Способ осаждения ванкомицина (основания)
Использование; способы получения антибиотиков , в частности ванкомицина. Сущность изобретения: осуществляют взаимодействие раствора ванкомицина с раствором гидроокиси натрия при добавлении одного из них к другому при перемешивании в течение 10 с - 2,5 мин и до достижения рН в смеси 7,8-8,24, после чего перемешивание прекращают и смесь отстаивают , Процесс ведут при 10-30° С. В результате получают легко фильтруемый осадок ванкомкцина (основания). 1 з.п. флы, 4 табл.
C0l03 СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ (21) 4613142/13 (22) 22.12.88 (31) 138735 (32) 28.12.87 (33) US (46) 07.09.92, Ьюл. Мв 33 (71) Эли Лилли Энд Компани {US) (72) Гарольд Рэймонд Кэтт и Гарольд Бернард Хэйс (US) (56) Патент США М 3067099, кл. 424-115, 1962. (54) СПОСОБ ОСАЖДЕНИЯ ВАНКОМИЦИ, НА (ОСНОВАНИЯ) Изобретение относится к области производства антибиотиков, в частности, к способу осаждения ванкомицина.
Вследствие проявляемого к ванкомицину интереса и его важности ведется непрерывный поиск более эффективных способов выделения антибиотика из его ферментационных смесей.
Ванкомицин представляет собой продукт ферментации. Обычно ферментационный бульон фильтруют, фильтрат подкисляют и пропускают через один или несколько слоев хроматографической смолы с целью вызвать отделение фракций с . антибиотической активностью. Добавление. при перемешивании основания рН элюата, содержащего очищенный антибиотик, устанавливают в пределах 8-8,2. Осаждение ванкомицина (основания), как поавило, начинается при рН 7.2-7,5, т.е. еще до достижения необходимого значения рН. Взвесь
» . Ы 1760970 АЗ
Трудности, возникающие при фильтровании взвесей ванкомицина (основания) () представляют пробивку при промышлен-: ном получении ванкомицина, существую- щую уже около двадцати лет. Целью изобретения является улучшение качества осадка. Было обнаружено, что если осаждение ванкомицина (E.снования) задержать до Момента установления рН раствора по меньшей пере 7,8 и завершать осаждение без перемешивания, в этом случае происходит непрерывное образование продукта в виде хорошо сформированных больших пласти1760970 50 нок. Такие пластинки могут быть легко отфильтрованы на воронке Бюхнера с по. мощью центрифуги или фильтрпресса. Кроме того, при этом увеличиваются выхода продукта и улучшенная фильтруемость продукта позволяет обрабатывать растворы с более высокой концентрацией ванкомицина, что также увеличивает выход ванкомицины на загрузку и улучшает эффективность и ро цесса. Описываемый способ настоящего изобретения заключается в быстром соединении водного раствора ванкомицина с водным раствором основания с получением раствора со значением рН перед осаждением по меньшей мере 7,8 и последующим продолжением осаждения без перемещения. Выражение "значение рН по меньшей мере 7,8" означает минимальное значение рН, при котором использование статической технологии осаждения приводит к хорошо сформированным, легко фильтруемым пластинкам ванкомицина (основания). При высоких концентрациях ванкомицина оказывается возможным получать такой осадок при таких низких значениях рН как 7,5, если при этом раствор не перемешивать. Однако, в этих условиях осаждение не бывает полным и выхода снижаются. Увеличение рН до 9 влияет на стабильность ванкомицина, при этом снижаются выхода и образуются обесцве ченные продукты. Наилучшие результаты достигаются при начале осаждения в интервале значений рН 7,8 — 8,24. Рекомендуется, устанавливать рН 7,8 — 8,24 и прекращать перемешивание до начала осаждения. В одном из вариантов изобретения значение рН элюированного концентрата ванкомицина устанавливают в пределах 6,5 — 7 добавлением основания, т.е. соединения, образующего в водном растворе ионы гидроксила, такого как гидроксид натрия, гидроксид калия и т.п. Отбирают аликвотное количество, которое титруют с целью определения количества основания, которое необходимо добавить до повышения рН по меньшей мере до 7,8; Вычисленное количество основания быстро и при перемешивании добавляют с элюираванному концентрату да рН по меньшей мере 7,8 до начала осаждения. Перемешивание прекращают сразу же после добавления основания и раствор оставляют отстаиваться. Рекомендуют основание добавлять с такой скоростью, чтобы при этом устанавливать рН 8-8,24, и перемешивание прекращалась. В результате получают большие хорошо сформированные и легко фильтруемые пластинки продукта. В другом варианте изобретения р Н элюированнога концентрата устанавливают в 45 пределах 6,5-7, Раствор быстро при перемешивэнии добавляют к раствору основания соответствующей концентрации с получением конечного значения рН по: меньшей мере 7,8. Раствор основания может быть буферным, Перемешивание прекращают сразу же после прибавления элюированнага концентрата. И в этом случае вновь рекомендуется, чтобы элюат добавлялся в полном объеме и чтобы конечное значение рН было в интервале 8 — 8,24. И в этом случае получают большие, хорошо сформированные и легко фильтруемые пластинки продукта. На скорость осаждения влияет температура раствора. Рекомендуется, чтобы темпе-. ратура раствора была 10 — 30 С, При температуре раствора выше 30 С осаждение часто начинается прежде, чем рН достигнет значения 7,8, и полученнйй в результате ванкомицин (основание) трудно поддается фильтрованию. Напротив, при температуре ниже 10 С осаждение происходит медленно и через два часа завершается менее чем наполовину. Таким образом, кристаллизацию рекомендуется проводить при температуре 10-30.а С, наиболее пред- почтительное при 20 — 25 С, с получением, легко фильтруемого осадка в. течение приемлемого с промышленной точки зрения времени. На скорость осаждения также влияет концентрация ванкомицина.в элюате. Рекомендуется, чтобы элюированный концентрат содержал 75-200 мг/мл ванкомицина, наиболее предпочтительно 85-160 мг/мл. В целом, чем выше концентрация, тем быстрее идет осаждение и тем оно более полное. При более высоких концентрациях может возникнуть необходимость в регулировании рН при 20 С или ниже с целью избежать преждевременнога осаждения ванкомицина (основания). Затем температура может быть повышена до 25 C с целью завершения осаждения. Осаждение ванкомицина (основания) из растворов с концентрацией менее 75 мг/мл происходит более медленно и приводит к продукту, фильтрующемуся более медленно по сравнению с более концентрираванными растворами Пример l. Аликвоты элюираванного концентрата-.: по 440 мл, содержащие 75 мг/мл ванкоми- цина, доводят до рН Y добавлением при перемешивании 3 н раствора гидроксида натрия. Затем рН повышают от 7до 8,24 добавлением в течение 75 секунд Зг раствора гидроксида натрия. Перемешивание прекращают сразу после добавления гидроксидэ натрия. Через 1,5 минуты начинает осаждаться 1760970 ванкомицин (основание), Температуру раствора поддерживают при 25ОС. Степень кристаллизации контролируют с помощью ультрафиолетового анализа. Примерно через 6 часов взвесь фильтруют на воронке Бюхнера диаметром 1,25 дюлма (3,2 см), снабженной стеклянной колонкой, под давлением 0,984 ат. Фильтровальный пирог промывают 105 мл 50 $-го водного метанола и затем 105 мл метанола, Время фильтроьания — 7,5 мин, первое промывание занимает 11 мин, второе промывание — 9 мин. Выход ванкомицина (основание) 90 g. П риме р2 — 5. Воспроизведена методлка примера I c использованием элюируемого концентрата, содержащего 90, 120 и 160 мг/мл ванкомицина. Осаждение из раствора с 160 мг/мл ванкомицина проведено дважды. В ходе первого опыта при регулируемой температуре 25 С осаждение начинается гри рН 7,9, Перемешивание прекращают после добавления всего аликвотного количества гидроксида натрия (pH 8,24). В втором опыте температура элюата — 10 С, температура раствора гидроксида натрия — 15 С, температура кристаллизации в результате достигает 210 С. Перемешивание прекращают сразу же после добавления раствооа гидроксида натрия, рН 8,23. Осажденле начинается спустя 35 — 40 секунд, Полученные в примерах 1 — 5 результаты суммированы в таблице 1. Примеры 6-9. Воспроизведена методика примера 1 с использованием элюированного концентрата, содержащего 83,7 мг/мл ванкомицина, и изменением температуры. Полученные результаты суммированы в таблице 2. В примере 9 при 30 С осаждение началось прежде, чем весь раствор гидроксида натрия был добавлен. Пример10. К аликвотному количеству на 200 мл элюированного концентрата, содержащего 74 мг/мл ванкомицина, добавляют мочевину (14,8 г). Добавлением 33 мл 3 н раствора гидроксида натрия устанавливают рН 6,5. Полученный раствор в течение 10-15 секунд при перемешивании прибавляют к 30 мл 3 н раствора гидроксида натрия, содержащего 2,5 г ацетата натрия, и перемешивание сразу же прекращают. Полученный раствор имеет рН 8, Температуру раствора поддерживают при 25 С. Осаждение ванкомицина начинается соазу же, Через 30 Мин взвесь фильтруют на воронке Бюхнера диаметром 9 см. Фильтровальный пирог промывают 100 мл 50 +-ro водного метанола с последующим повторным. промыванием 100 мл ме5 30 55 танола. Время фильтрования — 1,9 мин, первое промывание занимает 2,6 мин, второе промывание — 2,6 мин. Выход 95"-,ь. Примеры11 — 14. Воспроизведена методика прлмера 10 при использовании различных количеств мочевины и ацетата натрия, В некоторых случаях для второго промывания используют метанол, а для третьего промывания— ацетон, Для сравнения 200 мл взвеси кристаллов, полученной по известной методике из элюата, содержащего 73 мг/мл ванкомицина, фильтруют на воронке Бюхнера диаметром 9 см. Результаты примеров 10 — 14 суммированы ". таблице 3. П риме р15, Добавлением гидроксида натрия (19ОС) в 750 л элюированного концентрата (15 С), содержащего 85 мг/мл ванкомицина, устанавливают рН 7. Аликвотное коли .ествотитруют до рН 8,2 и рассчитывают количество 3 н раствора гидре ксида натрия, необходи5 мое для установления в элюате значения оН 8.2, Рассчитанное количество (56 л) из находящегося под давлением сосуда в течение 2,5 мин вь.дувают в резервуар и перемешивание прекращаю .. Оса><дение начинается прежде, чем все количество гидроксида натрия оказывается добавленным. Температуру раствора стабилизируют при 25 С. Через 4;5 часа взвесь фильтруют с помощью фильтр-пресса. Фильтровальный пирог про5 мывают водой до понижения проводимости ниже 3000 мкм ом (примерно 1300 л), после чего повторно промывают ацетоном (950 л). Время флльтрования — 10 мин, первое промывание занимает 15 мин, второе flpGMblBG ния — 7 мин, выход 92 4. Примеры16,17. Воспроизведена методика примера 15, за исключением того, что гидрсксид натрия прибавляют за 1,5 мин и осаждение начинается через 15 секунд после завершения и рибавления. Результаты примеров 15 и 16 сравнивают со средчим временем фильтрования для трех опытом, проведен lbl_#_ по известной методике с использованием элюата, содержащего 75:15 мг!мл ванкомицина. Результаты примеров 15-17 суммированы в таблице 4. Формула изобретения 1. Способ осаждения ванкомицина (основания), предусматривающий взаимодействие раствора, содер>кащего ванкомицин, с раствором гидроокиси натрия, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью улучшения качества осадка за счет повышения его способно1760970 Таблица 1 Результаты осаждения ванкомицина Таблица 2 Результаты осаждения ванкомицина сти к фильтрованию, используют раствор ванкомицина с концентрацией 60 — 100 мгlмл и взаимодействие реагентов осуществляют при добавлении одного из них к другому при перемешивании в течение вре* Осаждение начинается при рН 7,9. мени от 10 с до 2,5 мин и до достижения рН в смеси 7,8 — 8,24, после чего перемешивание прекращают и смесь отстаивают. 2. Способ по и. 1, отличающийся тем, 5 что процесс осуществляют при 10-30 С. 1760970 Таблица 3 Результаты фильтрования ссаженного ванкомицина Таблица 4 Результаты фильтрования осаженного ванкомицина Составитель О. Скородумова Техред M.Ìîðãåíòàë Kopp|.:KTop А. Ворович Редактор Г, Князева Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Заказ 3194 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5
