Рекомбинантная плазмидная днк pjdb (msil), обеспечивающая синтез интерлейкина-2 человека в клетках дрожжей sасснаrомuсеs cereuisial, способ ее получения и штамм дрожжей sасснаrомyсеs cereuisial - продуцент интерлейкина-2 человека

 

Изобретение относится к биотехнологии . Целью изобретения является повышение выхода интерлейкина-2 в клетках дрожжей за счет конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pjDB(MSIL), разработки способа ее конструирования и создания штамма, трансформированного этой плазмидой. Плазмида содержит ген LEU 2 дрожжей и фрагмент дрожжевой двумикронной ДНК. обеспечивающие ее стабильное поддерживание в дрожжах в высоком числе копий; кодирующий участок гена человеческого интерлейкина-2, фланкированный промотором и терминатором транскрипции гена РН05 дрожжей, а также фрагменты бактериальной ДНК, обеспечивающие репликацию плазмиды в клетках E.coli и несущие ген устойчивости к ампициллину . Клетки дрожжей штамма GC-1- GRF18, трансформированные плазмидой pjDB(MSIL), продуцируют инYepлeйкин-2 в количестве порядка 30-50 мг на литр дрожжевой культуры, что соответствует 10 ед./мл. 3 с.п. ф-лы. (Л С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (si)s С 12 N 15/26, 1/19

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (Ql

1 О ,> (21) 4392922/13 (22) 24,03.89 (46) 23.10.92. Бюл. М 39 (71) Л ен и н градский госуда рстве н н ы и ун иверситет и Институт органического синтеза

АН ЛатвССР (72) А,Н.Мясников. M.Н.Смирнов, А.Я.Авот, Э.Я,Грен, Н,В,Романчикова и А.Ю,Циманис (56) ЕПВ, С 12 N 15/00, N 0142268, 1985. (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ

ДНК PJDB(MSIL), ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ

СИНТЕЗ ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 ЧЕЛОВЕКА В

КЛЕТКАХ ДРОЖЖЕЙ SACOHAROMYCES

CEREVISIAE, СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ И

ШТАММ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES

CEREVISIAE-ПРОДУЦЕНТ ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к биотехнологии. Целью изобретения является повышение выхода интерлейкина-2 в клетках дрожжей за счет конструирования рекомбиИзобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии. и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК, обеспечивающую высокий уровень продукции интерлейкина-2 человека в клетках дро>к>кей. способ конструирования данной плазмидной ДНК и штамм дрожжей Saccharomyces cere isiae-продуцент человеческого интерлеикина-2.

Целью изобретения является повышение выхода интерлейкина-2 в клетках дрожжей, Цель достигается созданием плазмиды

pjDB(MSIL), обеспечивающей синтез интерлейкина-2 в трансформированных ею клет„„. Ж„„1770359 Al нантной плазмидной ДНК pjDB(MSIL), разработки способа ее конструирования и создания штамма, трансформированного этой плазмидой. Плазмида содержит ген LEU 2 дрожжей и фрагмент дрожжевой двумикронной ДНК. обеспечивающие ее стабильное поддерживание в дрожжах в высоком числе копий; кодирующий участок гена человеческого интерлейкина-2, фланкированный промотором и терминатором транскрипции гена РН05 дрожжей, а также фрагменты бактериальной ДНК, обеспечивающие репликацию плазмиды в клетках

Е.coli и несущие ген устойчивости к ампициллину, Клетки дрожжей штамма GC-1GRF18, трансформированные плазмидой

pjDB(MSIL), продуцируют интерлейкин-2 в количестве порядка 30-50 мг на литр дрожжевой культуры, что соответствует 10 б ед./мл. 3 с.п. ф-лы.

1 ках дрожжей. Плазмида состоит из следующих элементов: — фрагмента плазмидной ДНК бифункционального бактериально-дрожжевого вектора pjDB207. ограниченного рестрикционными сайтами Hindlll и BamHI, размером 6,6 т.п.о. включающего бактериальный ген устойчивости к ампициллину, бактериальную область инициации репликации. фрагмент дрожжевой двумикронной плазмиды и дрожжевой ген LEU2; — BamHI — EcoRI фрагмента гена РН05 дрожжей, содержащего промотор этого гена. размером 0,52 т.п.о.;

1770359

55 — Е.coRI — Sall фрагмента плазмиды рАА

12.13-23, несущего часть гена интерлейкина-2 человека, включающего всю кодируюI щую и часть 3-некодирующей области этого гена, длиной 0,56 т.п,о.; — Smal — BamHi фрагмента полилинкерного участка плазмиды pUC19 длиной 8 п,о.; — Sau ЗА-Pstl фрагмента гена РН05 дрожжей, содержащего терминатор транскрипции этого гена, размером 0,37 т.п,о„ вЂ” Pst-Hindll l фрагмента полилинкера плазмиды pUC19 размером 20 п.о.

Общий размер плазмиды 8,0 т,п.о. (молекулярная масса 5,2 Мд).

Для достижения цели разработан способ конструирования плазмиды pjDB(MSIL), заключающийся в том, что плазмиду рАА

12.13 — 23 гидролизуют эндонуклеазой рестрикции Sall, затем обрабатывают ДНКполимеразой 1 (фрагментом Кленова= и рестриктазой EcoRI. Образующийся при такой обработке фрагмент ДНК, включающий всю кодирующую и часть 3-нетранслируемой области гена интерлейкина-2 человека, лигируют с вектором pMS46, предварительно гидролизованным рестриктазами EcoRI и Smal. Из полученной таким образом плазмиды pMSII с помощью гидролиза рестриктазами Sall u Hindlll выделяют фрагмент

ДНК, несущий промотор и терминатор транскрипции гена РН05 дрожжей с расположенным между ними геном интерлейкина-2. После очистки этот фрагмент лигируют с векторной частью плазмиды pjDB207, гидролизованной также рестриктазами Sall u

HIndllI, В результате получают плазмиду

pjDB(MSIL), обеспечивающую высокий уровень продукции интерлейкина-2 в клетках дрожжей.

Выбор плазмиды plViS46 обусловлен тем, что эта плазмида содержит промотор и терминатор транскрипции гена РН05 дрож, >кей, расположенные в одной ориентации, и имеет удобный для клонирования полилинкерный участок между промотором и терминатором транскрипции. Промотор гена РН05 в этой плазмиде модифицирован таким образом, что в нем полностью удалена кодирующая область гена РН05, и в участок, соответствующий лидерной области мРН К, встроен фрагмент полилинкера плазмиды pUC19.

Для достижения цели используют штамм дрожжей Saccharomyces, cerevisiae

GC-1-GRF18-pjDB(MSIL), полученныЙ трансформацией штамма GC-1-GRF18 плазмидой

pjDB(MSIL), Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Клетки бактерий

Escherichia coii, содержащие плазмиду

pMS46, выращивают.в течение ночи в 500 мл питательной среды LB (1 пептона, 0,5 /, дрожжевого экстракта, 1 / хлористого натрия), в которую добавлен ампициллин в концентрации 50 мг/л. Клетки собирают центрифугированием (5000 об/мин, 10 мин, 4 C), ресуспендируют в 10 мл буфера для лизиса (25 мл трисгидрохлоридный буфер рН 8,0, содержащий 10 MM ЭДТА и 50 мМ глюкозы), добавляют 20 мл мг лизоцима и инкубируют 10 мин при 4 С. Далее добавляют 10 мл 0,2 M гидроокиси натрия, содержащей 1 / додецилсульфата натрия. После осторожного перемешивания в течение примерно 1 мин раствор нейтрализуют 10 мл 3М ацетата натрия, рН 5,3. Далее препарат выдерживают при 4 С в течение 1 ч и центрифугируют при 20000 об/мин. К супернатанту добавляют 0,6 объема изопропилового спирта и отделяют осадок центрифугированием 5000 об/мин при 4 С.

Осадок высушивают в вакууме. растворяют в 3,5 мл воды, прибавляют 3,5 г хлористого цезия и 100 мкл раствора бромистого этидия (10 мг/мл) и центрифугируют при 50000 об/мин в течение 12-16 ч на центрифуге.

После центрифугирования отбирают полосу плазмидной ДН ((нижнюю из двух флюоресцирующих полос в центре пробирки). дважды экстрагируют бромистый этидий равным объемом изоамилового спирта, разбавляют раствор хлористого цезия водой в

2 раза и осаждают ДНК двумя объемами этилового спирта. Осадок, отделенный центрифугированием (10000 об/мин, 5 мин), промывают 70 этанолом, высушивают в вакууме и растворяют в воде (500 мкл), Концентрацию плазмидной ДНК определяют по оптической плотности раствора при 260 нм, чистоту препарата контролируют электрофорезом в агарозном геле (0,7 агарозы в буфере ТВŠ— 0,1М трис-борат, содержащиЙ

1 MM ЭДТА и 1 мг/л бромистого этидия).

Гидролиз плазмиды рМ S46 рестриктазой Smal проводят в 10 мМ трис-гидрохлоридном буфере, содер>кащем 10 мМ. хлористого натрия, 20 мМ хлористого калия, 1 мМ дитиотреитола. К 20 мкг ДНК в объеме

50 мкл прибавляют 30 ед. рестриктазы и проводят реакцию при 30 С в течение 2 ч.

Контроль за полнотой гидролиза ведут с помощью электрофореза в агарозном геле. Далее раствор ДНК разбавляют до 200 мкл 50 мМ трис-гидрохлоридным буфером, содержащим 10 MM хлористого магния, 100 мМ хлористого натрия, 1 мМ дитиотреитола, 10С мкг/мл бычьего сывороточного альбумина (буфер В С) и обрабатывают 50 м ед. рестрик1770359

30 ампициллина

40

55 тазы EcoRI в течение 2 ч при 37 С, Реакционную смесь вносят в лунку (2 х 50 мм) агарозного геля, приготовленного, как описано выше, и проводят электрофорез при напряжении 5 B/см в течение 2 — 3 ч. Непосредственно перед полосой линейной формы плазмиды вырезают лунку (3 х 60 мм), помещают в эту лунку диал изную мембрану соответствующего размера и заполняют ее буфером ТВЕ. Электрофорез продолжают в течениееще 10 — 15 мин, после чего буфер из лунки отбирают, экстрагируют один раз фенолом и один-два раза бутанолом, добавляют 1/10 часть ЗМ натрий-ацетатного буфера, рН 5,3, и три объема этанола. ДНК отделяют центрифугированием при 10000 об/мин в течение 10 мин, осадок промывают этанолом, высушивают в вакууме и растворяют в 100 мкл воды, Гидролиз 10 мкг плазмиды рАА 12.13—

23, выделение которой аналогично выделению плазмиды pMS46, проводят с помощью

30 ед. рестриктазы Sall в 50 мкл буфера ВС в течение 2 ч при 37 С. Далее к раствору

ДНК добавляют 80 мкл 100 мМ трис-гидрохлоридного буфера рН 7,4, содержащего 50 мМ хлористого магния и 10 ед. Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы 1, После инкубации втечение 4ч при комнатнойтемпературе ДНК-полимеразу инактивируют нагреванием при 65 С в течение 10 мин, после чего добавляют 100 мкл буфера ВС и проводят гидролиз плазмидной ДН К 30 ед. рестриктазы EcoRI в течение 2 ч при 37 С.

Очистку фрагмента размером 560 п.с. проводят, как описано выше для векторного фрагмента плазмиды pMS46, стем дополнением, что рядом с лункой д я >чищаемого препарата ДНК вырезают л (нку (5 х 3 мм) для нанесения стандартов мслекулярной массы (ДНК фага лямбда, гидро лизованная

Pstl). Нужную полосу перед элюцией идентифицируют, сравнивая ее подвижность с подвижностью стандартных фрагментов

ДН К.

Для получения плазмиды, обозначенной как pMSIL. фрагменты ДНК. содер>кащие промотор и терминатор гена РН05. лигируют с фрагментом ДНК, несущим ген интерлейкина-2. Для этого фрагменты ДНК из плазмид рАА 12.13-23 и pMS46, очистка которых описана выше, смешивают в количестве по 0,1 мкг в 10 мкл 70 MM трис-гидрохлоридного буфера, рН 7,6, содержащего

5 мМ дитиотреитола, 5 мМ хлористого магния, 1 мМ АТФ. Для проведения реакции лигирования добавляют 10 ед. ДНК-лигазы фаза Т4 и проводят инкубацию в течение ночи при 4 С.

Полученной таким образом лигазной смесью трансформируют клетки Е.coli

НВ101. Для этого клетки Е.coli выращивают в 100 мл среды LB при 37 С и интенсивном перемешивании до достижения оптической плотности при 600 нм 0,4 — 0,5. Культуру охлаждают на льду, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин при 0 С, ресуспендируют в 50 мл 0,1 М хлористого кальция, инкубируют на ледяной бане 40 мин, повторно центрифугируют при тех же условиях, суспендируют в 5 мл раствора хлористого кальция, добавляют глицерин до

20%, Полученные таким образом компетентные клетки расфасовывают аликвотами по

200 мкл и хранят замороженными при — 70 С до использования. Для трансформации компенентные клетки Е.coli размораживают в ледяной бане, добавляют к суспензии клеток смесь продуктов лигазной реакции и проводят инкубацию в ледяной бане в течение 40 мин. Далее клетки подвергают тепловому шоку в течение 2 мин при 42 С, после чего инкубируют в 1,5 мл среды LB при 37 С в течение 1 ч. Суспензию клеток концентрируют центрифугированием при 30000 об/мин в течение 10 мин и растирают по поверхности чашки с той же питательной средой, содержащей 2% агара и 50 мг/л

Из полученных описанным способом отдельных клонов трансформантов выделяют плазмидную ДНК методом, аналогичным методу выделения плазмиды pMS46, с тем отличием, что выращивание клетокЕ,coila дут в 10 мл питательной среды и все объемы растворов соответственно уменьшают в 50 раз по сравнению с указанными. Кроме того, вместо центрифугирования в растворе хлористого цезия используют обработку панкреатической РНКазой. Для этого осадок нуклеиновых кислот, полученный при осаждении изопропанолом, растворяют в

100 мкл буфера для рестрикции и обрабатывают 10 мкл раствора РНКазы (1 мгlмл) в течение 30 мин при 37 С. Такой препарат используют для рестрикционного анализа строения плазмид в индивидуальных клонах, В случае плазмиды pMSIL анализ проводят следующим образом. К порциям по 3 мкл препарата плазмиды добавляют по 7 мкл воды и далее отдельные порции обрабатывают следующими комбинациями рестрикционных эндонуклеаз (по 10 ед.): Sal i

+ Hindlll (искомая плазмида дает фрагмент

1760 п.о,), EcoRI - Hindlll (фрагмент 960 п.о.), BamHI+ Sall (фрагменты 275, 520 и 560 п.о.). Из отобранного таким образом трансформантного клона, содержащего плазмиду

1770359

pMSIL, препаративно выделяют плазмидную ДНК, как описано для плазмиды pVS46.

С целью получения челночной плазмиды pjDB(MSIL) теми же методами препаративно очищают Sall-Hindlll фрагмент плазмиды pMSIL размером 1,76 т,п.о. и векторный фрагмент плазмиды pjDB207, гидроRèзовàííой теми же рестриктазами.

Л игируя два этих фрагмента, проводя трансформацию клеток Е.coli и рестрикционный анализ трансформантных клонов рестриктазгми EcoRI, Sall + Hindlll, BamHI

+ Sall, отбирают клон, содержащий плазмиду pjDB(MSIL), Из клеток этого клона вышеописанным методом препаративно выделяют плазмидную ДНК и используют ее для трансформации клеток дрожжей, как описано в примере 2.

Пример 2. С целью получения штамма дрожжей Saccharomyces serevisiae, синтезирующего интерлейкин-2 человека, клетки дрожжей штамма GC-1-GRF18 трансформируют плазмидой pjDВ(МSIL) следующим образом, Дрожжевой штамм реципиент выращивают на среде УЕРЭдо достижения культурной оптической плотности при 600 нанометрах2 — 4, Клеткидважды промывают водой и один раз 0,1 М натрийцитратным буфером, содер>кащим 1 M сорбит, суспендируют в том >ке буфере и обрабатывают сначала 150 мкл меркаптоэтанола в течение

15 мин при 30 С, а затем 150 мкл глюкуронидазы в течение 30 — 60 мин при той же температуре, Полученные таким образом сферопласты трижды промывают одномолекулярным сорбитом, суспендируют в 0,01 М трис-HCI буфере, содер>кащем 0,01 М хлористого кальция и 1 M сорбита, и после добавления 10 мкг ДНК плазмиды pjDB(MSIL) инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем к суспензии клеток добавляют

447, раствор полиэтиленгликоля 4000, вы. держивают ее 30 мин при 30 С, затем 2 мин при 42 С и высевают глубинным посевом на среду SC. содержащую 1 агара и гистидин в концентрации 50 мг/л.

Штамм дрожжей Saccharomyces

cerevisiae GC-1-GRF18-pjDB(MSIL) характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки, Клетки округлой, слегка овальной формы, размером примерно 5 — 10 мкм, у части клеток наблюдаются прикрепленные к их поверхности дочерние клетки или почки.

Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на полных органических средах;

ПЕП вЂ” 2% пептона, 2/ глюкозы; ПЕПФО—

2 / пептона, 2/ глюкозы, 0,15/ однозамещенного фосфата калия. YEPD — 2/ пептона, 1 /, дрожжевого экстракта, 2 /, глюкозы.

Помимо полных органических сред клетки хорошо растут на минеральной среде состава; 0,67/ Yeast nitrogen base("Difco"), 27, глюкозы (среда SC), с добавлением 50 мг/л гистидина, а также на других синтетических средах для дрожжей, содержащих добавку 50 мг/л гистидина, При росте на твердых средах образуют гладкие, круглые, мутные колонии с матовой поверхностью, светло-кремового цвета, край ровный.

При росте в жидких средах образуют интенсивную ровную муть. Культура имеет характерный запах дрожжей.

Физиолого-биохимические признаки.

Клетки растут в пределах 4 — 37 С, при оптимуме 30 С.

При росте в аэробных условиях клетки значительно закисляют культуральную среду. Оптимум рН для роста составляет 3,5—

5,5.

В качестве источника углерода клетки могут использовать многие простые органические соединения, в частности глюкозу, сахарозу, глицерин.

В качестве источника азота при условии добавки гистидина клетки могут использовать как минеральные соли в аммонийной форме, так и простые органические соединения — мочевину, аминокислоты.

Клетки способны как к аэробному, так и к анаэробному росту.

Существенными признаками штамма являются потребность в гистидине и прототрофность по лейцину.

Содержание интерлейкина-2 в штамме

GC-1-GRF18-pjDB(MSIL) составляет 1 млн.ед./мл клеточного экстракта. В весовом представлении продукции интерлейкина-2 достигает 30 — 50 мг на литр дрожжевой кул ьтуры.

Штамм дрожжей Saccharomyces

cerevisiae GC-1-GRF18-pjDB(MSIL)-продуцент человеческого интерлейкина-2 депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКМП-У791.

Таким образом, изобретение позволяет достичь уровня синтеза интерлейкина-2 человека 30-50 мг на литр дрожжевой культуры, что соответствует 10 ед. на 1 мл клеточного экстракта, Преимущество изобретения состоит также в том, что по сравнению с известными продуцентами интерлейкина-2 на основе Е,coli у дрожжей отсутствуют токсические свойства и, следовательно, возможна более эффективная очистка интерлейкина-2 от вредных примесей.

1 0359

Составитель Т.Забойкина

Техред M.Mîðãåíòàë Корректор О.Циманис

Редактор Г. Бел ьская

Заказ 3713 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва. Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Формула изобретения

1, Рекомбинантная плазмидная ДНК р)0В(МЯ ), обеспечивающая синтез интерлейкина-2 человека в клетках дрожжей

Saccharomyces cerevisiae с мол,м. 5,2-Мд и размером 8,0 т,п,о„содержащая — Hind I I Iâ

BamHI — фрагмент плазмидной ДНК бифункционального бактериально-дрожжевого вектора pjDB207 размером 6,6 т.п.о., включающий бактериальный ген устойчивости к ампициллину, бактериальную область инициации репликации, фрагмент дрожжевой двумикронной плазмиды и дрожжевой ген

LEU2; BamHI — EcoRI — фрагмент гена рН05 дрожжей, содержащий промотор этого гена размером 0,52 т,п.о.; EcoRI — Sall — фрагмент плазмиды рАА 12, 13-23, несущий часть гена интерлейкина-2 человека, включающего всю кодирующую и часть 3-некодирующей области этого гена, размером 0,56 т.п.о.:

Srnal — BamHI — фрагмент полилинкерного участка плазмиды pUC19 размером 8 п.о.;

Sau3A — PstI — фрагмент гена РН05 дрожжей, содержащий терминатор транскрипции этого гена, размером 0,37 т.п.о. Pst—

Hindill — фрагмент полилинкера плазмиды

pUC19 размером 20 п,о.; бактериальный ген

bla, обеспечивающий синтез беталактамазы в бактериях и устойчивость к ампициллину; бактериальный локус OII, обеспечивающий репликацию плазмиды в клетках Е.coli; фрагмент двумикронной ДНК дрожжей, обеспечивающий автономную репликацию плазмиды в дрожжах; дро>кжевой ген LEU2, обеспечивающий биосинтез изопропилмалат дегидрогеназы в дрожжах и возможность роста мутантов leu2 на селективных средах без лейцина; промотор гена РН05 дрожжей, обеспечивающий инициацию

5 транскрипции гена интерлейкина-2; терминатор транскрипции гена РН05, обеспечивающий правильную терминацию транскрипции гена интерлейкина-2 в дрожжах; уникальные сайты рестрикции: 2EcoRI, 10 Hin dill, Sall.

2, Способ получения рекомбинантной плазмидой ДНК pjDB(NSIL), обеспечивающей синтез интерлейкина-2 человека в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae, 15 заключающийся в том, что фрагмент гена интерлейкина-2 из плазмиды рАА 12, 13 — 23, ограниченный рестрикционными сайтами

EcoRI и Sall, лигируют с векторной частью плазмиды pMS46, гидролизованной рестрик20 тазами EcoRI и Smal, из полученной плазмиды PMSIL гидролизом рестриктазами Sall u

Hindlll вырезают фрагмент ДНК. содержащий состыкованные в правильной ориентации промотор дрожжевого гена РН05, 25 кодирующую часть гена интерлейкина-2 и терминатор транскрипции гена РН05, далее этот фрагмент лигируют с векторной частью плазмиды pjDB207, гидролизованной рестриктазами Sall и Hindlll, клоны, содержа30 щие необходимые конструкции, отбирают по данным рестрикционного анализа, 3. Штамм дрожжей Saceharomyces

cerevisiae ВКПМ У-791 — продуцент интерлейкина-2 человека.