Способ хранения иммобилизованных микромицетов

 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Сущность изобретения заключается в том, что для увеличения срока хранения активных продуктов пектолитических ферментов - грибов рода Asperglllus и увеличения их ферментативной активности, грибы иммобилизуют на неаппретирован ной хлопчатобумажной ткани - бельтинге и в последующем хранят в условиях голодания культуры при 4° С. Пектолмтическая активность культуры AspergiifuS awamorl 16 через 15мес хранения достигает 10,25 кд/мл. 2 табл.

COIA3 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

gl it/ t

ОГ1 ИСАИ ИЕ И 3 СЬРЕТЕ Ь ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4816801/13 (22) 23.04.90 (46) 15.11.92 Бюл. N. 42 (71) Институт микробиологии и вирусологии

АН КазССР (72) Р.К.Блиева и А,А.Белходжаева (56) В.И.Кудрявцев, М,В.Фатеева и Т.Н,Никитина. Хранение коллекционных дрожжевых культур под минеральным маслом—

Микробиология, 1972, 11 М 5, с, 903.

Патент ГДР йг 246025 А1, кл. А 23! 2/34, 1987, Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии, а именно к способу хранения культур, используемых в промышленной биотехнологии с целью получению ферментов, антибиотиков, аминокислот и других биологически активных веществ.

Существуют способы хранения спорового материала на твердых средах под маслом.

Наилучшие результаты достигнуты при хранении иммобилизованного на носителе мицелия Asp. niger, применяемого при осветлении яблочного сока. Способ заключается в том, что мицелий замораживают для консервирования при температуре от -25, до -30 С, в таком виде его хранят больше одного года. После оттаивания и двухразовой промывки мицелий используют для обработки яблочного сока. Исходная, до

ЬИ,, 177547О А1 (я)з С 12 N 1/04, 9/96, // (С 12 N 1/04 // С 12 8 1:66) (54) СПОСОБ ХРАНЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ МИКРОМИЦЕТОВ (57) Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Сущность изобретения заключается в том, что для увеличения срока хранения активных продуктов пектолитических ферментов — грибов рода

Азрег9И!из и увеличения их ферментативной активности, грибы иммобилизуют на неаппретирован ной хлопчатобумажной ткани — бельтинге и в последующем хранят в условиях голодания культуры при 4 С. Пектолитическая активность культуры АзрегцНЬз

awamori 16 через 15 мес хранения достигает

10,25 кд/мл. 2 табл, замораживания, пектолитическая активность сохраняется после хранения.

Недостатками прототипа являются условия хранения иммобилизованного мицелия, требующие морозильные камеры, кроме того способ хранения не обеспечивает хранения не обеспечивает повышения образования культурой пектинрасщепляющих ферментов.

Целью изобретения является удлинение сроков хранения культуры в жизнеспособном состоянии и увеличение их ферментативной активности.

Указанная цель достигается путем хранения иммобилизованнойл мицелиальной культуры Asp, awamori 16 неаппретированной хлопчатобумажной ткани — бельтинге при 4 С в условиях голодания, с периодической рекультивацией 1 раз в течение 1,5-3 месяцев на полной-питательной среде, содержащей 5 г/л индуктора-пектина.

1775470

Особенностью заявляемого способа является то, что в результате хранения удается не только стабилизировать, но и повысить в

18 раз активность 8-дневного мицелия, заклэдываемого на хранение.

Для осуществления данного способа используют устройство для культивирования. Устройство состоит из качалочной колбы на 750 мл, подложки в форме диска. Для подложки используют пенополиуретан или хлопчатобумажную неаппретированную ткань бельтинг. Для выявления наиболее оптимальных условий хранения споры иммобилизуют на различных носителях и культивируют при разных концентрациях пектина, Контроль за уровнем образования ферментов, продуцируемых мицелием, проводили, определяя активность полигалактуроназы (ПГ), вискозиметрически по методу

Витакера в модификации Родионовой с соавторами.

Пример 1, 2% водную суспензию спор

Asp, awamori 16 адсорбируют на подложке из пенополиуретана и культивируют 8 дней в колбе на среде со следующим составом, г/л: лактоза 20, пектин 5, (МН4)у SOq 7, K C I 0,5, КН2 РО4 1, MgS04 0,5, FeSO4 следы.

Анализ активности ПГ и смену культуральной жидкости (к. ж,) производят на 3, 6, 8 сутки. После слива к. ж. у 8 — дневной культуры колбу с мицелием ставят на хранение в холодильник при 4 С. Периодически, 1 раз в 1,5 — 3 месяца — культивируют в новой питательной среде. После 8 суток культивирования активность ПГ начала падать (табл. 1) — 0,9 ед, При хранении в последующие 8 суток в холодильнике активность возросла до 2,85 ед, При дальнейшем хранении, на 74 сутки активность продуцируемого фермента достигла максимума, с последующим падением к 121 суткам. После 140 суток в культуре отмечали преобладаниепроцессовлизиса. Срокхранения в этом варианте опыта был 140 суток, Пример 2. 2%-ную водную суспензию спор Asp. awamori 16 адсорбируют на подложке иэ бельтинга и культивируют в колбе со следующей средой, г/л; лактоза 20, пектин 5, (NH4)2 504 7, KCi 0,5, КН2 РОд 1, MgSO4 0,5, FeSO4 следы.

Иммобилизованный мицелий культивируют и хранят как указано в примере 1.

Активность ПГ в к. ж. до хранения также как и в первом варианте опыта уменьшается на

8 сутки. После выдерживания 8 суток в холодильнике активность возрастает в 4 раза по сравнению с исходным и на 74 сутки в 15 раэ, Затем наблюдается стабилизация в образовании ПГ до 4 — го месяца. При очередной рекультивации культуры на 160 сутки наблюдали повышение активности в 18 раэ.

25 Пример 4. 2%-ную водную суспен30

45

55

В период от 160 до 360 суток хранения на блюдается стабилизация активности. В последующие 360 — 450 суток активность упала, но относительно исходной была в 9 раз выше, В данном варианте опыта в процессе длительного хранения при рекультивации в новой среде нарастал новый мицелий, который успешно сохранялся в первоначальном виде от одной рекультивации до другой.

Пример 3. 2%-ную водную суспензию спор Asp. awamori 16 эдсорбируют на подложке из пенополиуретана и культивируют в среде со следующим составом, г/л: лактоза20, пектин 20,(NH4)z 304 7, KCI 0,5, КН2 Р04 1, MgSO< 0,5, РЕ$04 СлЕды.

Иммобилизованный мицелий культивируют и хранят как указано в примере 1.

Концентрация пектина — 20 г/л оказывает заметное ингибирующее действие на активность ПГ (табл. 1) и жизнеспособность в динамике, втечение 1 года хранения.

Несмотря на появление новых клеток, после рекультивирования степень лизиса значительна, эию спор Asp. awamori 16 адсорбируют из бельтинга и культивируют в колбе со средой следующего состава, г/л: лактоза 20, пектин

20, (ЫH4)2 $04 7, KCI 0,5, КН2 Р04 1,.

MgSO4 0,5, FeSO< следы..

Иммобилизованный мицелий культивируют и хранят как указано в примере 1.

Несмотря на иммобилизацию мицелия на бельтинге, концентрация пектина — 20 г/л, также как и в 3 варианте опыта оказывает заметное ингибирующее воздействие на индуцирование фермента, Активность ПГ после 8 дней хранения вначале возрастает в 2 раза, затем стабилизируется. К концу года уменьшается относительно исходной в 5 раз, Процессы лизиса в мицелии начинают преобладать с 2 месяцев хранения

Пример 5. Из культуры, хранившейся

121 день в оптимальных условиях, т. е. при иммобилизации на бельтинге и концентрации пектина — 5г/л, получили споровый материал на среде Роллена.

При последующем культивировании спорового материала получили результаты, представленные в табл. 2.

Как видно из результатов, активность

ПГ 3 — дневного мицелия, полученного из культуры, хранившейся 121 день, выше чем активность контрольного обычного, неиммобилизованного 3-суточного мицелия, не. подвергавшегося хранению. Результаты опыта еще раз подтверждают закономерность повышения активности ПГ в оптимальных условиях хранения.

1775470

Таким образом, для хранения иммобилизован ного мицелия Asp. awamorl 16 в течение длительного времени (1 год и 3 месяца) наиболее оптимальными условиями являются следующие: носитель для иммобилизации мицелия — бельтинг, концентрация пектина — 5 г/л. Использование оптимальных условий позволяет не только успешно хранить культуру в виде иммобилиэованного мицелия, но и повысить в 18 раз активность ПГ по сравнению с исходным 8 — дневным мицелием, сохранить ее стабильность на высоком уровне в течение года.

Формула изобретения

Способ хранения иммобилизованных микромицетов, включающий иммобилиэа5 цию культур грибов рода Аэ регул! из — активных и родуцентов пектолитических ферментов на носителе и последующее хранение при низкой температуре, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью увеличения срока

10 хранения культур и ферментативной активности, в качестве носителя используют бельтинг, а хранение осуществляют при 4

С в условиях голодания культур.

Таблица 1 . Влияние различных носителей и концентрации пектина на активйость полигалактуроназы в процессе хранения

Активность ПГ, е /мл

Срок хранения, сутки

Кон ент а ия пектина, г/л и тип мате иала пектин-20 г/л бельтинг пектин-5 г/л бельтинг пектин-20 г/л пенополи етан пектин-5 г пенополи етан

0,95

1,12

2,82

1,52

8 суток, исходная к льт а

Закла ка на х анение

2,85

8,92

4 6.3,17

2,11

2,15

1,47

0,87

0.33

Таблица 2

Влияние оптимальных условий на сохранение активности полигалактуроназы

Примечание. Контроль — споровый материал, хранившийся в обычных условиях на среде Роллена под маслом

Составитель В.Соина

Техред М.Моргентал

Редактор В.Трубченко

Корректор П. Гереши

Заказ 4022 Тираж . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, )К-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

16

74

121

450

5,25

15,86.

14,42

18,99

18,91

17,51

10,25

1,12

1,21

1,25

1,86

2,05

0,73

0.65