Рекомбинантная плазмидная днк phiv 41-22, кодирующая кор- антиген вируса гепатита в с экспонированным на его поверхности фрагментом белка @ 41 вируса иммунодефицита человека, способ ее конструирования и штамм бактерий еsснеriснiа coli - продуцент кор-антигена вируса гепатита в с экспонированным на его поверхности фрагментом белка @ 41 вируса иммунодефицита человека

 

Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности и биотехнологии. Целью изобретения является получение структур, обладающих иммуногенной активностью кор-антигена вируса гепатита В и белка др41 вируса иммунодефицита . Изобретение позволяет получить белковые капсидные структуры, представляющие собой кор-антиген вируса гепатита В с экспонированным на его поверхности зпитопом вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) НМдр41 (78-129) и обладающие иммунологической активностью как кор-антигена , так и белка др41. Синтез таких структур кодирует рекомбинамтная плазмида pHIV41-22, которая содержит ген НВсАд с оптимизированным участком инициации трансляции и с полилинкерной вставкой по 144-й аминокислоте, где клонирован фрагмент последовательности между сайтами рестрикции ЗаиЗА и Hindll, и кодирующий участок др41 (78-129) протяженностью 154 п.о - фрагмент белка др41 с 78-й по 129-ю аминокислоту. Размер плазмиды 7057 п.о. Ген Ыа обеспечивает устойчивость к ампициллину . Ген HBcAg-HIV41 (78-129) находится под контролем тан дема промоторов Ptrp и обеспечивает синтез целевого продукта . Штамм-продуцент имеет выход конечного продукта 3,3% от суммарного белка Е. coli. 3 с.п. ф-лы, 2 табл. сл 41 сл ш Ю „«ъ о

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛ ИСТИН Е СКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ж

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4746991/13 (22) 10.08,89 (46) 30.07,92. Бюл. М 28 (71) Институт органического синтеза

АН ЛатвССР и Отдел медицины (Шарите)

Университета Гумбольдта (Берлий) (DE) (72) Райнер Ульрих, Регина Меринг, Ингрид

Лэтч, Томас Постманн, Гюнтер Петцольд, Ханс Альферд Розенталь (DE), Г. П. Борисова, И. Г. Берзинь, Д. Э. Дрейлиня, В. Я. Лосева, Ю. А, Озолс, В. П. Осе, В. В.

Цибиногин, П. П. Пумпен, Э. Я, Грен и П. M. Пушко (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ

ДНК рН!Ч41-22, КОДИРУЮЩАЯ СЛИТЫЙ

БЕЛОК КОР-АНТИГЕН ВИРУСА ГЕПАТИТА

В С ЭКСПОНИРОВАННЫМ НА ЕГО ПОВЕРХНОСТИ ФРАГМЕНТОМ БЕЛКА др 41

ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА,СПОСОБ EE КОНСТРУИРОВАНИЯ И

ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLIПРОДУЦЕНТ KQP-АНТИГЕНА ВИРУСА ГЕПАТИТА С ЭКСПОНИРОВАННЫМ НА ЕГО

ПОВЕРХНОСТИ ФРАГМЕНТОМ БЕЛКА др

41 ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности и

Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности, биотехнологии.

Целью изобретения является получение структур, обладающих иммуногенной активностью кор-антигена вируса гепатита В и белка gp41 вируса иммунодефицита.

Цель достигается в результате конструирования рекомбинантного гена

Н BcAg HI V-gp41 (78-129), кодирующего синтез соответствующего белка, и плазмиды

„„Я2 „„1751210 А1 (s>)s С 12 N 15/51, 15/48, 5/10

2 биотехнологии. Целью изобретения является получение структур, обладающих иммуногенной активностью кор-антигена вируса гепатита В и белка др41 вируса иммунодефицита, Изобретение позволяет получить белковые капсидные структуры, представляющие собой кор-антигем вируса гепатита

В с экспонированным на его поверхности эпитопом вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) Н!Чдр41 (78 — 129) и обладающие иммунологической активностью как кор-антигена, так и белка др41. Синтез таких структур кодирует рекомбинантная плазмида рН!Ч41-22; которая содержит ген НВсА9 с оптимизированным участком инициации трансляции и с полилийкерной встэвкой по

144-й аминокислоте, где клонирован фрагмент последовательности: между сайтами рестрикций Sau3A и Hind!i!, и кодирующий участок др41 (78-129) протяженностью 154 п.о — фрагмент белка др41 с 78-й по 129-ю аминокислоту. Размер плазмиды 7057 п.о.

Ген Ыа обеспечивает устойчивость к айпициллину. Ген HBcAg-Н!Ч41 (78-129) находится под контролем тандема промоторов .

Perp и обеспечивает синтез целевого продукта. Штамм-продуцент имеет выход конечного продукта 3,3 / от суммарного белка

Е, coil. 3 с.п, ф-лы, 2 табл. рН!Ч41-22 для его экспрессии, а также штамма-продуцента E. со!! (рН!Ч41-22) рекомбинантной капсидной структуры

H BcAg HIV-gp41 (78 — 129);

Рекомбинантная плазмида рН!Ч41-22 состоит из следующих элементов:

ДНК плазмиды рНВс1615, которая представляет собой вариант плазмиды .рНВс3, содержащей ген HBcAg с оптимизированным участком инициации трансляции, но с мутантным геном HBcAg, содержащим

1751210 полилинкерную вставку .по 144-й аминокислоте и предназначенным для внедрения чужеродных последовательностей по этому участку„ протяженность 6900 п.о, фрагмента генома ВИЧ, клонированно- 5

ro в плазмиде рВН10 и кодирующего участок gp41 (78 — 129), протяженностью 157 п.о.

Размеры плазмиды 7057 n.o., мол.м.

4,52 МДа.

Сущность способа конструирования 10 плаэмиды pHIV41-22 состоит в том, что фрагмент гейа епч ВИЧ, именуемый

HlVgp41 (78 — 129) протяженностью 154 п.о, внедряют по сайту рестрикции Cia I в векторную плазмиду рНВс1615 с обраэовани- 15 ем рекомбинантиого гена Н В сАд-Н !Ч-gp41 (78 — 129).

Штамм-и родуцент H BcAg-H IVgp41 (78—

129) получают трансформацией клеток Е, соИ RRI рекомбинантной плазмидной. ДНК 20 р H1V41-22.

Штамм: характеризуется следующими

n ри знаками.

Морфологические признаки: клетки палочковидной формы, грамотрицательные, 25

Культуральные признаки . клеткй растут на обычно используемых питательнь х средах, образуют колонии средней велйчины.

Физико-биохимические призйаки: оптимальная температура культивирования 30

37ОС, оптимум рН 7,0-7,4. В качестве источника углерода используют углеводы, в качестве йсточника азота — минеральные соли, а также органические соединения в виде пептона, триптона, аминокислот. 35

Устойчивость к антибиотикам; устойчив в ампициллину, что; обусловлено наличием плазмиды. Присутствие в штамме плазмидной ДНК подтверждают путем"проверки устойчивбсти к ампициллину, а также путем 40 выделения и анализа пладмидных ДНК.

Продуктивность штамма — 3,3% целево го продукта от суммарного белка E. соИ.

Штамм депонирован в коллекции Цент рального музея и ромышленных микроорга- 45 низмов под номером ВКПМ В-4972.

Пример 1;

1. Конструирование рекомбинаитной плазмидной ДНК pHIV41-22, 2 мкг ДН К плазмиды рНВс1615 расщеп- 50 ляют 4 ед. рестриктазы Cta I в 25 мкл раствора А, содержащего 10 мМ трис-ЙС!, рН 7,5, 50 мМ NaCI и 10 мМ MgCIz, в течение 1 ч при

37 С. Рестриктазу инактивируют 15-минутным прогреванием при 65 С. Заполнение 55 липких концов проводят в 100 мкл раствора

Б, содержащего 50 мМ трис-HCI, рН 7,5, 10 мМ МдС!г, 10 мМ дитиотрейтол, 25 мМ

NaCl, 100 мкМ dATP, dCTP, dTTP u dGTP u

5ед. ДНК-полимеразы Е. соИ(фрагмент Кленова), в течение 1 ч при 12 С. После очистки в агарозном геле ДНК растворяют в 20 мкл

Н20 (ДНК 1).

20 мкг ДНК плазмиды pSS 3,8 несущей субклонированый фрагмент генома ВИЧ; расщепляют 50 ед. рестриктаэы Bgl ll в 100 мкл раствора В, содержащего 10 мМ трисHCI, рН 7,5; 10 мМ MgCIg, в течение 2 ч при

37 С, наносят инкубационную смесь на 1%ный агарозный гель, выделяют фрагмент размером 1430 п.о., липкие концы заполняют, как указано выше (ДНК 2).

5 мкг.ДНК 2 расщепляют.10 ед. Sau ЗА и 10 ед, Hindi! в 20 мкл раствора А в течение

2 ч при 37 С. Фрагмент $ац 3A — Н1пбй выделяют на легкоплавкой агарозе (ДНК 3).

0,1 мкг ДНК 1 и 0,05.мкг ДН К 3 сшивают

Т4 ДНК-лигазой в 10 мкл раствора С, содержащего 50 мМ трис-НС1, рН 7,5; 10 MhA

МдС!2, 10 мМ дитиотрейтол, 50 мкМ АТР и

10 ед. Т4 ДНК-лигаэы, в течение 12 ч при

4 С. Для трансформации клеток к реакционной смеси добавляют 100 мкл клеток Е; coll

RRI, обработанных хлористым кальцием.

Отбор клонов осуществляют путем рестрикциоииаго анализа плаэмидной ДНК, выделенйой экСпресс-методом, Плаэмида с ожидаемой рестрикциойной картой получает наименование pHIV41-22.

2; Штамм-и родуцент Е; соl} RRI (pHI4122). Выделение и очистка рекомбинант toto белка Н BcAg-Н Ид р41 (78 — 129).

Штамм-продуцент получают трансформацией клеток Е. соИ RR1 рекомбинантной плазмидой рН1Ч41-22. Клетки выращивают в солевой среде М9 с добавкой, г/л: казамииовые кислоты 10; глюкоза 2, ампициллин

0,02 до оптической плотности ОПоэо 4-5, Клетки собйрают цеитрифугированием и лизируют в трехкратном объеме буфера, содержащего 0,05 M трис-HCI, рН 8,0; 0,15 М

NaCI, 0,1% тритон Х-100, 0,005 М ЭДТА, 3 мг/мл лизоцима. После инкубации в течение 30 мин при 4ОС клетки подвергаюттрехкратному замораживанию — оттаиванию, добавляют дезоксирибонуклеаэу и Vig Clz до конечной концентрации 20 мкг/мл и 10 мМ соответственно и иикубируют 30 мин при

4ОС, Лизат подвергают ультразвуковой обработке втечение 30 с, осветляют центрифугированием.

Лизат подвергают фракционироваиию сульфатом аммония. НВсАд-Hlgp41 (78129) собирают в осадке, полученном при

30% насыщения сульфатом аммония. Оса-. док растворяют в 0,04 M фосфате натрия, рН

8,0; 0,15 М NaCI, 0,1% тритоне X-100 до конечной концентрации белка 25-50 мг/мл и 6 — 7 мл этого раствора наносят на колонну с Сефароэой CL 4В (2,1 х 75 см), уравнове1751210

6 шенную тем же буфером, но без тритона

Х-100. Фракции, проявляющие PBcAg— активность, собирают и используют либо непосредственно, либо после концентрирования переосаждением 50%-ным сульфатом аммония.

3. Определение HBcAg — активности rieтодом РИД, Титр HBcAg определяют с помощью радиал ьной иммунодиффузии (Р ИД), Дл я этого готовят двукратные серийные разведения клеточного лизата и титруют против анти-НВс антител человека, В качестве

10 стандарта используют очищенный HBcAg, полученный из рекомбинантных бактерий (1 мг/мл). Результаты титрования методом х 0,75 мм, Злектрофорез проводят в те30 чение 15 ч при силе тока 7 мА. После злектрофореза белки переносят нэ нитроцеллюлозные фильтры, инкубируют с моноклональными анти-gp41 антителами ÇD6 в

35 разведении.1:500 на буфере TBS, содержащем 50 мМ трис-HCI, рН 7,8; 150 мМ NaCI, 0,1% тритон Х-100, 1% БСА, в течение 15 ч при 20 С, После трехкратной отмывки буфером TBS фильтры инкубируют 2 ч при 20 С с коньюгатом пероксидазы с энтителами против иммуноглобулинов человека в разведении 1:16, Фильтры отмывают буфером

TBS (3 — 5 раз) и проявляют диаминобензидином. Лизаты клеток штамма-продуцента обнаруживают при этом появление специ- 45 фических зон окраски, соответствующих. белку с мол.м. 25,5 кДа (или длиной 241 аминокислота). Контрольные лизаты клеток

Е, соИ К802 (рН ВсЗ) таких зон не обнаружи50 вэют. !

5, Анализ пространственной структуры . рекомбинантного белка, Препараты очй щенного белка

Н BcAg Н1 1/-gp41 (78-129) (описано выше) готовят методом негативного контрэстирования с применением 1/-ного уранилацетата и исследуют на электронном микроскопе при ускоряющем напряжении 80 кВ и инструментальном увеличении 100 000 раз. БеРИД приведены в табл. 1, 4. Определение gp41-активности методом иммуноблотинга. Мол.м. белка

Н ВсА9HIV-gp41 (78-129).;- .. 20

Для иммуноблотинга клетки (6 мг) суспендируют в 100 мкл буфера для нанесения образцов на полиакриламидный гель, содержащего 2%-ный додецилсульфат натрия (ДСН) и 2%-ный j3-меркаптозтанол, и лизи- 25 руют 2 мин прогреванием на кипящей водяной бане. Полученные лизаты (2 — 4 мг!мл белка) наносят нэ полиакриламидный градиентный гель (12-18%) размером 150 х 150х лок HBcAgHIV-gp41 (78 — 129) образует капсиды диаметром 25 нм, Пример 2, Определение gp41 "активности в составе капсидных структур

HBcAg-gp41 (78-129) методом знзимоиммунологического анализа на твердой фазе.

В качестве твердой фазы используют полистироловые 96-луночные планшеты для иммунологических реакций. Очищенный балок HBcAg-HIVgp41 (78 — 129) разводят до концентрации 10 мкг/мл в 50 мМ ИаНСОз.

Иа СОз, рН 9,5 и вносят в лунки планшетов по 100 мкл в каждую. Инкубируют 16 ч при

37 С, после чего раствор удаляют из лунок, планшеты высушивают. В лунки вносят моноклональные айти-gp41 антитела человека в разведении 1;5000 на буфере TBS. После инкубации в течение 2 ч при 37 С планшеты отмывают 5— - 6 раз дистиллированной водой и вносят по 10 мкл конъюгата пероксидазы хрена с белком S. auieus в разведении

1 5000 на буфере ТВ$, После инкубации в течение 1 ч планшеты отмывают и проводят цветную реакцию, В лунки вносят по 100 мкл 0,25%-ного раствора ортофенилдиамина 2НС! в 0,1 M цитрате натрия, рН 5,0;

0,02% Н202, инкубируют 30 мий при 20 С, . реакцию останавливают добавлением

100 мкл 0,1 í. H CI, Появление коричневой окраски свидетельствует о наличии gp41-активности, для количественной оценки активности измеряют-оптическую плотность при 492 нм, Отсутствие реакции в отрицательном контроле (HBcAg) свидетельствует о специфичности связывания анти-9р41 антител рекомбинантными капсидными структурами H BcAg-g ð41 (78 — 129).

Пример 3. Определение gp41-активности на поверхности кэпсидных структур методом иммунноэлектронной микроскопии.

Капсиды HBcAg-HIVgp41 (78 -129) сорбируют на никелевой сеточке, покрытой формваровой пленкой, в течение 15 мин, Сеточку промывают 05 мл раствора PBS, содержашего 0,05% Твин 20 (PBS-Твйн 20), и инкубируют 15 мин в 0,03 мл 0,1%-ного раствора БСА в воде, промывают 0,5 мл

PBS-Твин 20, инкубируют 15 мин в 0,03 мл раствора моноклонэльных анти-gp41 антител человека в разведении 1;10, промывают

0;5 мл PBS-Твин 20, инкубируют 20 мин в

0,03 мл антител (кролика) против иммуноглобулинов человека (в разведении 1:5), промывают 0,5 мл PBS-Твин 20. Сеточку. помещают на 1 ч в 0.03 мл раствора рА-AU, содержащего белок А, который конъюгирован с частицами коллоидного золота диаметром 5 — 8 нм, промывают 0,5 мл PBS-Твин

20 и затем 1 мл H.о Капсиды окрашивают

1751210

Таблица 1

Синтез HBcAg -Н!Ч9р41 (78-129) в бактериях Е.coll RRI. несущих рекомбинантную плазмидную ДНК рН!Ч41 — 22

Титр в РИ

ОП650

Белок, мг/мл

k BcAg, мг/мл

Штамм

Выход и о кта.

E.co!I RRI

Н !Ч41-22

3,3

1:32

15,0

0.5 методом негативного констрастирования

0,15 мл 2 -ного уранилацетата, Все операции выполняются при 20 С. В случае поверхностной локализации соответствующих эпитопов капсиды на электронной микрофотографии окружены венчиком частиц коллоидного золота. В качестве отрицательного контроля используют капсиды

HBcAg, не несущие эпитоп gp41 (78-129).

Эти капсиды не образуют комплексов с коллоидным золотом. Не образуются комплексы также в отсутствие специфических антител.

Пример 4, Иммуногенная активность рекомбинантных капсидных структур.

Для определения иммуногенности рекомбинантными капсидами .HBcAgHIVgp41 (78-129) иммунизируют кроликов.

Для этого смешивают 2 мг антигена, растворенного в 1 мл физиологического раствора

PBS, с 1,25 мл полного адъюванта Фрейнда и получают гомогенную эмульсию. Антиген вводят подкожно. Инъекции антигена rioвторяют на 14-й. и 21-й день и с 28-го.дня начинают брать кровь, Специфйчность антител определяют методом ИФА с исполь.. зованием двух антигенов: HBcAg (для определения анти-НВс антител), fr-Н!цр41 (для определения анти-gp41 антител). Титры антител на 28-й день иммунизации приведены в табл, 2, Таким образом, изобретение позволяет получить рекомбийантные капсидные структуры, обладающие бифункциональной активностью по кбр-антигену вируса гепатита В и зпитопу белка gp41 вируса иммунодефицита человека.

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плэзмидная ДНК

pHI41-22, кодирующая кор-антиген вируса гепатита В с зкспонировэннйм на его поверхности фрагментом белка gp41 вируса иммунодефицита человека, размером 7057 п.о. и мол.м. 4,52 МДа, содержащая

Сlа - С1а I — фрагмент ДНК плазмиды рНВс1615, размером 6900 п.о.;

Sau3A — Hln dill — фрагмент плазмиды

pSS 3,8, размером 157 п.о.; уникальные сайты рестрикции с координатами:

5 Bam Н! 0 (нэчало координат)

Sph I 91

Sa! I 276

Nru l 599

Sna 1871

10 Ай I I I 2098

pst 3236

Sca I . 3471.

Xba I 5176, генетические маркеры и регуляторные

15 участки: ген Ыэ, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, — координаты 2918-3778;

orl -точку начала репликации — координаты 2153 — 2159;

20 ген HBcAg-Н!Чцр41 (78 — 129), находящийся под контролем тандема промоторов

Ртгр, — координаты 4905 — 4937 и 5015 — 5047.

2. Способ конструирования рекомбинантной плазмидой ДНК рН!Ч41-22 кодиру25 ющей кор-антиген вируса гепатита В с экспонированйым нэ его поверхности фрагментом белка gp41 вируса иммунодефицита человека, заключающийся в расщеплении

ДНК плазмиды pSS 3,8 рестриктазой Bgl И, 30 выделении фрагмента размером 1430 п.о., гидролизе его рестриктазами Sau ЗА и

HIndlll, выделении фрагмента, содержащего часть генома вируса иммунодефицита человека, лигирОвании его с помощью

35 ДНК-лигазы с ДНК плазмиды рНВс1615, предварительно гидролизованной рестриктазой Cia I, трансформации лигазной смесью клеток Е. coll RR1, отборе с помощью рестриктного анализа клонов, несу40 щих плазмиду pHIV41-22.

3, Штамм бактерий Escherichta coll

ВКПМ В-4972 — продуцент кор-антигена вируса гепатита В с экспонированным на его

45 поверхности фрагментом белка gp41 вируса иммунодефицита человека.

1751210

Таблица 2

Иммуногенность химерных капсид HBcAg-HIVg р41 (78 — 129) /

Составитель Т.Забойкина

Техред М.Моргентал Корректор С.Пекарь

Редактор Л.Павлова

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород. ул.Гагарина. 101

Заказ 2665 Тираж . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва. Ж-35. Раушская наб., 4/5