Способ получения аминогрупп в хитозане и его водорастворимых производных

 

Использование: в аналитической химии, при использовании хитозана в медицине и биотехнологии. Сущность изобретения: к раствору исследуемого полимера добавляют буфер, фермент - холинэстеразу и его субстрат, и определяют активность фермента по сравнению с контрольной пробой, не содержащей полимера. Содержание аминогрупп, рассчитывают по формуле А „ V/V| - 1. К Jr, где А m содержание аминогрупп , мас.%; V - активность фермента в отсутствии полимера, Е/мг; Vi - активность фермента в присутствии полимера, Е/мг; К- коэффицпент пропорциональности; m - масса полимера в реакционной смеси, мг, 1 ил.

СОЮЗ СОВЕТ СКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (sI)." С 12 Q 1/46, С 08 В 37/08

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4773508/05 (22) 25,12.89 (46) 15.08.92. Бюл. 1Ф 30 (71) Ленинградский технологический институт им. Ленсовета и Институт эволюционной физиологии и биохимии им, И, М, Сеченова (72) А. А. Прокопов, Е, Б. Никольская и Л, П.

Кузнецова (53) 547.995.12(088,8) . (56) Авторское свидетельство СССР

N 802290, кл. С 08 В 37/08, 1981.

Губен-Вейль. Методы органической химии, M.; Госхимиздат, 1963, с, 687-688. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АМИНОГРУПП В

ХИТОЗАНЕ И ЕГО ВОДОРАСТВОРИМЫХ

ПРОИЗВОДНЫХ

Изобретение относится к аналитической химии, в частности к определению содержания аминогрупп в хитозане и его производных.

Известен способ определения аминогрупп в хитозане и его производных путем перевода полймера в водный раствор с последующим анализом аминогрупп методом потенциометрического титрования, Недостатком данного способа является высокий предел обнаружения аминогрупп и недостаточная надежность их определения.

Понизить предел обнаружения аминогpyrin и обеспечить надежное их определение в хитоэане и его производных позволяет способ, основанный на методе Ван-Слайка принятый за прототип, По данному способу водный раствор полимера обрабатывают азотистой кислотой, измеряют объем выделившегося азота и рассчитывают содержа Ж,, 1754780 А1 (57) Использование: в аналитической химии, при использовании хитозана в медицине и биотехнологии. Сущность изобретения: к раствору исследуемого полимера добавляют буфер, фермент — холинэстеразу и его субстрат, и определяют активность фермента по сравнению с контрольной пробой, не содержащей полимера. Содержание аминогрупп, рассчитывают по формуле А =

V/Vi — 1

=K, где А — содержание аминогв рупп, мас,%;.V — активность фермента в отсутствии полимера, Е/мг, Vi — активность фермента в присутствии полимера, Е/мг; К вЂ” коэффициент пропорциональности; m — масса полимера в реакционной смеси, мг, 1 ил. ъ ние аминогрупп. Недостатком прототипа является высокая сложность и трудоемкость способа.

Целью изобретения является упрощение способа при сохранении низкого преде- . ла обнаружения аминогрупп, Поставленная цель достигается тем, что к раствору добавляют буфер, фермент — xo vac epaay и его субстрат, и регистрируют активность фермента по сравнению с контрольной пробой, не содержащей полимера. а содержание аминогрупп рассчитывают по формуле

V/Vl — 1

m где А — содержание аминогрупп, мас.%;

V — активность фермента в отсутствие полимера, Е/мг;

Vi — активность фермента в присутствии полимера, Е/мг;

1754780

К вЂ” коэффиЦиент пропорциональности и m — масса полимера в реакционной смеси, мг.

Пример 1. Перед определением аминогрупп в хитозане и его производных 5 проводят градуировку по хитоэану с известным содержанием аминогрупп, Градуировка метода., Стандартный образец хитоэана из панциря краба анализируют на аминогруппы 10 методами потенциометрического титрования и Ван-Слайка и находят их содержание

8,7 мас.%, Готовят точно 0,2%-ный раствор станДйртного хитозана в 0,1 М уксусной кислоте 15 и разводят водой до концентрации полимера 0,025, 0,0175, 0,0125 и 0,005%, Затем отбирают по 1 мл каждого раствора и каж.дйй раз добавляют о реакционную смесь, составленную из 1 мл раствора и ромышлен- 20 кого препарата бутирилхолинэстеразы сыворотки крови лошади (КФ 3.1.1.8) с активностью 1 Е, 1 мл 0,5 М хлорида калия и 1 мл фосфатного буфер (1/300 М, рН 7,5).

Реакцию начинают добавлением 1 мл 25

5 10 M бутирилтиохолина при 25 С. В последнююю (контрольную) пробу вместо раствора хитозана вводят 1 мл воды. Рабочие концентрации хитоэана о реакционной смеси составляют 0,005, 0,0035, 0,0025, 0,0010 и 30

0% соответственно, Активность фермента измеряют методом потенциометрического .титрования при рН 7,5 и выстраивают градуировочную пряму1о в координатах Ч/Ч вЂ” молярная концейтрация аминогрупп. На 35 графике, приведенном на чертеже, отмечают интервал рабочих концентраций аминогрупп — (0,2 — 1,8) 104 ммоль/мл. Для удобства вычислений выводят расчетную .форМулу . 40

А (V/Vi — 1) cog а Мин и 100 где А — содержание аминогрупп, мас. %; а — угол наклона прямой, Мин — моле- 45 кулярная масса аминогруппы (MNH = 16): и — степень разведения раствора полимера (n = 5);

m — масса полимера в реакционной сме- „ си, мг.

Объединяют множитель (clgQ Мин пх

x100) в коэффициент и ропс рциональности К

К=сщаМин и 100=2,73 10 /(4,15- 55

1,0) 16 5 100 = 0,69 и получаем окончательную расчетную формулу

V/V — 1

Определение аминогрупп, Анализируют образец хитона, полученный щелочным дезацетилированием панциря краба в течение 40 мин. 200 мг хитоэана растворяют в 100 мл 0,1 M уксусной кислоты, отбирают 1 мл раствора и добавляют к нему 15 мл воды. Получают 0,025%-ный раствор хитозана, Затем проводят ферментную реакцию по прописи, описанной при градуировке метода. Получают значение относительной активности фермента V/Vl =- 2,3, Содержание аминогрупн рассчитывают по формуле:

7,2%

0,125

Пример 2. Анализируют образец хитозана, полученный щелочным дезацетилированием панциря криля в течение 6 ч.

Определение проводят аналогично примеру

1. V/V(= 2,8, А = 9,8%.

Пример 3. Анализируют образец, Na -соли N-фталилхитозана, полученного иэ крабового хитозана и по условиям синтеза, предположительно не содержащего свободных аминогрупп. 200 мг полимера растворяют в t00 мл 0,01 М фосфатного буфера, отбирают 1 мл раствора, добавляют к нему

3 мл воды и получают 0,05%-ный раствор, Далее проводят определение аналогично примеру 1. V/Vi = 1,0, А = 0%.

Для проверки отсутствия аминогрупп увеличивают испытуемую концентрацию полимера в 10 раз. Проводят повторное определение аналогично примеру 1. V/V = 1,0, A =0%.

Пример 4. Анализируют образец

Ма -соли частично эамещенного N-фталилхитоэана, в котором по условиям синтеза половина аминогрупп.п редположительно . не замещена. Определение проводят аналогично примеру 3, вводя в измерительную ячейку, 0,025%-ный раствор полимера. V/Vi

= 2,2, А = 3,3 % .

Пример 5. Анализируют образец

Na -соли N-фталилхитозана на остаточные аминогруппы. Растворяют 750 мг полимера в 100 мл 0,01 М фосфатного буфера, отбирают 1 мл раствора и добавляют к нему 9 мл воды, Получают 0,075%-ный раствор, который анализируют в условиях примера 1.

Ч/Ч; =1,0. A -=0%.

Для установления наличия аминогрупп испытывают исходный раствор полимера с концентрацией 0,75%. Определение проводят аналогично примеру 1. Ч/Ю - 1,5, А =

=5 102%

Пример 6. Перед определением аминагрупп проводят градуировку по стан1754780 дартному образцу хитоэана, использованному в примере 1, Готовят растворы стандартного хитоэана так же, как в примере 1.

По 1 мл каждого раствора добавляют в реакционную смесь, составленную из 1 мл промышленного препарата бутирилхолинэстеразы сыворотки крови лошади с активностью 1 Е, 1 мл реактива Эллмана (готовят растворением 80 мг 5,5-дитиобис-2-нитробензойной кислоты в 100 мл 0,1 М фос ат ного буфера, рН 7 5) и 2 мл 2,5 10" M бутирилтиохинолина. В контрольную пробу . вместо хитозана добавляют 1 мл воды, Активность фермента определяют по методу

Эллмана по количеству тиохинолина с помощью фотоэлектроколориметра и ри длийе волны 412 нм. После этого аналогично примеру 1 строят. градуировочйую прямую, ко которой находят значение К =0,66, и получают расчетную формулу

A=066 ×I×-1

Анализируют хитоэан, полученный щелочным дезацетилированием панциря кри ля в течение 4 ч 200 мг полимера растворяют в 100 мл 0,1 М уксусной кислоты, отбирают

1 мл раствора и добавляют к нему 19 мл воды. Получают 0,01%-ный раствор хитозана. Проводят определение активности по методу Эллмана, расчет ведут по формуле (2). V/Vl 2,4, А = 9,2%, Пример 7. В условиях примера 1 анализируют образец 0-метилхитоэана (со степенью метилирования 0,5). Исходная концентрация раствора полимера 0,0125%.

Получают значения V/Vi = 2,5, А = 8,3%.

Пример 8. В условиях примера 1 анализируют образец 0-карбоксиметилхиV / Ê„ тоэана (со степенью карбоксиметилирования 0,8), Исходная концентрация полимера

0,0125%, Ч/Чi = 2,2 и А = 6,6%.

П р и M е р 9. В условиях примера 6

5 анализируют образец частично N-сукцинилированного хитозана. Исходная концентрация полимера 0,0125%. Ч/Ч = 2,1, А = 9%

Реализация предлагаемого способа по10 зволяет упростить и ускорить процедуру анализа (до 3 — t2 мин). При этом сохраняется низкий предел обнаружения аминогрупп

10 мг, что соответствует их содержанию

5"10 %

15 Формула изобретения

Способ получения аминогрупп в хитозане и его водорастворимыХ производных, включающий приготовление водного рас-. твора исследуемого полимера с последую20 щим анализом аминогрупп, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью упрощения способа при сохранении низкого предела обнаружения аминогрупп, к раствору добавляют буфер, фермент — холинэстеразу и

25 его субстрат и регистрируют активность фермента по сравнению с контрольной пробой, не содержащей полимера, а содержание аминогрупп рассчитывают по формуле

30 Vlvi — 1

r m где А — содержание аминогрупп, мас.%;

V — активность фермента в отсутствии

35 полимера, Е/мг;

Vi — активность фермента в присутствии полимера, Е/мг;

К вЂ” коэффициент пропорциональности и

m — масса полимера в реакционной смеси, 40 мг.