Питательная среда для выделения чумного микроба

 

Использование: медицинская микробиология и эпидемиология, а именно выделение всех известных подвидов чумного микроба при эпизоотологическом обследовании природных очагов. Сущность изобретения: питательную среду для выделения чумного микроба, содержащую, г/л: гидролизат казеина 11,0-13.0; гидролизат кормовых дрожжей 1.1-1,3; фосфорнокислый однозямещенный калий 2,4-2,6, фосфорнокислый двуззмещенный натрий 7,4-7,6; молибденовокислый аммоний 0,4-0,6; глюкоза 1,4-1,6; лимоннокислый натрий 0,9-1,1; танин 0,019-0,021- генцианвиолет 0,0024- 0,0026 и агар (порошок) 14,0-16,0, готовят смешением сухих компонентов с применением приема тритурации для введения танина и генцианвиолета. Сконструированная среда позволяет выделять все известные подвиды чумного микроба в R-форме при эпизоотологическом обследовании природных очагов. 3 табл. СО

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (Я)5 С 12 Q 1/04

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОВРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4720766/13 (22) 14.07.89 (46) 30.07,92. Бюл. М 28 (71) И ркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока (72) 3. И. Васильева, М, П. Маевский, А. A. Болдина и А, Г. Вылков (56) Тумановский В, M., Бахрах Е. Э., Обухова 3. А., Юргина 3. A. Получение сухих пита. тельных сред для диагностйки чумного микроба. Труды института "Микроб", Сара: .:тов, 1958, вып. 2, с. 383-387.

Трофименко H. 3. Разработка и внедрение в практике сухйх питательных Сред для диагностики возбудителей ООИ: Дйсс. канд. биол. наук, Иркутск, 1971, с. 165. . Регламент производства N. 119-88. Питательная среда для культивирования чумного микроба сухая. Иркутск, 1988, 204 с. (54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧУМНОГО МИКРОБА

Изобретение относится к медицинской микробиологии и биотехнологии и может быть использовано для выделения всех известных подвидов чумного микроба при эпизоотолотйческом обследовании природных очагов., j ь

Широко известны питательные среды для вйделенйя чумнЬго микроба: Туман-. ского и агар Хоттингера, содержащие в своем составе питательные основы (мяса, кровй, казвина). Эти среды готовят на дистлллированной воде с солевыми компонентами, затем кипятят, фильтруют и стерилйзуют.

„, Я2„„1751211 Al

2 (57) Использование: медицинская микробиология и ЗпИдемиолОгия, а именно вйделение всех известных подвидов чумного микроба при эпизоотологическом обследовании природных очагов. Сущность изобретения: питательную среду для выделения чумного микроба, содержащую, г/л: гидролизат казвина 11,0-13,0; гидролизат.кормовых дрожжей 1.1-1.3; фосфорнокислый однозамещейный калий 2;4-2,6; фосфорнокислый двузамещенный натрий 7,4 — 7,6; молибденовокислый аммоний 0,4-0,6; глюкоза

1,4-1,6; ллмоннокислый натрий 0,9-1,1: танин 0,019 — 0,021: генцианвиолет 0,00240,0026 и агар {порошок) 14,0 — 16,0,. готовят смешением сухих компойентов с применением приема тритурации для введения та- нина и генцианвиолета. Сконструированная среда позволяет выделять все известные подвиды чумного микроба в R-форме при эпизоотологическом обследовании природных очагов. 3 табл.

Известна сухая питательная среда для культивирования чумного микроба, используемая для выделения возбудителя чумы при обследовании природных очагов, содержащая ферментативный гидролизат казеина, ферментативный гидролизат кормовых дрожжей, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, натрий пиросернистокислый (метабисульфит натрия), агар и дистиллированную воду.

Недостаток известной среды заключается в том, что среда требует добавки генцианвиолета ех tempore при исследовании эктопаразитов и трупного материала, При выделении тиаминзависимых штаммов чум1751211

1, t— - 1,3

1,4 — 1,6

7;4-7,6 ного микроба в среду после стерилизации добавляют ех tempore витамин В ;

Недостатком способа изготовлейия известной среды является то, что среду из сухого порошка изготавливают только в специализированных лабораториях, так как агаровые студни стерилйзуют в автоклавах, разливают в стеклянную тару и дбставляют для работы в зпидотряды автотоа |Ciiîðòîì, где расходуют в течение 1 — 3 мес. Хранение готовой среды в течение 1-3 мес при температуре от 1 до 39 С резко снижает ее качество, Целью изобретейия является повышение ростовых свойств среды и ее селективности в отношении R-форм чумного ми к роба всех подвидо в.

Эта цель достйгается тем, что пйтательная среда Для выделейия чумного микроба, содержащая Иитательнйе"основы Ътар; минеральные солй и дистиллированную воду, в качестве пйтательных основ содержйт гидролизаты казвина и кормовых дрожжей, дополййтельно содержит танин, глюкозу, натрий лимоннокйслый и генцианвиолет, в качестве минеральных солей — калий фосфорнокислый однозамещенный; натрий фосфорнокислый двузамещеййый, аммоний молибденовокислый при следующем количественном соотношений компонентов, г/л:

Гйдралйзат казейна (порошок): " 11;0 — 13,0

Гидролизат кормовых дрожжей (порошок)

Глюкоза

Натрий лимоннокислый 0,9 — 1,1

Танин 0,019-0;021

Калий фосфорно- . кислый однозамещенййй: 2,4 — 2,6

Натрий фосфорнокислый двузамещенный

Аммоний молибденовокислый . 0,4 — 0,6

Агар 14,0 — 16,0

Генцианвиолет 0,0024 — 0,0026

Дистиллированйая вода . 1 л

В среде, взятой за прототип, ростовые свойства обеспечивают компоненты, входящие в ферментативные гидролиэаты каэеина и дрожжей, которых недостаточно для роста всех известных подвидов чумного микроба, В предлагаемой среде сухой гидролиэат казеина является питательной основой, су1,1

1.4

7,4

1,3

1,6 хой гидролизат кормовых дрожжей содержит комплекс витаминов, необходимых для роста чумного микроба, глюкоза и натрий лимоннокислый являются источниками уг5 лерода для построения клетки, калий фосфорнокислый однозамещейный, натрий фосфорнокислый двуэамещенный и молибденовокислый аммонии являются осмотическими стабйлизаторами, оказывающими

10 буферное действие и поддерживающими на необходимом уровне рН среды, танин и кри-:, сталлический фиолетовый подавляют йостороннюю микрофлору. Такая рецептура. среды с минимальным, максимальным и

15 средним содержанием компонентов обеспечивает прорастание на среде всех известных подвидов чумного микроба из малых . посевных доэ (10 м.к,) s òèïè÷íîé Й -форме. питательную среду готовят смешением

2Q сухих компонентов с применением приема тритурации для введения танина и генцианвиолета, Пример 1. Смешивают сухие компоненты, г:

25 Гидролизат казвина (порошок) :.: 11,0

Гидролиэат кормовых дрожжей (riîðoшок)

30 Гл|окоза

Натрий лимойнокислый .: ". . 0,9

Танин : . 0,019

Калий фосфорйо35 кислый однозамещенный 2,4

Натрий фосфорнокислый двуэамещенный:

40 Аммоний молибденовокислый 0,4

Агар 14 0

Генцйанвиолет 0,0024

Полученную навеску среды растворяют в 1

45 л дистиллированной воды, тщательно размешивают, нагревают на медленном огне до полного расплавления, кипятят 3-5 мин, ох- . лаждают до 45-50ОС, Готовую среду разливают в стерильйые чашки Петри.

50 Пример 2; Для приготовления 1 л питательной среды смешивают сухие компоненты, r;

Гидролизат каэеина

{порошок) . . 13,0

55 Гидролиэат кормовых дрожжей (порошок)

Глюкоз а

Натрий лимоннокислый 1,1

1751211

Танин 0,021

Калий фосфорнокислый однозамещенный

Натрий фосфорнокислый двузамещенный . 7,6

Аммоний молибденовакислый 0,6

Агар 16,0

Ген циан виолет 0,0026 . Среду готовят, как в примере 1.

Пример 3. Смешивают сухие компоненты, г:

Гидролизат казеина (порошок) 12,0

Гидролизат кормо вых дрожжей (riopoшок)

Глюкоза ,Натрий лимоннокислый 1,0

Танин " - 0,02

;Калий фосфорно:кислый однозамещейный . Натрий фосфорнокислый двузамещенный . 7,5

Аммоний молибденовокислый 0,5

Агар 15 0

Генцианвиолет . 0,,0025

Среду готовят, как в примере 1.

Ростовые свойства предлагаемой среды с минимальным, максимальным и средним количеством компонентов оценивают йутем посева 10- и 100 микробйых клеток двухсуточной агаровой культуры возбудителя чумы разных подвидов, а также посева

opraHos животных, зараженных вирулентными штаммами чумного микроба и суспен зий инфицированных блох, через 24 — 48 ч инкубации при 28 С, В качестве контрольных сред используют среду Туманского и казеиново-дрожжевой питательный агар для культивирования чумного микроба.

На предлагаемой среде и контрольных средах испытаны штаммы чумного микроба:

ЕВ, И-2377, выделенный в Горно-Алтайском природном очаге и Р-1680, выделенный в

Армянском нагорном очаге. Для инфицирования биопробных животных и блох использованы штаммы; И-3226, выделенный в

Тувинском природном очаге, И-3160, выде ленный в Сайлюгемском очаге и И-2422, выделенный в Северо-западной части

Монгольского Алтая.

Результаты раста чумного микроба на предлагаемой среде приведены в табл. 1 и

2,6

1,2

1,5

2,5

2, из которых следует, что предлагаемая среда обладает достаточной чувствительностью, количество, выросших клеток на предлагаемой и контрольной средах одинаково.

5 Однако на предлагаемой среде морфология колоний типичная в R-форме с кружевной зоной и бугристым центром для штамма чумнсга микроба из Забайкальского, Тувинского, Горно-Алтайского и Закавказского

10 природных очагов, в то время как на контрольной среде морфология колоний чумного микроба атипичная (кружевная эона отсутствует; колонйи плоские), и рост штаммов

Закавказского очага чумы отсутствует.

15 Бактериологические исследование ор- . ганов павших животных и суспензий блох (табл, 3), инфицированных вирулентными штаммами чумного микроба, свидетельствует о том, что на предлагаемой среде через

20 24 ч инкубации при 28 С формируются колонии, имеющие все признаки, типичные для чумного микроба. Среду можно применять для исследования полевого материала при эпизоотологическом обследовании разпич25 ных природных очагов чумы, в то время как при использовании прототипа невозможно выделйть чумной микроб в Закавказском нагорном очаге (табл. 2).

Проведено испытание предлагае30 мой среды в полевых условиях: МНР, в

Забайкальском, Тувинском природных очагах. Исследована 2116 грызунов и млекапитающйх, 19610 эктопаразитов, при этом выделено 47 штаммов чумного микроба.

35 Предлагаемая среда стандартна, не нуждается в фильтрации, стерилизации; добавке ех tempore витамина Bi, генцианвиолета, и поэтому в отличие от прототипа среду можно готовить в неспециализиро40 вайных лаборатОриях полевых формирований. Приготовление среды способом смешения сухих компонентов позволяет сократить длительность технологического цикла в сравнении с прототипом на 40 ч.

Формула изобретения

Питательная среда для выделения чумного мйкрэба, содержащая ферментативный гидролизат казеина; ферментативный

50 гидролизат кормовых дрожжей, фосфорнокИслый однозамещенный калий, фосфарнокислый двузамещенный натрий, стимулятор роста, агар и дистиллированную воду, а т и и ч à ю щ а я с я тем, что, с целью повыше55 ния ростовых свойств среды и ее селектив-. ности в отношении R-форм чумного микроба всех подвидов, она даполнйтельно содержит глюкозу, лимоннокиспый натрий, танин, генцианвиалет, в качестве стимулятора раста — малибденовокислый аммоний при сле1751211

Танин

Однозамещенный фосфорнокислый калий

Фосфорнокислый двузамещенный натрий

Молибденовокислый аммоний.

Генцианвиолет

Агар

Дистиллированная вода

0,019 — 0,021

2,4-2,6

11-13

7,4-7;6

1,1-1,3

1,4-1,6 0,4-0,6

0,0024-0.0026

14-16

0,9-1,1

1л

Таблица 1

Результатй роста чумного микроба на предлагаемой среде с минимальнйм, максимальным .и: средним колицеством компонентов

»»»»» »»«еъ

Контрольная .среда

° Й 1l ° ° «М»«е е

Предлагаем»ая "среда,- соде»ржащая келйче»ство компонентов

Номер атаммов

» ««е«е ° е е» «

Среднее ""

Минимальное

Максимальное

Чувстви" тельность

Морфоло" гия ко» лоний

««е

«» °

»»»»»»»»»

Чувстви- Морфоло- Чувствитель- гия ico- тельность 1лоний ность

Иорфоло" гия колоний

Чувствител ьность

Иорфоло" гия колоний

I.ревс3.в EU Типичная (вакцинный)

I.pestis 1994 Типичйая 9 е

° »

Типичная 9

Типичная 9 тйпичная 9

Типичная 9

Типичная 9

Тийицная 9

Типичная

Z,paatia 1995 Типичная 9

Типичная 9

I,pestis 3278 Типичная 8

Типичная 9

Тийичная 9

I.pestis 3277 Типичная 8

I.pestis 2359 Типичная 8

Типичная 9

Типичная 9

Типичная 9

I.pestis 3202 Типичная 9

Типичная 9

Типичная 9

Z.pestis 3181 Типичная 8

Типйцная 9

Типичная 9 .Типичная 9

I.pestis 95 Типичная В

I.pestis 227 Типичная В

Типичная 9

Типичная 9

Типичная 9

Типичная 8 .

Типичная .9 типичная 8

Типичная 8

Типичная 8

Типичная 8

Типичная 9 Типичная 8

Типичная 8 нет нет нет нет .

Het нет нет . йет йет

Роста

Роста Роста

"Роста

Роста

Рост а

Роста

Роста

Роста

«» «»е»»»«»»»»

» - — 1-— дующем количественном соотношении компонентов, r/ë:

Ферментативный гидролизат казеи на(по сухой массе)

Ферментативный гидролизат кормо-. вых дрожжей (по су- . хой массе)

Глюкоза

Лимоннокислый натрий

Т..pestiв 1680 Типичная 9 .

1.pestis 2677 Типичная В

I,pestis 3161 Типичная 9.

I.pestis 3162 Типичная . 8

I.pestis 3163 Типицйая 7

I.ðåsЫв 31б4 Типичная 8

I.pestis 3165 Типичная В

I.pestis 3166 Типичная В

I.pestis 1823 Типичная 8

I.pestis 1822 Типичная 8

Типичная g . Типичная В "

Типичная 9

Типичная 9

Типичная 8 . Типичная 8

Типичная 8

Типичная 9

Типичная 9

Типичная 9 .

Атипич"" 9 ная

Атипйч- 9. ная

Атйпич" 9 ная

, Атипич" 9 нвя

Атипич- В ная

Атипич" 8 ная

Атипич" 9 ная

Атипич" 9 ная

Атипич" 8

Зтйпич- 9 ная

Роста нет

9 1751211 10

Табли ча 2

Результаты роста штаммов чумного микроба, выделенных из различных очагов чумы на предлагаемой среде и контрольной

Наименование природного очага мае ° ° ма ю в Вв eeаев а ° «а ° °

° м»«аам Ююе мeeeeюааeeм««

Средйее число выросших колоний из 1 00 м.к . (5 определевний) в еемеаюмм еаа веммм«юмюеа

Йа предла- На контрольгаемой,". ной среде среде

Номер штаммов чумного микроба ммюмюе ««ее««««» ° е ю м М ««Юа» ° в «мм «м«ае«м» вм««««««««

Забайкальский .":: 1994 . 92:; 87.:,::.::.:: -, .;:: ..:1995 ., 95 . 89

: .... "::;, - ::- ::..;..:;1996,.:92 . 85

Горно-Алтайский : 3278: 73 .. " 71. .-, -:,::2377 .71:-,, .. 70

2359, 75 .:, . 72

3209 .:70 :" : 70

3202 . 74 :. 73 3181 76 . . 70

Тувинский .: : : 95 .:.: 78;: . 60

22е7 . 75 . :- -:: 66

Заеакаа вкаэсакий . 1680: 64;: .:.:..: Роста неет

2677 55 ;: . " Роста- нет

:::;:.. 316:1:. 57 Роста нет, ..3162 65,:: . .: Роста нет.3)63 63 - :- :: ": Ро с1 а н ет . 3167 66:: ; Ро с.та нет"

3164 59, . .::: Роста нет

: -;)-165 "; 60 -,:, . Роста, нет

-, "..™, = . ... :;:, 3166. 62:: -:- Роста нет.1823 65 : :; Роста нет аа аа а м а ee ° аа « а маа et ««м «м Юм мм м Юа м а ° а ю ее м Ю ювв м в аа «а ««ее «««а ««а ° Е м

1 ., Таблица 3

Результаты бактериологического испытания предлагаемой средаы в полаеавых условиях в

, сравнении с контрольной е

"ПМ вЂ” посторонняя микрофлора, Составитель Я.Бухаров

Редактор Н.Швыдкая Техред М,Моргентал . Корректор С.Пекарь е

Заказ 2665 Тираж . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Раушская наб;, 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101