Способ получения нехолерогенных цамф-негативных вариантов холерного вибриона

 

Использование: получение вариантов холерного вибриона, дефектных по экспрессии различных признаков. Сущность изобретения: конъюгационное введение плазмиды кишечной палочки pGA 6012 в клетку холерного вибриона, выращивание и отбор трансконъюгантов, не способных к синтезу цАМФ и не обладающих холерогенностью.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5!)5 С 12 N 15/03

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4888422/13 (22) 05.12.90 (46) 07.11.92. Бюл. ЬЬ 41 (71) Ростовский-на-Дону государственный научно-исследовательский противочумный, . институт (72) Л.А.Шевченко, И.Л.Поздеева, А.Ф.Пинигин и Б.Н,Мишанькин (56) J.Àðði. Bacteriol., 1967, ч,22, М 3, р.157161.

Миллер Дж, Эксперименты в молекулярной генетике. М.: Мир, 1976, с. 440.

Изобретение относится к медицинской микробиологии, к молекулярной биологии, связанной с получением вариантов, дефектных по экспрессии различных признаков.

До настоящего времени неизвестны варианты холерного вибриона, дефектные по уровню внутриклеточного цАМФ. Между тем этот нуклеотид, являясь вторичным мессенджером, контролирует синтез болей 60 белков прокариотов, влияет на различные функции бактериальных клеток, включая синтез нуклеиновых кислот, различные этапы клеточного деления, проницаемость мембран, репрессию биосинтетических энзимов и регуляторных белков, репликацию плазмид и лизогенизацию бактериофагом.

ЦАМФ является непосредСтвенным участником развития патологического процесса при холере, когда при контакте вибриона с эпителием кишечника последним выбрасывается в просвет большое количество циклического нуклеотида. Это, наряду с другими факторами, по-видимому, обусловливает нарушение функций эукариотических клеток.,, ЯЛ,, 1773940 A1 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НЕХОЛЕРОГЕННЫХ цАМФ-НЕГАТИВНЫХ ВАРИАНТОВ

ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА (57) Использование: получение вариантов холерного вибриона, дефектных по экспрессии различных признаков. Сущность изобретения: коньюгационное введение плаэмиды кишечной палочки pGA 6012 в клетку холерного вибриона, выращивание и отбор трансконьюгантов, не способных к синтезу цАМФ и не обладающих холерогенностью.

ЦАМФ-негативный вариант может быть использован для выявления катаболитчувствительных генов холерного вибриона, изучения регуляторных процессов в клетке, связанных с особенностями биологии возбудителя, изучения механизма действия д нуклеотида при патогенезе, а также для выяснения вопросов взаимосвязи циклонуклеотида и вирулентности.

Известен способ получения цАМФ-негативных вариантов бактерий (Миллер Дж. О

Эксперименты в молекулярной генети- « ке.Пер. с англ. М.: Мир, 1976.. с.440), предус- (3 матривающий обработку суспензии нитроэогуанидином с последующей инкубацией в бульоне в течение ночи, высев обработанной культуры на среду, содержащую тетразолий, арабиноэу, мальтозу, с последующей инкубацией в течение 18 ч: отбор и очистку окрашенных колоний, проверку колоний на способность расти на минимальном агаре с лактозой и минимальном агаре с арабинозой, мальтозой, глицерином, рамнозой и глюкозой и заключительной провер1773940 кой предполагаемых мутантов на способность расти на минимальном агаре с глюкозой и отвечать нэ добавление экзогенного цАМФ, Способ состоит из 7 этапов, требует 5 пересевов на питательные среды с добавлением различных компонентов и затраты времени — 7 дней. К тому же обработка химическим мутагеном сопряжена с неконтролируемым повреждением генома в различнь1х его областях, что далеко не всегда соответствует целям эксперимента и порой сильно затрудняет его толкование.

Целью изобретения является ускорение способа получения цАМФ-негативных вариантов холерного вибриона зэ счет исключения возможности генетических повреждений хромосомэльного аппарата клетки.

Цель достигается путем коньюгационного введения плазмиды кишечной палочки

pGA 6012 (Km, Тс, Sn, Cm, Su ) в клетку холерного вибриона и высева вибрионов на селективную среду с рифампиционом и одним из следующих антибиотиков:канэмицином, стрептомицином, тетрациклином.

Концентрации антибиотиков подобраны в типовых экспериментах.

Пример 1. Культуру донора

Escherich!a coli 653 и культуру реципиента

Vibrio cholerae cholerae ОГ-75, устойчивого к рифампицину. выращивали 18 — 20 ч в бульоне сердечной мышцы рН 7,6, На пластинки мясо-пептонного агара рН 7,6 высевали 0,3 мл культуры донора, а затем вторым слоем наносили 0,3 мл культуры реципиента и чашки оставляли при 37 С в течение 3 ч.

Клетки смывали 5 мл физиологического раствора, полученную суспензию после соответствующих разведений высевали по 0,1 мл на мясо-пептонный агар, содержащий

100 мкг/мл рифампицина и 50 мкг/мл канамицина. Посевы инкубировали при 37 С в течение 48 ч. Выросшие трэнсконъюганты, несущие плазмиду pGA 6012, использовали для изучения содержания цАМФ и холерогенности.

Исходный штамм холерного вибриона

ОГ-75, ревертант, полученный после элиминации плазмиды pGA 6012 с помощью бромистого этидия, и трансконьюганты исследовали на содержание цАМФ.

Для этого клетки высевали в 100 мл бульона Мартена рН 7,6 и выращивали при 37 С 5 ч с аэрацией до конца логарифмической — начала стационарной фазы (ОП6оо ни=1,2), осаждали центрифугированием при 6000 об/мин 10 мин, суспендировали в300мкл 50мМтрис-HCi pH7.5с4мМ

ЭДТА и лизировали добавлением 100 мкл

10

30 хлороформа. Лизат осветляли при 16000 об/мин и исследовали на наличие цАМФ.

Количество белка в лизатах определяли методом, основанном на спектрофотометрировании растворов при двух длинах волн, разности в величине оптической плотности при 228,65 и 234,5 нм, Концентрация белка, вносимая в пробу при определении цАМ, составляла 60 мкг.

При определении цАМФ инкубацию образцов проводили на ледяной бане в течение 2 ч. Отделение белоксвязанного цАМФ от несвязанного нуклеотида осуществляли адсорбцией свободного нуклеотида на угле марки "Норит А", для чего в каждую пробу добавляли 100 мкл угольной суспензии (2,ба-ный раствор угля, 2оь-ный раствор БСА) с последующим центрифугированием при 10000 об/мин.

Равные количества супернатанта (200 мкл) помещали во флаконы для сцинтилляционного счета и считали на жидкостном сцинтилляционном счетчике "Mark 2".

Концентрацию нуклеотида выражали в пикомолях 1 мг белка.

Трансконъюганты, несущие плаэмиду

pGA 6012. при выращивании в богатой питательными веществами среде в конце логарифмической — начале стационарной фазы роста цАМФ, не синтезируют.

Изучение холерогенных свойств проводили на модели кроликов-сосунков, которым под тиопенталовым наркозом вскрывали брюшную полость, извлекали петлю тонкой кишки и в ее просвет вводили взвесь микробов. Затем петлю погружали обратно в кишечную полость, брюшную стенку и кожу зашивали. Для заражения использовали три дозы микробных клеток 10, 105 и 10 . Погибших и хлороформированных животных вскрывали через 48 ч. Степень холерогенности оценивали по скоплению жидкости в проксимальном отделе толстого кишечника по четырехбальной системе. Об45 наружено, что Кспо1егае cholerae 0-75 и ревертант утративший плаэмиду pGA 6012, в дозе 10 — 10 микробных клеток вызывали т большое скопление бесцветной жидкости в проксимальном отделе толстого кишечника.

50 Все изученные трэнсконъюганты изменений в кишечнике не вызывали. Это свидетельствует о том, что несущие плазмиду кишечной палочки pGA 6012 трансконъюганты полностью утрачивают холерогенные

55 свойства, которые однако могут восстанавливаться после элиминации данной плазмиды.

Пример 2. Культуру донора

EscherichIa соИ G 53 и культуру рифампицинорезистетного реципиента Vibrio cholerae

1773940

Составитель Б. Мишанькин

Техред M.Ìîðråíòàë Корректор Н. Гунько

Редактор

Заказ 3908 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101

cholerae ОГ-75 выращивали 18-20 ч в бульоне сердечной мышцы рН 7,6. На чашки мясо-пептонного агара рН 7,6 высевали 0,3 мл культуры донора. а затем вторым слоем наносили 0,3 мл культуры реципиента и чашки оставляли при 37 С в течение 3 ч.

Клетки смывали 5 мл физиологического раствора, полученную суспензию после соответствующих разведений высевали по 0,1 мл на мясо-пептонный агар, содержащий

100 мкгlмл рифампицина и 30 мкг/мл стрептомицина. Посевы инкубировали при

37 С в течение 48 ч. Выросшие трансконъюганты, несущие плазмиду pGA 6012, использовали для изучения содержания цАМФ и холерогенности.

Исходный штамм холерного вибриона

ОГ-75, ревертант, полученный после элиминации плазмиды р6А 6012 с помощью бромистого этидия, и трансконъюганты исследовали на содержание цАМФ.

Для этого клетки высевали в 100 мл бульона Мартена рН 7,6 и выращивали при

37 С 7 ч аэрацией до конца логарифмической — начала стационарной фазы (ОПвоо н 1,5). Далее, как е примере 1.

Пример 3. Культуру донора

Escherichla соП G53 и культуру рифампицинорезистентного реципиента Vibrio

cholerae eltor И-563 выращивали 18 — 20 ч в бульоне сердечной мышцы рН 7,,6, На чашки мясо-пептонного агара рН 7,6 высевали

0,3 мл культуры донора, а затем вторым

1 слоем наносили 0,3 мл культуры реципиента и чашки оставляли при 37 С в течение 3 ч.

Клетки смывали 5 мл физиологического раствора, полученную суспензию после соответствующих разведений высевали по 0,1 мл на мясо-пептонный агар, содержащий

100 мкгlмл рифампицина и 30 мкгlмл тетрациклина. Посевы инкубировали при 37ОС в течение 48 ч. Выросшие трансконьюганты, несущие плазмиду рба 6012. использовали для изучения; содержания цАМ Ф и холероI генности.

5 Исходный штамм холерного вибриона

И-563, ревертант, полученный после элиминации плазмиды pGA 6012 с помощью акридинового оранжевого и трансконьюганты исследователи на содеражение цАМФ.

10 Для этого клетки высевали в 100 мл бульона Мартена рН 7,6 и выращивали при

37 С 7 ч с аэрацией до конца логарифмической — начала стационарной фазы (Ofl воо нм

1,5). Далее как в примере 1, 15 Все полученные трансконьюганты были цАМФ-негативными и холерогенными.

Таким образом, предложенный способ получения цАМФ-негативных вариантов холерного вибриона, связанных с вирулентно20 стью, требует меньшего числа манипуляций и меньших материальных затрат, исключает повреждение генетической информации клетки холерного вибриона, дает возможность в случае необходимости элиминиро25 вать плазмиду и полностью восстановить генотип исходного штамма.

Формула изобретения

Способ получения нехолерогенных

30 цАМФ-негативных вариантов холерного вибриона путем обработки исходных клеток . холерного вибриона, выращивания и отбора клеток, не содержащих цАМФ и обладающих холерогенностью, отличающийся

35 тем, что. с целью ускорения способа, обработку осуществляют путем совместного выращивания с клетками Escherichla соИ, несущими плазмиду pGA 6012, выращивание проводят в бульоне из сердечной мыш40 цы, а затем на мясо-пептонном агаре с антибиотиками.