Способ получения 2-кето-d-глюкаровой кислоты

 

Изобретение относится к области технической микробиологии и касается способа получения 2-кето-О-глюкаровой кислоты, которая может быть использована в качестве добавки к корму, для приготовления детергентов , пластификаторов цемента и б качестве реагента при изучении метаболизма сахаридов. Цель изобретения - удешевV ление целевого продукта. В качестве предшественника 2-кето-6-глюкаровой кислоты используют моносахариды или их производные общей формулы Н ОН ОН I I l RV-RJ-C - С-С-СН2ОН , ОН Н Н, где, Ri -СНО, -СН2ОН, -СООН; R2-HCOH, НОСН,- СО . Окисление указанных соединений1 проводят штаммами бактерий нового вида Pseudogluconobacter saccharoketogenes К591с (PERM BP-1130, IFO 14464), или 12-5 (PERM BP-1129, IFO 14465), или ТН14-86 (PERM BP-1128. IFO 14466), или 12-15 (PERM ВР-1132, IFO 14482), или 12-4 (PERM BP-1131, IFO 14483), или 22-3 (PERM BP-1133, IFO 14484). Процесс окисления проводят при 23- 35°С, рН 6,0-7,5 в течение 50-100 ч. Содержание предшественника в среде 5-20 мае. %/объем. 2 ил,, 2 табл. (Л с

СОЮЗ СОВЕТСКИХ сОциАлистических

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ . К ПАТЕНТУ

1 (21) 4028737/13 (22) 25.12.86 (31) 294577/85 (32) 26.12.85 (33) JP (46) 07.08.92. Бюл. ЬЬ 29 (71) Тэкеда Кемикал Индастриз, Лтд(ЗР) (72) лидео Сирафудзи, Такамаса Ямачучи и

Икуо Ногами (JP) (56) Патент ЧССР М 222577, кл. С 12 Р 7/50, 1984. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 2-КЕТО-0-ГЛ!ОКАРОВОЙ КИСЛОТЫ (57) Изобретение относится к области технической микробиологии и касается способа получения 2-кето-0-глюкаровой кислоты, . которая может быть использована в качестве добавки к корму, для приготовления де- тергентов, пластификаторов цемента и в качестве реагента при изучении метаболизма сахаридов. Цель изобретения — удешевИзобретение относится к технической микробиологии и касается способа получения 2-кето-0-глюкаровой кислоты, которая может быть использована в качестве добавки к корму для приготовления детергентов, пластификаторов цемента и в качестве реагента при изучении метаболизма сахаридов, Известен способ получения 2-кето-0глюкаровой кислоты микробиологическим окислением 0-глюкаровой кислоты действием микроорганизма Pseudomonas

aeruglnosa. 0-глюкаровую кислоту получают из гл окозы химическим окислением. . Недостатком известного способа является высокая стоимость целевого продукта.

Цель изобретения — удешевление целе= вого продукта, . Ж l753949 АЗ (я)5 С 12 P 7/50, С 07 С 59/105 ление целевого продукта. В качестве предшественника 2-кето-0-глюкаровой кислоты используют моносахариды или их производные общей формулы

Н ОН ОН !

R1-й;С вЂ” С вЂ” С-СНгОН, I

QH Н Н где, Ri = -СНО, -CHzOH, -СООН; Яг — НСОН, НОСН, СО, Окисление указанных соединений проводят штаммами бактерий нового вида Pseudogluconobacter saccharoketogenes

К591с (FERM BP-1130, IFO 14464), или 12 — 5 (FERM BP-1129,. IFO 14465), или ТН14 — 86 (FERM B P-1128, IFO 14466), или 12 — 15 (FERM

B P-1132, IFO 14482), или 12 — 4 (FERM BP-1131, IFO 14483), или 22 — 3 (FERIVI BP-1133, IFO

14484). Процесс окисления проводят при 2335 С, рН 6,0 — 7,5 в течение 50-100 ч. Содержание предшественника в среде 5 — 20 мас. Я,/объем. 2 ил., 2 табл, В качестве предшественника 2-кето-Dглюкаровой кислоты используют моносахариды или их производные общей формулы (p

Ri Ы)

RI2

О

Н0-С-Н

I О н- -он

Н-С-ОН

СН2-ОН

6д где Ri,=- -СНО, -СНгОН, -СООН, Яг= НСОН, НОСН,= СО, а окисление проводят штаммами бактерий

PseudogIuconobacter saccharoketogenes

К591с (F ERM В Р-1130, IFO 14464), или 12-5 (РЕЯМ BP-1129, IFO 14465), или ТН14 — 86

1753949

25

24-34 С. Растет в пределах рН 5,5 — 8,7. Оптимальное значение рН составляет примерно 6,0-7,5. 50 (FERM ВР-1128, IFO 14466), или 12 — 5 (FERM

ВР-1132, IFO 14482), или 124-4 (FERM BP. 1131, IFO 14483) или 22 — 3 (FERM BP-1133, IFO 14484) при 23 — 35 С, рН 6,0-7,5 в течение 50 — 100 ч и содержании указанных моносахаридов или их производных в среде 5 — 20 мас/обьем.

Штамм К591 и штаммы 12 — 5, 12 — 15, 12—

4 и 22 — 3 выделены иэ образцов почв, собранных в префектурах Япония — Вакагама и Сига. Каждый из указанных штаммов имеет следующие таксономические признаки.

Таксономические характеристики штаммов К591с и 12-5.

Морфологйя, Клетки палочковидные размером 0,30,5 х 0,7 — 1,4 мкм. Полиморфизм клеток не обнаружен. Клетки подвижные. имеют порядка 2 — 4 полярно расположенных жгутика.

Споруляоия не обнаружена. Грамотрицательные, Некислотостойкие.

Рост на различных средах.

Питательный агар: рост слабый, На питательном агаре с дрожжевым экстрактом образует круглую, сплошную, гладкую, опалесцирующую колонию. Скошенный питательный агар с дрожжевым экстрактом: рост средней степени. Образует нити, гладкие, опалесцирующие. Жидкая питательная сре- . да с дрожжевым экстрактом; рост средней степени, По всей поверхности среды образует однородную мутность.

Столбик >келатины с питательной средой: рост слабый, только в верхней части.

Разжижения желатины не происходит, Лакмусовое молоко окисляет, Коагулирует.

Физиологические признаки..

Восстанавливают нитрат, хотя слабо; денитрификация не обнаружена. Положительная проба метилкрасного. Индол и сероводород не образуются. Крахмал не гидролиэуется. Цитрат не утйлизируется.

Соли аммония утилизируются. Пигментообраэования не обнаружено. Образует уреазу.

Оксидазоположителен. Каталазоположителен. Растет в интервале 16 — 36 С. Оптимальная температура составляет примерно

Аэроб, Образует кислоту, а не гэз иэ 1=арабикозы, D-ксилозы, D-глюкозы, D-фруктозы, D-галактозы, D-мэннозы, мальтозы, сахарозы, лактоэы, трегалозы, D-маннита и глицерина. Не образует ни газа, ни кислоты из

D-сорбитэ, инозита или крахмала.

Другие характеристики.

Образует уксусную кислоту из этанола, хотя в количестве следов. Рост зависит от

40 биотина, тиамина, рибофлавина и кофермента А (далее СоА), Образует диоксиацетон из глицерина. Содержание гуанина=цитозина в ДН К составляет примерно 67+ 1 мол, og

Содержит убихинон (кофермент Q) с 10 изопреновыми единицами (Со 01о). Устойчив к стрептомицину.

Таксономические признаки штамма 12—

15.

Морфология, Клетки палочковидные размером примерно 0 3-0,5 х 0,7 — 1 4 мкм. Полиморфизм клеток не обнаружен. Клетки подвижные, имеют порядка 2 — 4 полярных жгутика, Споруляция не обнаружена. Грамотрицательные. Некислотостойкие, Рост на различных средах, Питательный агар: рост слабый, При культивировании на питательном агаре на дрожжевом экстракте образует круглую, сплошную, гладкую, опалесцирующую колонию. Скошенный питательный агар с дрожжевым экстрактом: рост средней степени.

Образует нити ровные, опалесцирующие.

Жидкая питательная среда с дрожжевым экстрактом: рост средней степени. Образует одинаковую мутность по всей поверхности среды, Столбик питательного желатина: рост слабый, только в верхней части. Разжижения желатина не происходит, Лакмусовое молоко окисляет. коагулирует.

Физиологические характеристики, Нитрат не восстанавливает. Денитрификация не обнаружена. Положительная проба метилкрасного. Индол и сероводород не образует. Крахмал не гидролизует. Цитрат не утилизирует. Утилизирует соли аммония. Пигментообразования не обнаружено.

Образует уреэзу. Оксидаэоположителен.

Кэталазоположителен. Растет в интервале

23-32 С. Оптимальная температура составляет примерно 28 — 32 С. Растет в пределах рН 6,0 — 7,5, Оптимальное значение рН составляет примерно 6.5 — 7,1.

Аэроб.

Образует кислоту, а не газ из 1=арабиноэы, D-ксилоэы, О-глюкозы, D-фруктозы, Dгалактозы, D-маннозы, мальтозы, сахарозы, лактозы, трегалозы и глицерина. Не образует ни кислоты, ни газа из D-маннита, D-сорбита, инозита или крахмала.

Другие характеристики, Образует уксусную кислоту из этанола, хотя в количестве следов. Рост зависит от биотина, тиамина, рибофлавина и СоА. Образует диоксиацетон из глицерина. Содержание гуанина+цитозина в ДНК составляет порядка 67+ 1 мол. . Содержит убихцнон

1753949 с 10 изопреновыми единицами (Со Ою). Устойчив к стрептомицину, Таксономические признаки штамма 12 — 4, Морфология; 5

Клетки палочковидные размером 0,3

0,5 х 0,7 1,4 мкм. Полиморфизма клеток не обнаружено, Клетки подвижные, имеют 2 — 4 полярных жгутика. Споруляция не обнаружена. Грамотрицательные, Некислотостой- 10 кие, Рост на различных средах.

ПитательНый агар: рост только очень не- большой колонии, полный обзор невозможен. При культивировании на питательном 15 агаре с дрожжевым экстрактом образует круглую, сплошную, гладкую, опалесцирующую колонию, Скошенный питательный агар с дрожжевым экстрактом, рост средней степени, 20 образует нити ровные, опалесцирующие.

Жидкая питательная среда с дрожжевым экстрактом; рост средней степени с образованием однородной мутности по всей поверхности среды. Столбик питательного 25 желатина: рост скудный, только в верхней части, Желатин не разжижается. Лакмусовое молоко окисляется, но не коагулирует.

Физиологические характеристики.

Не восстанавливает нитрат. Денитри- 30 фикация не обнаружена. Положителен в пробе метилкрасного. Индол не образует..

Сероводород образует. Крахмал не гидролизует. Цитрат не утилизирует. Утилизирует соли аммония. Пигментообразование не об- 35 наружено. Образует уреазу, Оксидазоположителен, Каталазоположителен, Растет в интервале 16-36 С, оптимальная температура составляет 24-34 С. Растет в интервале значений рН 5,5-8,2. 40

Оптимальное значение рН составляет 6,07,5, Аэроб.

Образует кислоту, а не газ из L-арабинозы, О-ксилозы, О-глюкозы, D-фруктозы, 45

0-галактозы, D-маннозы, мальтозы, сахаро- . зы, лактозы, трегалозы и глицерина. Не образует ни кислоту, ни газ из О-маннита, D-сорбита, инозита или крахмала.

Другие характеристики. 50

Образует уксусную кислоту из эталона, хотя в количестве следов. Рост зависит от биотина, тиамина. рибофлавина и СоА или пантотеновой кислоты. Образует диоксиацетон из глицерина, Содержание гуанина+ 55 цитозина в ДНК составляет порядка 67+ 1 мол.%. Содержит убихинон с 10 изопреновыми единицами (Со Ощ). Устойчив к стрептомицину.

Таксономические признаки штамма 22Морфология.

Клетки палочковидные размером 0,30,5 х 0,7 — 1,4 мкм. Полиморфизм клеток не обнаружен. Клетки подвижные с 2 — 4 поляр- . ными жгутиками. Споруляция не обнаруже- . на. Грамотрицательные. Некислотостойкие.

Рост на различных средах.

Питательный агар: рост только очень небольшой колонии, полный обзор невозможен. При культивировании на питательном агаре с дрожжевым экстрактом образует круглую, сплошную. гладкую. опалесцирующую колонию, Скошенный питательный агар с дрожжевым экстрактом: рост средней степени. Образует нити ровные, опалесцирующие.

Жидкая питательная среда с дрожжевым экстрактом: рост средней степени с образованием одинаковой мутности по всей поверхности среды. Столбик питательного желатина: рост скудный, только в верхней части, Разжижение желатина не происходит, Лакмусовое молоко окисляет, но не коагулирует.

Физиологические характеристики.

Восстанавливает нитрат, хотя слабо, Денитрификация не обнаружена. Положительная проба с метилкрасным. Индол и сероводород не образует. Крахмал не гидролизует. Цитрат не утилизирует. Утилизирует соли аммония. Пигментообразование не обнаружено, Образует уреазу.

Оксидазоположителен. Каталаэоположителен. Растет в интервале 16-38 С, оптимальная температура составляет 24 — 34 С.

Растет в интервале рН 5,5-8,7. Оптимальное значение рН составляет 6,0-7,8.

Аэ раб.

Образует кислоту, а не газ из L-арабинозы, О-ксилозы, D-глюкозы, D-фруктозы, Dгалактозы, 0-маннозы, мальтозы, сахарозы, лактозы, трегалозы и глицерина. Не образует ни кислоты, ни газа из D-маннита, D-сорбита, инозита и крахмала, Другие характеристики.

Образует уксусную кислоту из этанола. хотя в количестве следов, Рост зависит от биотина, тиамина, рибофлавина и СоА или пантотеновой кислоты. Образует оксиацетон из глицерина. Содержание гуанина + цитозина в ДНК составляет порядка 67+ 1 мол.%. Содержит убихинон с 10 изопреновыми единицами (Со Q>o). Устойчив к стрептомицину.

Штаммы К591с, 12-5, 12-15, 12-4 и 22 — 3 не принадлежат к известным родам, а представляют новый бактериальный вид нового

1753949

10

50

55 рода, названный Pseudogluconobacter

saccharoketogenes.

Указанные бактериальные штаммы в некоторых случаях обозначаются как окисляющие бактерии, Их потребности в питании для роста следующее.

У штаммов К519с, 12 — 5, 12 — 15 необычные потребности в питании, т,е. для роста им необходим СоА, В указанных трех штаммах кофермент А нельзя заменить. пантотеновой кислотой, Штаммы 12 — 4 и 22 — 3 могут расти в присутствии СоА и/или пантотеновой кислоты.

Бактериальные штаммы включают также мутанты, полученные путем облучения указанных штаммов ультрафиолетовыми и рентгеновскими лучами или обработкой их химическими мутагенами, например N-Метил-К -нитро-N-нитрозогуанидином (нитрозогуанидином), метилметансульфонатом или азотсодержащей горчицей.

Примером мутанта является штамм

ТН14 — 86, который получен из штамма К591с путем обработки нитрозогуанидином, Этот штамм имеет таксономические характеристики, аналогичные материнскому штамму, за исключением того, что он обнаруживает повышенную способность образовывать 2кето-0-глюкаровую кислоту из сахаридов.

Штаммы К591с, 12 — 5, 12-15, 12-4, 22-3 и ТН 14-88 сданы на хранение в Институт по ферментэции. Осака (IFO), а также в Исследовательский институт ферментации (FERM) Агентства Промышленной науки и технологии Министерства международной торговли и промышленности, На основании

Будапештского Договора указанные микроорганизмы хранятся в FRI, Депозитарные номера микроорганизмов представлены в табл,1, Соединения, которые используют в изобретении в качестве предшественника, включают D-глюкозу, 0-фруктозу, 0-мэннозу, 0-сорбит, 0-маннит, D-глюконовую кислоту, 2-кето-D-глюконовую кислоту, D-глюкозон и D-манноновую кислоту (указанные соединения далее сахариды), Сахариды можно вводить в среду либо вначале культивирования несколькими порциями, либо непрерывно в течение всего процесса культивирования. Концентрация сахаридов в реакционной жидкости должн1 составлять 5 — 20 мас,%/oáúåì, В реакционной жидкости значение рН устанавливают в пределах 5,5 — 7,5. Температуру и время реакции окисления. поддерживают в интервале примерно 23 — 35оС и около 50-100 ч. Культуральная среда может быть либо жидкой, либо твердой. В среду включают источники углерода, азота, мине8 ральные и органические кислые соли и питательные вещества в количестве следов. Сахариды можно использовать в качестве источников углерода без обработки. Как дополнительные источники углерода могут быть использованы глицерин, сахароза, лэктоза, мальтоза, меласса.

В качестве источников азота в среду включают соли аммония (сульфат, нитрат, хлорид, фосфат), кукурузный экстракт(далее

CSL), пептон, мясную вытяжку, дрожжевой экстракт, сухие дрожжи, соевую муку, муку из семян хлопка и мочевину. Минеральные соли включают соли калия, натрия, кальция, магния, железа, марганца, кобальта, цинка, меди.

Питательные вещества, которые используют в количестве следов, включают витамины, необходимые для роста указанных бактерий, например СоА; пентотеновую кислоту, биотин, тиамин и рибофлавин, э также соединения со стимулирующим действием на рост бактерий и продуцирование

2-кето-D-глюкаровой кислоты,. например флэвин-мононуклеотид (ФМН), флавин-адениндинуклеотид (ФАД), другие витамины, Lцистеин, L-глутаминовая кислота и тиосульфат натрия в виде либо химических соединений, либо природных веществ, которые их содержат.

Культивирование бактерий проводят и методами статического культивирования, встряхивания в колбах, глубинного культивирования. Условия культивирования зависят от бактериального штамма, состава среды и других факторов, В качестве компонентов среды могут использоваться стерилизованные бактериальные культуры

ВасИ! из cereus IFO 3131

ВэсИЬз subtilis IFO 3023

Bacillus pumilus IF0 12089

Васйоз megaterium, IFO 12108

Bacillus amyloIiquefacIens IFO 3022

Pseudomonas trifolii IFO 12056

CItrobacter freundii IFO 12681

Escherichia coli IFO 3546

Erwlnia herbkola lFO 12686

Культуру указанных бактерий высевают в соответствующую среду, выращивают при

20 — 40 С в течение четырех дней и после стерилизации полученный бульон добавляют в среду окисляющих бактерий в соотношении 0,5-5,0% (объем/объем).

2-Кето-0-глюкаровую кислоту, которая образуется и накапливается в реакционной жидкости, выделяют и очищают традиционными способами. При этом 2-кето-D-глюкаровую кислоту получают в виде свободной кислоты либо соли натрия, калия, кальция, аммония, Например, 6актериальные клетки

1753949

10 удаляют предварительно из реакционной сокоэффективной жидкостной хроматогражидкости фильтрацией или центрифугиро- фии, конечный культуральный бульон содерванием. В случае необходимости осуществ- жит 9,02 мг/мл 2-кето-D-глюкаровой ляют обесцвечивание активированным кислоты, Для удаления бактериальных клеуглем. Затем раствор концентрируют до 5 ток указанный культуральный бульон (590 осаждения кристаллов. Образующиеся кри- мл) центрифугируют и получают 580 мл надсталлы собирают и перекристаллизовыва- осадочной жидкости. Образующуюся надют. осадочную жидкость пропускают через

Продукт, полученный согласно изобре- колонку с катионообменной смолой! В 120 В тению, идентифицирован как 2-кето-D-глю- 10 в Н+-форме, после чего для удаления катиокаровая кислота путем определения нов колонку промывают 150 мл деионизофизико-химических свойств (элементного- ванной водй. Далее надосадочную состава, точки плавления, вращения пло- жидкость пропускают через колонку с актискости поляризации) и ИК-спектра., вированным углем (70 мл), колонку промыВ результате высокоэффективной жид- 15 вают 50 мл деионизованной воды, затем костной хроматографии проведен количест- элюент (780 мл) доводят до рН 6,5 с повенный анализ 2-кето-0-глюкаровой мощью Са(ОН)г, послеудаления белоймути кислоты. Подвижная фаза; разбавленная фильтрацией его концентрируютдо примерсерная кислота. рН 2,2; скорость потока 0.5 но 20 мл при пониженном давлении. мл/мин; детектор: дифференциальный ре- 20 Образуемые в концентрате белые аморфрактометр; колонна с насадкой из сульфи- фные кристаллы собирают на стеклянный рованного полистирольного геля (колонна фильтр, промывают последовательно нетипа SCR — 101Н, размер 7,9 мм х 30 см), В большими порциями холодной воды, метакачестве стандартного образца использова- нола и этилового эфира и высушивают при на известная 2-кето-0-глюкаровая кислота. 25 пониженном давлении. Получают 5,04 г 3,5Изобретение позволяет получать 2-ке- гидратированного дикальций-2-кето-D-глюто-О-глюкаровую кислоту с высоким выхо- карата. Аналитические данные полученного дом, продукта следующие.

На фиг.1 и 2 показана инфракрасная Точка плавления: 152-157ОС (разложеобласть спектров поглощения кристалличе- 30 ние). ского вещества, полученного в примере 1, и .. Данные элементного анализа: стандартного образца, полученного в конт- - Вычислено, %: С 23,30; Н 4,24: Са 12,96, рольном примере, . CsHg0sCa 3,5HzO

Пример 1 (контрольный); 30 мл среды, Найдено, %: С 23,15; Н 4,18; Са 14,00, состоящей из, %: пептон 0,5; дрожжевой 35 Удельное вращение плоскости полдриэкстракт 0,5; 0-глюкоза и К2НРОд 1,0 (далее зации (a)o =-+9,0 (с = 1,075, 0,1 í HCI), ПДГ-среда), помещают в 200.мл коническую ИК-область спектра поглощения: волноколбу и автоклавируют при 120 С в течение вые числа главного поглощения имеют сле20 мин. В указанную колбу вносят "полную дующие значения: петлю" свежих клеток Pseudomonas 40 волновое число, см-1: 3590, 3500-2700

aeruginosa (IF0 3448), выращенных topi (шир), 1650, 1600, 1430, 28 С в течение двух дней на скошенном" 1380, 1360, 1300, 1250, 1240. 1220, 1125, агаре, который приготовили путем введения 1095, в среду ПДГ2% ага ра. Затем бактериальные 1065, 1040, 1005, 995, 900. 840, 800, 765, клетки выращивают путем встряхивания с 45 725, вращением(200об./мин)при30 С втечение Пример 2. 20 мл среды для посева, 24 ч. В качестве посевной культуры исполь- состоящей иэ 2,0% О-глюкозы, 1,0% пептоэуют полученный культуральный бульон, на, 1,0% сухих дрожжей и 2,0% СаСОз, по5мас.%!oáüåì водногораствора моно- мещают в 200 мл коническую колбу и калиевой соли О-глюкаровой кислоты, пред- 50 автоклавируют в течение 20 мин при 120 С. варительно доведенного до рН 7,0 с В укаэанную колбу инокулируют одну "полпомощью NaOH, фильтруютчерез пористый ную петлю" клеток штамма фильтр с размером пор 0,45 мк для удаления Pseudogluconobacter saccharoketogenes микробов, послечего прибавляют его в ПДГ- R591c (FER BP-1130, IFO 14464), выращенсредедоконцентрации1мас.%/объем,1мл 55 ных при 28оС в течение четырех дней на указанного посевного культурального буль- скошенном агаре, состоящем из, %; D-сорона переносят в 200 мл коническую колбу, бит 2,5; пептон 1,0; дрожжевой экстракт 1,0; содержащую 20 мл указанной среды, и вы- СаСОз 0,2 и агар 2,0, с последующим кульращивают с встряхиванием в течение 24 ч тивированием с встряхиванием (200 при 30 С. Как обнаружено в результате вы- об./мин) при 30 С в течение дьух дней с

1753949

5

25

35

50

55 получением культурального бульона с посевным материалом, Отдельно 200 мл среды, состав которой аналогичен указанной среде для посева, помещено в 1 л коническую колбу и простерилизовано при таких же условиях, как указано. После этого в указанную колбу переносят 10 мл культурального бульона с посевным материалом и затем проводят культивирование с встряхиванием при 30 С в течение трех дней, Образующийся культуральный бульон содержит 19,4 мг/мл 2-кето-0-глюкаровой кислоты. Этот культуральный бульон (1600 мл) центрифугируют (7000 об./мин в течение 10 мин) для удаления осадка, содержа- 1 щего бактериальные клетки, и получают .

1520 мл надосадочной жидкости. После охлаждения до 4 С ее выдерживают в течение трех дней. Получают аморфные кристаллы

2-кето-0-глюкарата кальция. Образующие- 2 ся кристаллы собирают на стеклянном фильтре, промывают последовательно небольшими порциями холодной воды, метанола и этилового эфира, высушивают над пятиокисью фосфора при пониженном давлении. Получают 18 г тригидратированного дикальций-2-кето-глюкарата. Аналитические данные конечного кристаллического продукта следующие, Точка плавления: 152-157 С (разложеwe).

Данные элементного анализа:

Вычислено, %: С 24,00, Н 4.03, Са 13,35.

С6Н6ОвСа ЗН20

Найдено, %: С 23,96, Н 4,16, Са 13,00.

Удельное вращение плоскости поляризации света: (а)р = +7,9 (с = 1,065, 0,1 и

Н CI).

L1 К-область спектра поглощения; волновое число, см : 3590, 3500, 34002700 (шир.), 1I650, 1600, 1430, 1380, l360, 1300, 1250, 1240, 1220, 1125, 1093. 10650. 1040, 1005, 995, 995, 900, 840, 800, 765, 725.

Указанное кристаллическое вещество и стандартный образец имеют одинаковый

ИК-спектр (фиг,1 и 2 соответственно), одно и то же время удерживания (9,4 мин) при высокоэффективной жидкостной хромэтографии и одинаковое отношение поглоще-. ния ультрафиолетовых лучей при 214 нм к показателю дифференциальной рефракции (примерно 1,0). Кристаллическое вещество и стандартный образец подвергают тонкослойной хроматографии при комнатной температуре в течение 3 ч, используя целлюлозную пластину Мечск и смесь, состоящую из фенола, муравьиной кислоты и воды (75:5:25). Оба образца имеют одинаковое значение Rf, кроме того, проявляют себя одинаково в реакциях окрашивания: оба меняют цвет до черновато-коричневого, желтого и желтого при взаимодействии с нитратом серебра, о-фенилендиамином и анилинофталевой кислоты соответственно.

На основании указанных аналитических данных продукт идентифицирован как 2-кето-D-глюкаровая кислота.

Пример 3. Используя методику примера 2, готовят культуральный бульон штаммов К591с (FERM BP-1130, IFO 14464), 12 — 5 (FERIVI BP-1129, IFO 14465), 12-15 (РЕЯМ

BP-1132, IFO 14482), 12 — 4 (FERM BP-1131, IFO 14483) и 22-3 (FERM BP-1133, IFO

14484).

Сбраживаемую среду получают путем добавления сахаридов при концентрации 5 мас.% /объем (табл.2), предварительно простерилизованных, в сред (рН 6,5), состоящую из, %: кукурузный экстракт 0,5; сухие дрожжи 0.5; сульфат. аммония 0,5; сульфат натрия 0,05; сульфат железа 0.2 и СаСОэ 3,0.

1,25 мл культурального бульона каждого штамма переносят в 200 мл коническую колбу, содержащую 25 мл укаэанной среды, и культивируют с встряхиванием при 30 С в течение трах дней. Полученный культуральный бульон разбавляют 0,3 и серной кислотой и центрифугируют. Г)осле этого образующуюся надосадочную жидкость подвергают высокоэффективно и жидкостной хроматографии для определй йя содержания 2-кето-0-глюкаровой кислоты.

B табл,2 представлен количественный выход 2-кето-0-глюкаровой кислоты (мг/мл).

Время удерживания при жидкостной хроматографии высокой разрешающей способности и величина Rf при тонкослойной хроматографии полученного продукта равны 9,4 мин и 0,20 соответственно, что соответствует значениям стандарта, Пример 4. Среду (500 мл), состоящую иэ 2,0% О-глюкозы, 1,0% пептона, 1,0% сухих дрожжей, 2,0% карбоната кальция и

0,01% актокола (антивспенивающий агент), помещают в двухлитровую колбу и автоклавируют при 120 С в течение 20 мин. Бактериальные клетки штамма 12-5 (FERM

BP-1129, IF0 14465), выращенные при 28ОC в течение четырех дней на скошенном arape, суспендируют в 10 мл стерильной воды.

Полученную суспензию переносят в указанную колбу, после чего проводят культивирование с встряхиванием (85 встрях./мин) при

28 С в течение двух дней с получением культурального бульона для использования в качестве посевной культуры.

1753949

144

144

144

144

144

144

Отдельно суспендируют в 10 мл стерилизованной воды бактериальные клетки

Bacillus megaterium (IFO 12108), выращенные при 28 С в течение двух дней на скошенном агаре (состав среды описан в 5 примере 2). Образованную суспензию ино-, кулируют в колбе, в которой содержится такая же среда, после чего ее подвергают культивированию с возвратно-поступательным встряхиванием (84 встрях./мин) при 10

28 С в течение двух дней с получением культурального бульона Bacillus megaterium.

30 л среды (рН 7,0), состоящей из, %: сахароза 4,0; мука из семян хлопка 4,0;

К2Н РО4 0.65; КНгРО4 0,55; сульфат аммония 15

0,05; NaCI 0,05; сульфат магния 0,05 и пантотенат кальция 0,05, помещают в 50-литро вый ферментер и автоклавируют при 125 С в течение 20 мин. 1 и бульона с посевной культурой Bacillus megaterium помещают в 20 укаэанный ферментер и культивируют в течение четырех дней при,28 С и внутреннем давлении 1,0 кг/см в условиях аэрации с одновременным перемешиванием (200 об./мин). Полученный культуральный.буль- 25 он стерилизуют паром при 120 С в течение

20 мин, хранят в прохладном месте и используют в качестве стерилизованной культурал ьной жидкости B ac iil us m ega terium как компонента сбраживаемой среды. 30

120 л сбраживаемой среды, состоящей иэ, %: D-глюкоза 10,0; пептон 1,0; сульфат железа 0,1; L-цистеин 0,01; карбонат кальция 6,08; 1 мкг/мл Ф1ЛН, 1 мкг/мл гидрохлорида тиамина, 0,5 мкгlмл биотина, 0,02% 35 актокола и 4,0% указанного стерилизованного культурального бульона Bacillus

megaterium, ïoìåùàþò в 200-литровый ферментер, стерилизуют при 125 С в течение 20 мин, 10 л бульона с посевной культурой по- 40 мещают в ферментер и культивируют при

28 С и давлении 1,0 кг/см. при аэрации 96 л/мин в течение четырех дней с перемешиванием при скорости 200 об./мин. Полученный культуральйый бульон содержит 99,3 45 мг/мл 2-кето-D:-rëþêàðotaoé кислоты.

Указанный культуральный бульон (1IO л), очищенный в центрифуге (1500 об./мин), дает примерно 31 кг мокрого осадка. Его промывают 150 л воды, центрифугируют (3000 об./мин), суспендируют в 30 л ацетона, центрифугируют (3000 об,/мин). Получают порошок белого цвета, который высушивают при 50 С в течение 24 ч при пониженном давлении. Степень чистоты полученного неочищенного порошка составляет 58,9% в расчете на свободную 2кето-0-глюкаровую кислоту.

©ормула изобретения

Способ получения 2-кето-D-глюкаровой кислоты, включающий окисление предшественника 2-кето-0-глюкаровой кислоты действием микроорганизма в среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и ростовые вещества, с последующим выделением целевого продукта иэ культуральной жидкости, отличающийся тем, что, с целью удешевления целевого продукта, в качестве предшественника 2-кето-D-глюкаро- вой кислоты используют моносахариды или их производные общей формулы

Ri i 2

HO-С вЂ” Н

Н-С-OH

Н вЂ” С вЂ” ОН !

СН -ОН где R< — -СНО, -СН ОН, - СООН, R2 = НСОН, НОСН, > СО, а окисление их проводят штаммами бактерий

Pseudogluconobacter saccharokeIogenes K91c (FERM BP-1130, lFO 14464), или 12 — 5 (FERM

ВР-1129, IFO 14465), или ТН14 — 86 (FERM BP1128, IFO 14466), или 12 — 15 (FERM BP-1132, lF0 14482), или 12 — 4 (FERM BR-1131, IFO

14483), или 22 — 3 (FERM BP-1133, IFO 14484) при 23 — 35 С, рН 6,0 — 7,5 в течение 50 — 100 ч и содержании указанных моносахаридов или их производных в среде 5 — 20 мас,%/îáúåì.

Таблица 1

1753949

l00!

200 lOOO 800 6SO домчи числ О f слу J

@< .7 . чачеиитЬвт (cm ) - Таблица2

1753949

Г00

04000

3600 3000 2500 2000 1600 !600 i 400 !200 oooo 600 650

6олмо4се w ceo (. -

Фиг. д

Составитель Г.Голева

Техред M,Mîðãåíòàë. Редактор И.Шулла

Корректор О,Густи

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 2777 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5