/клетка вируса гриппа А! РРЧ/Rostock и его варианта. устойчиоого к действию ремантадина..1 75 1 204
5 ... 6
После 1 ч контакта с клетками вируссодвр- с рибавирийом ЦПЭ отсутствует так же, как жащую жидкоСть. удаляют и:наносят свежую и в присутСтвйй только одного рибавирина среду поддержки (среда 199) с растворен-" (строки 4 — 6, колонки 3 — 4). Это свидетельстными в ней ремантадином и рибавирином в вует о том, что в "условиях присутствия в концентрации25мкгlмл.После48чинкуба- 5 поддерживающей среде ремантадина и риции при 37 С учитывают цитопатический бавирина одновременно происходит полэффект (ЦПЭ) вирусов под малым увелйче- ное подавление *размножения исходного нием (х80) микроскопа. Полученные резуль- (йнфицирующего) вируса при свободном татй сводят в таблицу..: :-:. . размножений ремантадйнзависимого вариКак видно из представленных результа- 10 анта вируса в том же диапазоне концентратов; при инфицированиитканевой культуры . ций ремантадина, который отмечен как вирусом А/ -PV/Rostock зарегистрирована диапазон образования ремантадинзависи. 100%-ная выраженность ЦПЭ (строка 6, ко-: мого вариайта вируса при использовании лонка 9 в таблице). Такая же выраженность только одйого-ремантадина.
ЦПЭ отмечена в присутствии 6-25 мкг/мл 15 При совместном использовании реманремантадина при инфицировании этйм ае тадина и рибавирина в диапазоне концентвирусом(строки 1-3, колонка 9). Частичное раций ремантадина 6-25 мкг/мл имеет подавление развития ЦПЭ отмечено в при- место менее высокая выраженность ЦПЭ в сутствий 0,7 и 0,1 мкг/мл ремантадина сравнении с rpynnaми, в которых присутст (строки4и5, колонка 9). "" 20 вовал только одйн ремантадин в этих же.
Таким образом, концентрации реманта- концентрациях (строки 1 — 3, сравнивают кадина 6- 25 мкг/мл соответствуютдиапазону лойки 3, 4 и 9, 10). Эти данные отражают образования ремантадинзависимого вари- подавление размножения части популяции анта вируса, а более низкие его концентра- вирусного потомства, соответствующей исции — диапазону подавления размножения 25 ходному (инфицйрующему) вирусу в условиисходного вируса; Вследствие относитель- ях сочетанного использования ремантадина но высокой множественйости инфицирова- и рибавирина. * ния полное подавление размножения Пример иллюстрирует воэможность исходного вируСа в концентрациях 0,7 и 0,1 четкой дифференциации ремантвдинзави- .. мкгlмл ремантадина не наблюдается. В 30 симого варианта вируса гриппа от исходносвязи с этим не исключается возможность . ro (инфицирующего) вируса в условиях как появления в присутствии более высакйх повышенной множественности инфицироконцентраций (6-.25 мкг/мл) смешанной rio- вания, так и при использовании реман1 адипуляции вирусного потомства вкоторой йа- нустойчивого варианта вируса в качестве ряду с частицами ремантадинзависимого 35 инфицирующего путем комбинации 6вариайта вйруса -п рисутствуют частицы, 25 мкг/мл ремантадина с 25 мкг/мл рибавиструктурно и функционально соответствую- рина. щие частицам исходного (инфицирующего) Пример 2. Ойерации rio способу. вируса. -:: изложенному в примере 1, выполняют с
Если инфицирование тканевой культу- 40 12 мкг/мл рибавирина. Отмечают полное ры выполняют вирусом А/FPV/Rostock, ус- подавление размножейия исходного вируса " тойчивым к действию ремантадина, в присутствии 0,7 и 0,1 мкг/MR ремантадина выраженность ЦПЭ в присутствии всех кон- (строки 4 и 5; колонка 5 в таблице) и частичцентраций ремантадина достигает конт- ное без ремантадина (сравнивают колонки ральной, 100% (колонка 10 в таблице). 45 5 и 9 в строке 6). В результате более четко
Следовательно, в этом случае какая-либо га- . проявляется диапазон образования реманрантия соответствия концентраций реман- " тадинзависимого варианта вируса (25тадина6-25мкг/млдиапазонуобразования 6 мкг/мл, строки 1 — 3, колонка 7). Если ремантадинзависимого варианта вируса от- инфицирование проводят вирусом гриппа, сутствует. 50 устойчивым к действию ремантадина, поВ то же время, при инфицировании давление размножения вируса отмечают тканевой культуры как вирусом только в пределах диапазона образования
А/FPV/Rîstoñk, так и его вариантом, уСтой- . ремантадинзависимого варианта вйруса, но чивым к действию ремантадина, одновре- не в более низких концентрациях(сравниваменное присутствие ремантадина" и 55 ют колонки 8 и 10). Сам по себе рибавирин рибавирина (25 мкг/мл) приводит к прояв- в заданной концентрации не обеспечивает лению ЦПЭ только в диапазоне концентра- антивирусного действия в отношении реций ремантадина 6-25 мкг/мл (строки 1-3, мантадинустойчивого вируса. колонки 3-4). В присутствии ремантадййа в Пример иллюстрирует возможность более низких концентрациях в комбинации дифференциации ремантадинззвисимого
1751204
8 варианта вируса от исходного(инфицирую- М трис-HCI рН 8,8 (разделяющий renb). B щего) вйруса, чувствительного к действию качестве фокусирующего геля используют ремантадина, путем комбинации 6- 5 акриламид в 0,125 М трис-HCI рН 6,8.
25 мкг/мл ремантадина с 12 мкг/мл рибави- После разделения белков гель высушивают рина, и недостаточность такой комбинации 5 и получают автографы на рентгеновской для дифференцйэцйи при исполИовайии в: плейке обычным йутем, качестве исходного вируса, устойчйвого к Для определения принадлежности к редействию ремантадина. - майтадинэависимому варианту вируса исПример 3. Операции по способу, пользуют один иэ характерных признаков, изложенному в примере 1. выполняют с 3 10 отличающих этот вариант oi èñõîäíîãî (ин мкг/мл рибавирина. Отмечают полное по- фицирующего) вйруса"..сниженное количедавление размноженйя исходйого вируса в ство М-белка и гемагглютинина и недостаприсутствии 0,7 и 0,1 мкг/мл ремантадина точное расщепление последнего, (строки 4 и 5, колонка 7 в таблице). Подавле-, Добавление ремантадина в концентрание размножения вируса без ремантадина 15 ции 20 мкг/мл не приводит к проявлению отсутствует (сравнивают колонки 7 и 9 в характерного признака"ремантэдинэависистроке 6), В результате более четко проявля- мого варианта вируса в сравнений с вируется диапазон образовайия ремантадинзэ- сом, размножэвшимся в отсутствии висимого варианта вируса (25-6 мкгlмл, химиопрепаратов. В то же время в прйсутстроки1-3,колонка7).Еслиинфицирование 20 ствии ремайтэдина в концентрации проводят вирусом гриппа. устойчивым к 20 мкг/мл и рибавиринэ в концентрации действию ремантадина, подавление 25 мкг/мл одйовременно снижается плотразмножения вируса отмечаюттолько в ность негзтйва в области раэдвления: Фъ пределахдиапазонаобразования реманта- . полипептидов с отйосительно низкой, динзависимоговариантавируса, ноневбо- 25 молекулярной массой, М и НА2, за счет лее низких концентрациях (сравнйвают уменьшения количества и неполного расколонки 8 и 10). Сам по себе рибавирин в щепления гемагглютинина. " заданной концентрации не обеспечивает Пример демонстрирует возможиость антивирусного действия в отношении ре- использованйя комбинации ремантадина и мантадинустойчивого вируса (сравнивают 30 рибавирина для дифференциации ремэнтаколонки 8 и 10 в строке 6).: - динэависимого варйанта вируса от йсходноГ1ример иллюстрирует возможность ro при исследовании полипептидного дифференциации ремайтадййзавйсимого состава в условиях. высокой множественноварианта вируса. от исходного (инфйцирую- сти инфицирования. щего) вируса, чувствительного к действию 35 Таким образом данное решение поэворемантадина, путем комбинации 6- .. ляетдостигнутьпостэвленнуюцель. Приис25 мкг/мл ремантадина с 3 мкг/мл рибави- пользовании комбинации 6-25 мкг/мл рина, и недостаточность такой комбйнации ремантадина и 25 мкг/мл рибавирина удадля дифференцйации при использовании в ется получить увеличение выхода ремантэкачестве исходного вируса, устоичивого к 40 динэависимого варианта вируса гриппа при действию-ремантадина; высокой множественности инфицирования, Пример 4. Монослойные тканевйе э также в случае использования в качестве культуры ФЭК инфицируют2-2,5 БОЕ/клет- исходного (инфицирующего) ремантадину- . ка вируса гриппа А/FPV/Rostnck путем кон- стойчивого вируса. В том случае, если в катакта вируссодержащей жидкости с 45 честве исходного использован вирус, клетками в течение 1 ч. Неадсорбирован- чувствительный к действию ремантадина, ный на поверхности клеток вирус удаляют, дифференциацию ремантадинзависимого клетки покрывают свежей средой 199 с вариантаудзется получитьи прииспольэо- растворенными в ней ремантадйном, рибз- вании комбинации 6-25 мкг/мл реманвирином или обоими химиопрепаратами 50 тадина и 3-12 мкг/мл рибавиринэ.. вместе. Через 1 ч инкубации при 37 С в Для дифференциации ремантадинзависисредуподдержки вводят25мКи/мл 140-гид-: мого вируса при использовании в качестве ролиэата хлореллы. СпуСтя еще 5 ч инкуба- инфицирующего ремантадинустойчивого ции при 37ОС монослой лизируют в буфере . вируса такая комбинация недостаточна. образца (2 додецилсульфата натрия, 5$ 55 . Следовательно, при оптимальном сочв;
2-меркэптозтанола, 0,05 М трис-НО. рН 6,8, тании концентраций двух химиопрепаратов
5$ глицерина, 5 мгlмл бромфенолового си- становится возможным накапливание ренего), прогревая при 100 С в обьеме 150- мантадинзависимого варианта вируса и ис200 мкл, Электрофорез белков проводят в пользование для его изучения методов, 12 -ном nowaêðèëàìèäíoì геле на 0,275 требующих высокой множественности ин1751204 ;0. фицирования. Кроме того, о любом случае достигается более высокая однородность получаемых препаратов ремантадинзаоисимого варианта вируса, что способ тоует получению более адекватных результатов.
Влияние комбинации ремантадина + рибаоирин на развитие цитопатического эффекта вирусов гриппа о тканеоой культуре.
П р и м е ч а н и я: ЦПЭ выражен о процентах; FPV- вирус А/FPV/Rostock; FPVR — вирус
А/FPV/Rostock, устойчивый к дейстеию ремантадина.
Составитель С.Стасснок
Техред M.Ìoðãåíòàë Корректор С.Пекарь
Редактор Н.Швыдкая .
- Заказ 2665 Тираж Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва. Ж-35, Раушская наб., 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород. ул.Гагарина, 101
Изобретение может быть использовано в исследовательской лабораторной практике для увеличения выхода (урожая) ремантадинзависимого варианта вируса гриппа.
Учитывая имеющиеся сведения о распространенности явления образования химиопрепаратзависимых вариантов. вируса на целый ряд алициклических и роизводных, обладающих противооирусными свойствами, следует ожидать столь же позитивного зффекта от применения комбинаций и этим веществ с рибавирином.
Формула изобретения
Способ получения ремантадинзависи5 мого варианта вируса гриппа путем инфицирования клеточной культуры, последующего. введения ремантадина в состав поддерживающей среды в концентрации 6-25 мкг/мл и сбора материала после завершения инку10 бации, отл ича ющи и ся тем, что, с целью увеличения выхода и повышения однород. ности получаемых препаратов ремантадинзависимого варианта вируса. в состав поддерживающей среды дополнительно
15 вводят рибавирин в концентрации 325 мкг/мл.
