Способ получения аденозин-5 @ -трифосфата, меченного изотопами фосфора в @ -положении

 

Использование: в качестве радиоактивной метки в биохимических и молекулярно-бнологических исследованиях. Сущность изобретения: продукт зденозин-5 -( у-32/33Р)-трифосфат, выход 90%- 95%. Реагент 1: хлоропласты растений (гороха), реагент 2: Фетэзннметасульфат или 1-метокси-5-метилфеназинмегасульфат, или пиоцианмн.Условия реакции: при облучении УФ в присутствии Н 32/33 Р04. О 1-

COIO3 СОВЕ Н:КИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСП БЛ li< (я)я С 07 F 9/09 (: (. О р

СР (ГОСУДАРСТВЕ ННЫЙ KOMNTET

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР г ABTOPCKOIVIY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4893109/04 (22) 21,12.90 (46) 15.10,92. Бюл. ¹ 38 (71) Хозрасчетное опытное предприятие

"Радиопрепaðaò" I/lícòèòyta ядерной физи«и АН УЗССР. Институт почвоведения и фотосинтеза Al-I СССР (72) С,Д.Зэхаоов, T.Ï.Påpüêo. В.А.Рихтер и

А.Н.Абдусал ямов (56) Wehrly Л/.Е,. Verheyden 0, .М., Moffatt

J.G. Dismutation reactions o nucleoside

polyphosphate3, II. Specific chåmical

synthesis of r;.,/3 — and 1 3 Р-nucleoside5 -triphosphaies. //.1. Am, Chem, Soc.— 1965, v. 87, No. 10.— P. 2265 — 2277.

Туманов IO.H.. Гриш-:åâ М,П.. Рукавишников M.IO., Аммосов А.Д„Портянко А.П.

Химический синтез (", - Р) АТР, Тезисы

3 докл, II Bcecoio3xoro совещания по проблеме. <Эизиологически активные соединения, меченые радиоактивными и стабильными изотопами, М., 1988, с. 63.

Clynn!.М„Chappell,J..В. А simple method

for the preparation of Р-labeled adenosine

32 с!phosphate of high specific activity. //

8iochem, J, 1964. V. 90, No. 1.— P. 147 — 149;

Schendei Р,F., Wells R.D. The synthesis

and рогification of / y- P/ adenosine, 32

triphosphate v ith high зр-cific activity.//J.

Biol. Chem, 1973, v, 248, No. 23.— P. 8319 — 8321.

Walseth Т.F., Johnson R.À. The enzymatic

preparation of / а-" P/ nucleoside

triyhosphates, cyclic / Р/ AMP, and cyclic

32

/ Р/ GMP.//Biochem. Biophys. Acta, 1979, V. 562, No. 1.— Р, 11 — 31.

Avron M. Photophosphorylation as à tool

fot synthesis of specifically labeled

nucleotides.//Anal. Biochem. 1961. \/, 2, No.

2.— Р,535 — 543.

SM2 1768606 А1 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДЕНОЗИН-5—

ТРИФОСФАТА. МЕЧЕН НОГО ИЗОТОПАМИ

ФОСФОРА B у -Г ОЛОЖЕНИИ (57) Использование: в качестве радиоактивной метки в биохимических и молекулярно-биологических исследованиях.

Сущность изобретения: продукт: аденозин-5 -(y- Р)-трифосфат, выход 90%—

95%. Реагент 1: хлоропласты растений (гороха), реагент 2: фетэзинметасульфат или 1-метокси-5-метилфеназинмегасульфат, или пиоцианин. Условия реакции: при облучении УФ ь присутствии Н3 P 04.

1768б06

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для получения аденозин-5 -(y- 1 1Р)-трифосфэтэ1(у " Р)АТР), который широко применяется в биохимических и молекулярно-биологи! QcKwx исследованиях.

Известны различные способы получения () - Р)АТР: хими:вские, ферл.ента32 33) тивные. Как правило, все современные методы дают высокие (более 90 Ä выходы целевого продукта. Однако,;рэкгически BQ всех случаях используются достэто но сложные реакционные смеси, зэтруд:щющие очистку продукта реакции.

Наиболее близким по техническому ре:ыению является способ получения (y — Р)АТР, описанный Авроном. Метод основан нэ использовании фотозависимого синтеза АГР 3 хлоропластах растений. Реакционная смесь содержит всего несколько компонентов, причем один из них хлороплэсты дос1аточно просто удаляется из реакционной смеси путем обычного центрифугирования. Дальнейшая очистка полученного. таким образом () - Р)АТР значительно упрощается. Однако, метод гозволяет получать продукт с выходом не более 75 „от исходного Р! и применим лишь для получе32 ния небольших порций радиоактивного продукта. Это обусловлено тем, что в качестве кофактора реакции использовали феррициэнид. Известно, что фотосинтетическая 3-;ектронтранспортная цепь (ЭТЦ), работа ко второй обеспечивает энергией синтез АТР, включает две фотореакции, так называемые фотосистемы 1 и 2.

Аппарат фотосистемы 2, основной функцией которого является фоторазложение воды, имеет лабильну о структуру. Вследствие этого полная ЭТЦ хлоропластов ле ко повреждается. При использовании феррицианида в качестве акцептора электронов донором электронов является йода, то есть работает полная ЭТЦ. Низкая эффективность работы ЗТЦ с этим кофактором не позволяе получить подукт с выходом более

75 даже при лаоораторном масштабе производства(порядка 1 мКи). При промышленном синтезе (у-32(33))АТР, использующем

100 мКи PI хлоропласты с феррициэнидом

32 практически не работают, Целью изобуетения является повышение выхода (y-3 @ Р)АТР, Цель достигается тем, что в способе получения(P- (P)ATP, с использованием хлоропластов растений за счет энергии света, в качестве кофактора реакции фосфорилирования применяют феназинметасульфэт или его производные, 5

10 l5

10 5

Работу фотоси темы 2 в Э ГЦ хлоропластов можно шунтировать, если использовать в ка!"..ñòâe кофактора фенэзинмегасульфат, выполняющий одновременно функци о донора 1 акцептора электронов фотосистемы 1, Аппарат фотосистемы 1 существенно более стабилен, чем аппарат фотосистел ы 2, Экспериментально обнаружено, что использование в качестве кофактора реакции фенà3иíMåòàсульфата позволило увеличить выход (} — Р)АТР до 90 и более от уров32(33 ня исходного Рл Очень важно. что такой

32 выход продукта можно получить при использовании 100 мКи Pi, т.е, в условиях про32 мышленного производства.

Пример 1, Использование в ка естве кофактора реакции феназинметасульфата.

Хлоропласты выделяют из листьев гороха по ранее описанному методу. В выделенные хлоропласты добавляют глицерин до

10 „заморэживэют и храня1 в жидком азоте, 100 мКи Рз" PO", в 100 мкл 0,04 M HCI упаривэют нэ рогационном испарителе для удаления соляной кислоты и рэстворя|от в

50 мкл дистиллированной воды. Реакцион-!

:;;; см-„-сь (общий обьем 100 мкл) содержала

40 ..М рицин-11аОН, рН 7,5, 5 мМ klgCI2, 10!! Л КС!, 50 мкМ феназинметасульфат, 5 мМ АДР, хлGðоплэсты (30 мкГ хлорофилла).

Реакционную смесь освещают лампой накаливания при освещенности 50000-100000

Л,окс в течение 10 мин. Выход ре-кции составляет 90 — 95 "/ от исходной Н3 РО1. Реакционную .смесь центрифугируот 5 мин при 8000 хд. ГIолученный таким образом

32 () Р)АТР выделяют с использованием выс;0Kоэффективн0й хроматографии нэ хроматогрэфе фирмы "IKH" (Швеция).

Пример 7. Использование в качестве кофактора реакции 1-л етакси-5-метилфеназинметасульфата. Процедуру получения и выделения целевого продукта .осуществляют., как описано в примере 1 за исключением того, что вместо феназинметасульфата используют 5-метилфеназинметэсульфат в концентрации 50 мкМ. Выход (у- Р)АТР составлял 90-95,, Пример 3, Использование в качестве кофактора реакции пиоцианин, Процедуру получения и выделения целевого продукта осуществляют, как описано в примере 1 за исключением того, что вместо феназинметасульфата используют пиоцианин B концентрации 50 мкУ., Выход (y- P)ATP составлял

90-95;4.

Пример 4, Получение (y-33P)ATP.

Гlроцедуру получения осу.цествляют как оплсано в примере 1, за исключением того, что вместо 100 мКи Нз РО брали 30 мКи

1768606

Составитель Л.Панфилова

Техред M.Моргентал Корректор И.Шмакова

Редактор

Заказ 3620 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, >К-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Нз РО<. Выход () — P)ATP составляет 90— зз зз

q5%

Использование описываемого способа обеспечивает по сравнению с известными ряд преимуществ: увеличение выхода (y — ()Р)АТР до

32(33)

90 Д и выше, обеспечение BblcoKQI выхода для получения больших порций радиоактивного продукта, т.е, возмо>кность использования в промышленных условиях, а также упрощение синтеза, сокращение времени синтеза до 2-10 мин при обеспечении при этом высокого выхода, Способ опробован для получения (7 - з Р)АТР в условиях промышленного производства при загрузках до 100 мКи радиоактивного сырья. Выход целевого соединения составляет более

90, .

По сравнению с ранее используемой ферментативной технологией получения

5 (y - Р)АТР, предложенный способ позволяет сократить время синтеза с 40 — 60 до 2 — 10 мин, Формула изобретения

10 Способ получения аденозин-5 -трифосфеI та,меченного изотопами фосфора ву-положении фосфорилированием аденоэин-5 -дифосфата хлоропластами хлоропластов растений за счет энергии света и кофактора реакции фосфори15 лирования, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, в качестве кофактора реакции фосфорилирования применяют феназинметасульфат или его производные.