Способ определения активности глутатионтрансферазы
Использование: биохимия, исследование метаболизма пестицидов и лекарственчых веществ, уровня загрязненности водной среды ксенобиотиками. Сущность изобретения: прямое фотометрическое определение продукта ферментативной реакции глутатиона или инициатора реакции - натриевой соли 7-гидрокси-З Н-феноксазин- 3-0Н- 10-оксида (резазурин-Na). Реакционная смесь содержит фосфатный буфер, глутатион и ферментный препарат. Реакция инициируется добавкой резазурина-Na. Сразу измеряют увеличение поглощения продукта реакции при длине волны 573 нм или уменьшение поглощения инициатора реакции при 598 нм. Предел чувствительности метода 4,7 М. Метод позволяет вести кинетические наблюдения за ходом реакции. 1 ил.
СОВХОЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ ПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4857981/13 (22) 08,08.90 (46) 07,09,92. Бюл. N 33 (71) Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова АН СССР (72) А,А. Суворов, А.В. Стуловский, А,Ю. Виляцер, И.В. Возный, Е,В, Розенгарт и А.Е. Хованских (5б) 1.НаЫц W.Н., Pabst M,S., Jal Изобретение относится к биохимии, точнее к способам определения активности ферментов, в частности к определению активности глутатионтрансферазы (КФ 2.5.1.18), которое используется для исследования метаболизма пестицидов и лекарственных веществ, уровня загрязненности водной среды ксенобиотиками. Известен способ титрометрического определения активности глутатионтрансферазы в реакции восстановленного глутатиона с алкилгалогенидами. Способ состоит в титровании 5 мМ NaOH образующейся в результате реакции галогеноводородной кислоты. K недостаткам метода следует отнести то, что он требует непрерывного поддержания рН 7,2 без применения буферного раствора, что снижает точность и „„>Ц„„1759874 А1 водной среды ксенобиотиками. Сущность изобретения: прямое фотометрическое определение продукта ферментативной реакции глутатиона или инициатора реакции— натриевой соли 7-гидрокси-3 Н-феноксазин3-ОН-10-оксида (резазурин-Иа). Реакционная смесь содержит фосфатный буфер, глутатион и ферментный препарат. Реакция инициируется добавкой резазурина-Na. Сразу измеряют увеличение поглощения продукта реакции при длине волны 573 нм или уменьшение поглощения инициатора реакции при 598 нм, Предел чувствительности метода 4,7 10 M. Метод позволяет вести кинетические наблюдения за ходом реакции. 1 ил. воспроизводимость метода. Кроме того, метод требует значительного расхода времени с (около 1 ч). Известны колориметрические методы определения активности глутатионтрансфе- О разы, которые можно подразделить на определение содержания нитрит-ионов, 4 появляющихся в реакционной смеси в ре- .фЬ зультате реакции; определение цианидионов; определение п-нитрофенола, Активность глутатионтрансферазы определяется в реакциях глутатиона с нитроалканами (нитропропан, тринитроглицерин и т.д.). Способ состоит в инкубации фермента с реакционной смесью, содержащей восстановленный глутатион, буферный раствор и субстрат с последующим отбором аликвот, добавлением сульфаниламидного реагента, затем дигидрохлорида К-(1-нафтил)зтилен1759874 3 диамина и, после 20 мин инкубации, измерении на фатоэлектроколориметре (ФЭК) с фильтром на 540 нм. Недостатком метода является то, что он не позволяет вести кинетические наблюдения за ходом реакции, требует. отдельного . процесса проявления, длителен (около 1 ч). Активность глутатионтрансферазы из-. меряется в реакциях:глутатиона с органическими тиацианатами; Способ состоит в проведении ферментативной реакции в смеси, содержащей фосфатный буфер, глутатион, органический тиоцианат и фермент, последующей остановке реакции добавлением N-этилмалеимида, затем хлорамина Т и новой инкубации смеси. Затем добавляют пиразолоновый реагент и измеряют оптическое поглощение при 618 нм после 20 мин инкубации. К недостаткам метода следует отнести невозможность кинетических наблюдений за ходом реакции. снижение точности определения из-за летучести образующегося цианида, существенное исключение результатов определения трудйаустранимыми примесями неорганических тиоцианатов, а также его длительность (окола 50 мин). Активность глутатионтрансферазы определяют в реакции тиализа и-нитрофенилацетата глутатионом. Способ состоит в прямом колориметрическом определении образующегося в результате реакции и-нитрофенола. Реакционная смесь содержит буферный раствор, восстановленный глутатион и п-нитрофенилацетат. Недостатками метода являются подверженность субстрата неспецифическому каталитическому разложению при высоких концентрациях белка в пробе, повыщенные. требования к чистоте реагентов, в том числе буферных солей. Коэффициент экстинкции п-нитрафвнола 8790 M см при длине волны 400 нм. Граница чувствительности около 0,1 мкмоль; Наиболее широко применяемым (базовым) и близким па чувствительности и быстроте определения к предлагаемому способу является способ спектрофотометрическага определения активности глутатиантрансферазы в-реакции восстановленного глутатиона с 2,4-динитрохларбензолам:(1) па схеме: О мя сжзн О И. $с+нс1 гт Ю, но, Способ состоит а прямом спектрафотометрическом определении концентрации продукта реакции S-(2,4-динитрофенил)-глутатиана. 8 определении используются следующие реагенты: 0,5 M фосфатный буфер, рН 6,5; 10 мМ раствор восстановленного глутатиона в дистиллированной воде; 50 MM 5 раствор 2,4-динитрохларбензола в этаноле. На 3 мл спектрофотометрическую кювету необходимо 0,6 мл буфера, 0,3 мл раствора глутатиона, 0,06 мл раствора 2,4-динитрахларбензола в, этанале и раз10 бавленный ферментный препарат. Таким образом, конечные концентрации реагентов в пробе составляют 0,1 M фасфатный буфер, 1 MM глутатион, 1 мМ 2,4-динитрахлорбензал. Измерение оптической плотно- 15 сти ведут при длине волны 340 нм в течение 1 — 3 мин после инициации реакции добавкой 2,4-динитрохлорбенэала, К недостаткам этого метода, являющегося прототипом изобретения, следует ат20 нести то, что для измерений используется кварцевая оптика. так как исследуемая паласа оптического поглощения находится на границе области поглощения обычного стекла: измерения могут вестись только на 25 одной длине волны (на одном пике поглощения), что не позволяет контролировать устойчивость продукта реакции при работе с полиферментными системами или с неочищенными экстрактами тканей. Кроме того, в 30 качестве растворителя для субстрата используется этанал, в связи с чем он.всегда присутСтвует вреакционной смеси,,Малярный коэффициент экстинкции продукта реакции 9600 M см . Граница 35 чувствительности 0,02 мкмоль. Целью изобретения является создание выс0кочувствительного и быстрого способа опрвделения активности глутатиантрансферазы, не требующего сложной оптической 40 аппаратуры и большого количества участвующих в определении реактивов. Поставленная цель достигается тем, чта в способе определения активности глутатионтрансферазы, заключающемся в прямом 45 фотометрическом определении продукта ферментативнай реакции глутатиона и второго субстрата, в качестве второго субстрата используется согласно изобретению натриевая соль 7-гидрокси-3Н-феноксаэин- . 50 3-0Н-10-оксида(резазурина), далее именуемая резазурин-Na. Резазурин-Na в присутствии восстановленного глутатиана подвергается N-деаксигенированию, катализируемому глутатионтрансферазай Й „gX + wмаа о о - ЛООС .3. + сэзах.н,o о о 1759874 Способ состоит в приготовлении реакционной смеси, содержащей 0,1 М фосфатный буфер, 1 мМ глутатион и ферментныйпрепарат. Реакция инициируется добавкой 10 M раствора резазурин-Na, Сразу вслед 5 за этим измеряется увеличение поглощения при длине волны 573 нм или уменьшение оптического поглощения при длине волны 598 нм. В данной области длин волн возможно применение стеклянной оптики и на- 10 иболее простого фотометрического прибора — фотоэлектроколориметра (ФЭ К). Способ позволяет вести кинетические наблюдения за ходом реакции. Используемые реагенты: фосфатный бу- 15 фер, 0,5 М, рН 7,5; 10 мМ раствор восстановленного глутатиона в дистиллированной воде; 10 М раствор резазурин-Na в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,5; ферментный препарат. 20 Преимущества предлагаемого способа заключаются в большей чувствительности, чем у прототипа, из-за более высокого молярного коэффициента экстинкции продукта реакции (en = 30000) и самого субстрата 25 (Юы = 57150) по данным наших измерений, против 9600 у прототипа. Обнаруживается изменение концентрации на 10 М субстрата (резазурин-Na) и на 5 10 М продукта; возможности использования стеклянной 30 оптики; возможности измерения на двух длинах волн (двух пиках поглощения), что позволяет ввести в эксперимент контроль устойчивости продукта реакции при работе с полиферментными системами или с неочи- 35 щенными экстрактами тканей, что расширяет границы его применения; возможности использования воды в качестве растворителя второго субстрата глутатионтрансферазы. 40 Отличительной особенностью данного изобретения является использование резазурин-Na в качестве субстрата для определения активности глутатионтрансферазы фотометрическим методом. Измерения про- 45 водят при длине волны 573 нм или 598 нм с использованием стеклянной оптики. Измерения возможны в интервале рН от 6,0 до 9,0, но предпочтительной областью является 7,5. 50 Ф Способ применения предлагаемого изобретения заключается в следующем. Субстрат вносится в реакционную смесь, содержащую буферный раствор, восстанов ленный глутатион и ферментный препарат, сразу после чего проводят измерения оптического поглощения при длине волны 573 нм или 598 нм в течение 3 мин с интервалом 30 с, Полученные данные используют для расчета активности глутатионтрансферазы. Резэзурин-Ма производится в СССР в промышленных масштабах, дешев и легко доступен. Реакция ферментативного N-деоксигенирования, катализируемая глутатионтрансферазой, в литературе не описана, поэтому предлагаемый способ является принципиально новым. На чертеже показано изменение спектра поглощения реакционной смеси в ходе реакции, дает наглядное представление о возможности измерения скорости реакции как при длине волны 573 нм, так и при длине волны 598 нм, Пример 1. Иллюстрирует методику измерения активности глутатионтрансферазы в оптимальных условиях. Готовят растворы следующих реагентов; К/Na фосфатный буфер, 0,5 М, рН 7.5; 10 MM водный раствор восстановленного глутатиона; 0,035 мМ раствор резазурин-Na в 0,01 M K/Na фосфатном буфере, рН 7,5: цитозольнэя фракция печени крысы, 1:9, диализированная против 0,01 М К/Na фосфатного буфера, рН 6,7 (ферментный препарат). Составляют пробу общим обьемом 3 мл, содержащую 1,3 мл дистиллированной воды, 0,6 мл буфера, 0.3 мл раствора глутатиона, 0,5 мл ферментного препарата. В пробу вносят 0,3 мл раствора резазурин-Na, смесь перемешивают, после чего немедленно измеряют оптическое поглощение при 573 нм (увеличение поглощения) или 598 нм (уменьшение поглощения). Показания ФЭ К снимают в течение 3 мин с интервалом 30 с, Составляют контрольную пробу, содержащую 1,8 мл дистиллированной воды, 0,6 мл буфера, 0,3 мл раствора глутатиона. В пробу вносят 0,3 мл раствора резазурин-Na и проводят те же измерения, что и с опытной пробой. Разницу в показаниях между опытной и контрольной пробами (в пересчете на 1 мин) для измерений при длине волны 573 нм используют для вычисления ферментативной активности по формуле Л Е573 Чпр 1000, (мкмоль.мин Mà ) E57a mp где ЬЕь7з — разница в поглощении при 573 нм между опытом и контролем; Чпр — объем пробы, мл; е573 молярный коэффициент экстинкции продукта реакции на волне 573 нм; mp — количество белка в пробе, мг. В результате измерений были получены следующие данные: 1759874 1,5 0,067 0,039 0,088 0,052 0,001 0,000 0,5 0,024 0,017 0,046 0,027 время. мин F573, OnblT Е573, КОНТ Оль 0,121 — 0,075 — 0 015; В пересчете на 1 мин получают А — 0 015 3 1000 — 5 10 Активность фермента печени крысы Вистар в опытах составила 0,50 нмоль.мин,ìã 1, Такой же результат можно получить, проводя измерения при длине волны 598 нм по уменьшению концентрации субстрата. В этом случае вычисление активности фермента проводят по формуле — Л Е598 Члр 1000 А — Р,(мкмоль мин мг ), Я598 Alp где hE598 — разница в поглощении при 598 нм между опытом и контролем; а98 — молярный коэффициент экстинкции резазурин-Na при 598 нм; Vnp — объем пробы, мл; mp — количество белка в йробе, мг. Пример 2. Показывает влияние рН среды на результаты измерения оптической плотности. Готовят растворы резаэурин-Na в концентрации 3,5.10 M в 0,1 M буферных растворах с различными значениями рН. Измеряют оптическую плотность растворов при длине волны 598 нм. рН 3.4 4,5 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 9,0 Е598 0.03 0,08 0,15 0,18 0,18 0,18 0,18 0,19 Видно, что при значениях рН 6,0 и выше оптическое поглощение резазурин-Na остается постоянным. Практические измерения скорости реакции возможны при рН выше 5 5, однако оптимальное значение рН 7,5, так как, с одной стороны, при этом наблюдается минимальная скорость спонтанной реакции глутатиона с резаэурин-Na, с другой — наиболее высокая скорость ферментативной реакции, Вычисленное значение молярного коэффициента экстинкции резаэурин-Na составляет 57150. Пример 3, Определение нижнего предела чувствительнссти предлагаемого способа определения активности глутатионтрансферазы. Нижний предел чувствительности определен по методу трех о; Готовят пробу Общим объемом 3 мл, содержащую 1,6 мл дистиллированной воды, 0,6 мл 0,5 M К/Na фосфатногг, буфера, рН 10 7,5, 0,5 мл ферментного препарата и 0,3 мл 3,5 10 M раствора резазурин-Na, Готовят пробу, содержащую те же компоненты, за исключением реэазурин-NB, против которой ведут измеренИя Оптической плотности при длине волны 598 нм, Полученные значения. 0,185, 0,183, 0,185, 0,185, 0,184. Затем по формуле определяют величину трех дисперсий в единицах оптического поглощения. Поделив это значение 3 o= 2,68 10 на величину мо-3 лярного коэффициента экстинкции (57150), получают нижний предел чувствительности метода 4,7 10 8 М, Формула изобретения Способ определения активности глутатионтрансфераэы, предусматривающий приготовление реакционной смеси, содержащей фосфатный буфер, восстановленный глутатион и исследуемый ферментный препарат, добавление к полученной смеси инициатора реакции и измерение оптического поглощения фотометрическим методом с последующей оценкой активности, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения 40 чувствительности способа, в качестве инициатора реакции используют натриевую соль 7-гидрокси-ЗН-феноксазин-З-OH-10оксида, измерение проводят на фотоэлектроколориметре, при этом измеряют 45 интенсивность поглощения продукта реакции при длине волны 573 нм или инициатора реакции при 598 нм, а оценку активности ведут по увеличению интенсивности поглощения продукта реакции или по уменьшению интенсивности поглощения инициатора реакции в сравнении с контролем. 1759874 0,3 ° ° 0,2 0.3 550 575 5 500 g gmcqema (нерву 45с после звпусл peuguu! церер,опии юрп è уереа 9тш ., ррр,у gnua Составитель А.Стуловский Техред М.Моргентал Корректор И.Шмакова Редактор Л.Волкова Производственно-издательский комбинат "Патент". r. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Заказ 3155 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5
