Реагент для определения концентрации глюкозы в сыворотке крови

 

Использование: в медицинской биохимии и аналитической химии для определения глюкозы в сыворотках крови. Цель: повышение точности определения, удешевление стоимости реагента и увеличение его стабильности. Сущность изобретения: реагент для определения глюкозы представляет собой смесь следующих ингредиентов: глюкозооксидаза 4,5-9,0 ЕД, пероксидаза 0,25-2,0 ЕД, 4-аминоантипирин 0,019-0,056 мг, фенол 0,27-1.29-мг, лошадиный сывороточный альбумин 5-10 мг, фосфатный буферный раствор рН 6,2-7.2 - 1 мл. Положительный эффект: сокращается расход реактивов, повышается воспроизводимость анализа, увеличивается срок хранения реактива до 7 недель. сл с

союз соВетских

СОЦИАЛ ИСТИЧ Е СКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4827822/14 (22) 21,05.90 (46) 23.11.92. Бюл. I+ 43 (71) Новосибирский институт биоорганической химии С0 АН СССР, Межотраслевое научно-производственное ооьединение

"Биостарт" и Томский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток Научно-производственного объединения

"ВИРИОН" (72) Г.А.Афонина, Д.Ц.-Д.Булдаева, С.Н.3агребельный, Г.И.Ким, M.Â.Êîëìàêîâà, З,P.Êóñêoâà, В.И.Пупкова, В.К.Старостина, T.À.×èìèòîBà, Е.А.Курбатова, И.Д.Стальная, P.À.Òèãðàíÿí и Р,M.ßöåíòþê (56) Wu G.Т., Twomey S.L., Thiers R.Е,j/

СИп. Chem., 1975, ч.21, р. 315-320.

Биометрия, M., 1973.

Тодоров И. Клинические лабораторные исследования в педиатрии. София, Мед. и физкультура, 1968, с.582, Изобретение относится к медицинской биохимии, аналитической химии, а именно к созданию наборов реактивов, позволяющих определять глюкозу в сыворотках крови ферментативным методом.

B основу наборов положен ферментативный метод. заключающийся в том, что глюкоза окисляется кислородом воздуха при каталитическом действии глюкозооксидазы (ГОД), с образованием перекиси водорода и Р -глюконолактона. Образовавшуюся перекись водорода определяют по индофеноловой реакции 4-аминоантипирина (4-AAfl) c хромогеном, катализируемой пероксидазой.

Количество образовавшегося красителя при

Я.| |„, 177б692 А1 (st)s С 12 0 1/28, G 01 и 33/48, 33/573 (54) РЕАГЕНТ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (57) Использование: s медицинской биохимии и аналитической химии для определения глюкозы в сыворотках крови. Цель; повышение точности определения, удешевление стоимости реагента и увеличение его стабильности. Сущность изобретения: реагент для определения глюкозы представляет собой смесь следующих ингредиентов: глюкозооксидаэа 4,5 — 9,0 ЕД, пероксидаза

0,25 — 2,0 ЕД, 4-аминоантипирин 0,019-0,056 мг, фенол 0,27-1,29 мг, лошадиный сывороточный альбумин 5 — 10 мг, фосфатный буферный раствор рН 6,2-7,2 — 1 мл, Положительный эффект: сокращается расход реактивов, повышается воспроизводиMocTb анализа, увеличивается срок хранения реактива до 7 недель. соблюдении рабочих условий пропорционально содержанию глюкозы.

Известны наборы реактивов для определения глюкозы в сыворотках крови ферментативным методом.

Известен набор реактивов для определения глюкозы ферментативным методом, включающий следующие компоненты в указанных концентрациях:

1. Смесь ферментов -- 0.22 г

Глюкозооксидаза — 4 ед.акт./мл

Пероксидаза — 1 ед.акт./мп

4-аминоантипирин — 0,34 ммол ь /л

Натрий сернокислый до 0,22 г

1776692

2. Хромоген (1,0 г) — 4-хлор-3-метилфенол 0.3 ммоль/л со Словасолом 0 и натрием сернокислым.

3. Буферный раствор — трис 0,91 моль/л рН 8,3. 5

4; Эталон глюкозы — 25 ммоль/л.

Недостатками данного набора являются

1. Малый срок хранения набора реактивов в растворе, который составляет 1-2 не- 10 дели.

2. Применение в качестве хромогена малодоступных реактивов — 4-хлор-3-метилфенола и Словвсола О.

3. 8 практической лаборатории воспро- 15 изводимость метода с использованием данного набора невелика и составляет 8,8 .

Наиболее близким к заявленному является набор реактивов для определения глюкозы ферментативным методом, который 20

coGToMT из следующих компонентов в указанных концентрациях:

1. Буфер, ферменты;, 4-ААП вЂ” фосфатный буфер 100 ммоль/л рН 7,0; ГОД 18 ед.акт./мл; пероксидаза 1,1 ед,an ./мл; 4- 25

ААП вЂ” 0,77 ммоль/л

2, Фенол — 11 ммоль/л

3. Этанол глюкозы — 0,505; 5.55 ммоль/л.

Недостатками прототипа являются: 30

1. Большой расход реактивов: ГОД вЂ” 18 ед.акт./ мл; фенола — 11ммоль/л; 4-ААП0,77 ммоль/л.

2, Малый срок хранения набора в растворе: 4 недели при температуре (2-8) С. 35

3, Сложность приготовления набора изза фиксированных значений концентрации компонентов набора.

Целью изобретения является улучшение воспроизводимости анализа, удешевле- 40 ние стоимости реагента и увеличение его стабильности при сохранении правильности определения глюкозы.

Поставленная цель достигается созданием набора, содержащего следующие ком- 45 поненты в указанных концентрациях:

Ферментная смесь: при отношении активностей ГОД/пероксидаэа от l8 до 4,5

1. ГОД вЂ” 4,5-9,0.åä,àêò./ìë

2. Пероксидаза — 0,25-2,0 ед.акт./мл 50

3. 4-ААП вЂ” 0,19-0,056 мг(мл

4, Фенол — 0,27-1,29 мг/мл

5. Лошадиный сывороточный альбумин (ЛСА) - 0,1-10,0 мг/мл

6. Буферный раствор-0,1 моль/л, калий 55 фосфат (рН 7,0 + 0,5) — остальное, Определяющими отличительными признаками набора реактивов являются: — подобранное соотношение концентраций KQMnoHGHT08 набора; — введение в ферментную смесь стабилизатора ЛСА, что позволило:

1. Сократить расход реактивов, за счет чего значительно удешевить стоимость набора, 2. Повысить воспроиэводимость анализа (с ЛСА — 3,9, без ЛСА — 5,7 ).

3. Увеличить длительность хранения раствора набора до 7 недель.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется примерами.

Активность ферментов определяли по известным методикам.

Пример 1. К 1 мл раствора набора реактивов(концентрация которых указана в таблице) добавили 10 мкл сыворотки

"PrecIllp" (содержание глюкозы в ней 5,676,53 ммоль/л). Раствор перемешивали, выдерживали 40 мин при комнатной температуре и измерили оптическую плотность исследуемого раствора и эталона глюкозы с концентрацией 10 ммоль/л на спектрофотометре при длине волны 510 нм в кварцевых кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 1 см. Результаты анализа приведены в табл, 1.

Как видно иэ табл. 1, при соотношении активностей ГОД/пероксидаза от 4,5 до 18 данным набором глюкоза определяется правильно(М 1 — 3,6). При большем — 22,5 и меньшем — 3,0 отношении активностей

ГОД/пероксидаза результаты анализа неправильным (N 4 — 5).

Пример 2. Проведение анализа аналогично примеру 1. Концентрации компонентов и результаты анализа представлены в табл. 2.

Как видно из табл. 2, наборы правильно определяют глюкозу при концентрации ГОД ат4,5до9 и более ед.акт./мл(N 1 — 3,5); при меньшей концентрации ГОД глюкоза определяется неправильно (N. 4).

При фиксированном значении ГОД и пероксидаэы наборы правильно определяют глюкозу при концентрации 4-ААП от 0.019 до0,056мг/мл (%3,6, 7), при концентрации

4-ААП меньше 0.019 мг/мл и больше 0,056 мг/мл глюкоза определяется неправильно (М 8, 9).

Пример 3. Проведение анализа аналогично примеру 1, концентрации компонентов и результаты анализа представлены в табл, 3.

Как видно из табл. 3, наборы правильно определяют глюкозу при концентрации фенола от 0,27 до 1,29 мг/мл (N 1 — 3), и при концентрациях ЛСА от 0,1 до 10 мг!мл (hb 6 — 12). При меньшем содержании фенола — 0,20 мг/мл (N. 4) и большем содержании фенола — 1,42 мг/мл (N 5) и ЛСА — 11

1776692

0,25 — 2,0 ЕД

Таблица

» г»»»

Наименование и концентрация компонентов

Определено глюкозы, ммоль/л

Отношение

ГОД к пероксидазе

1 В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного раствора рН 7,0+0,5: ГОД 4,5 ед.акт./мл; пероксидазы 0,25 ед.акт./мл;

4-ААП 0,019 мг/мл; фенол 0,27 мг/мл;

ЛСА 0,1 мг/мл.

6,30

18,0

2 В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного раствора рН 7,0+0,5:ГОД 9 ед.акт./мл; пероксидазы 1 ед.акт,/мл;

4-ААП 0,056 мг/мл; фенол 1,29 мг/мл;

ЛСА 0,1мг/мл.

9,0

5,92

6,03

4 5

3 В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного раствора рН 7,0+0,5;ГОД 8 ед.акт./мл; пероксидазы 1,8 ед.акт,/мл;

4-ААП 0,056 мг/мл; фенол 0,27 мг/мл;

ЛСА 0,1 мг/мл.

5, 544

4 В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного раствора рН 7,0+0,5:ГОД 9 ед.акт./мл; пероксидазы 3 ед.акт./мл;

4-ААП 0,056 мг/мл; фенол 0,27 мг/мл;

ЛСА 0,1 мгlмл.

5,62

22,5

5 В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного раствора рН 7,0+0,5:ГОД 4,5 ед.акт/MR; пероксидазы 0,2 ед.акт ./мл;

4-AAll 0,056 мг/мл; фенол 0,27 мг/мл;

JICA 0,1 мг/мл.

6,25

4,5

6 В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного раствора рН 7,0 0,5:ГОД 9 ед.акт, /мл; пероксидазы 2 ед.акт./мл;

4-ААП 0,056 мг/мл; фенол 0;27 мг/мл;

ЛСА 0,1 мг/мл. мг/мл (hh 13) глюкоза определяется неправильно.

ЛСА в концентрации 11 мг/мл образует в растворе набора опалесценцию и тем самым искажает результаты определения глю- 5 козы. Хотя концентрация ЛСА 0,08 мг/мл позволяет правильно определять содержание глюкозы, она не обеспечивает хорошей воспроизводимости результатов и существенно не увеличивает срок хранения раство- 10 ра набора.

Формула изобретения

Реагентдля определения концентрации 15 глюкозы в сыворотке крови, содержащий глюкозооксидазу, пероксидазу, 4-аминоантипирин, фенол и фосфатный буферный раствор рН 6,8-7,2, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения, удешевления стоимости реагента и увеличения его стабильности, он дополнительно содержит лошадиный сывороточный альбумин при следующем соотношении компонентов:

Глюкозооксидаза 4,5 — 9,0 ЕД

Пероксидаза

4-Аминоантипирин 0,019-0,056 мг

Фенол 0,27 — 1,29 мг

Лошадиный сывороточный альбумин 5-10 мг

Фосфатный буферный раствор рН 6,8-7,2 1мл

1776692

Табли ца 2

Наименование и концентрация компонентов

Определено глюкозы, ммоль/л

6,20

В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного раствоРа рН 7,0+0,5:ÃÎI! 9 ед.акт./ил; пероксидазы 1,0 ед.акт./мл;

4-ААП 0,056 мгlмл; фенол 0,27 мг/мл;

ЛСА 0,2 мг/ил.

В 1 мл 0,1 моль/л Фосфатного буферного раствора рН 7,0+0,5: ГОД 7 ед.акт./мл; пероксидазы 1 ед.акт,/мл ;

4-АПП 0,056 мг/мл; фенол 0,27 мгlмл;

ЛСА 0,2 мг/мл.

В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного раствора рН 7,0+0,5:ГОД 3 ед.акт./мл; пероксидазы 1 ед.акт./мл;

4-ААП 0,056 мг/мл; Фенол 0,27 мг/мл;

ЛСА 0,2 мг/мл.

В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного раствора рН 7,0+0,5;ГОД 18 ед.акт./мл; пероксидазы 1 ед.акт./мл;

4-ААП 0,056 мг/мл; Фенол 0,27 иг/мл;

ЛСА 0,2 мг/мл.

6,23

В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного раствора рН 7,0+0,5:ГОД 9 ед.акт./мл; пероксидазы 1 ед.акт./мл, 4-Ailll 0,019 мг/мл; Фенол 0,27 мг/мл;

ЛСА 0,2 мг/мл.

В 1 ил 0,1 моль/л фосфатного буферного раствора рН 7,0 0,5: ГОД 9 ед.акт./Мл; пероксидаэы 1 ед.акт,/мл;

4-ААП 0,056 мг/мл; Фенол 0,27 мгlмл;ЛСА 0,2 мг/мл.

6,41

В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного раствора рН 7,0+0,5:ГОД 9 ед.акт./мл; пероксидаэы 1 ед.акт./мл;

4"АПП 0,016 мг/мл; фенол g,27 мг/мл;

ЛСА 0,2 мг/мл, В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного раствора рН 7,0+0,5; ГОД 9 ед.акт./мл; пероксидазы 1 ед.акт./мл;

4-RAll 0,062 мг/мл; фенол 0,27 мг/мл;

ЛСА 0,2 мг/мл.

5,60

В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного раствора рН 7,0-0,5:ГОД 4,5 ед.акт,/ил; пероксидазы 1 ед.акт./мл; 4-Aflll 0,056 мг/мл; фенол 0,27 мг/мл; ЛСА 0,2 мг/мл.

1776692

Таблица 3

Наименование и концентрации компонентов

Определено глюкозы ммоль/л

»»»»»» °

5,71

В 1 мл 0,1.моль/л фосфатного буферного раствора рН 7,0- 0,5:ГОД 9 ед.акт./мл; пероксидазы 1 ед.акт./мл;

4-AAll 0,050 мг/мл; фенол 0,27 мг/мл;

ЛСА О, 1 мг/мл.

В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного раствора рН 7,O O,5: ГОД 9 ед.акт ./мл; пероксидазы 1 ед.акт./мл;

4-ААП 0,050 мг/мл; фенол 1,29 мгlмл;

ЛСА 0,1 мг/мл.

5,82

5,94

6,69

6,го

6,18

В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного раствора рН 7,0 0,5!ГОД 9 ед.акт./мл; пероксидазы 1 ед.акт./мл;

4-ААП 0,050 мгlмл; фенол 0,65 мгlмл;

ЛСА 0,1 мг/мл.

В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного раствора рН 7,0 0,5:ГОД 9 ед.акт./мл; пероксидазы 1 ед.акт,/мл;

4-AAI1 0,050 мг/мл; фенол 0,20 мг/мл;

ЛСА О,! г/мл.

В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного раствора рН 7,0+0,5:ГОД 9 ед.акт./мл; пероксидазы 1 ед.акт./мл;

4-ААП 0,050 мг/мл; фенол 1,42 мг/мл;

ЛСА 0,1 мг/мл.

В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного раствора рН 7,0+0,5:ГОД 9. ед.акт./мл; пероксидазы 1 ед.акт./мл;

4-АПП 0,050 мгlмл; фенол 0,65 мг/мл;

ЛСА 0,2 мг/мл.

7 В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного раствора рН 7,0 -0;5:ГОД 9 ед.акт./мл; пероксидазы 1 ед.акт.мл;

4-ААП 0,050 мг/мл; фенол 0,65 мг!мл;

ЛСА 0,1 мг/мл.

8 В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного раствора рН 7,0+0,5:ГОД 9 ед.акт./мл; пероксидазы 1 ед.акт./мл;

4-ААП 0,050 мг/мл; фенол О,65 мг/мл;

ЛСА 0,15 мгlмл.

9 В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного раствора рН 7,0 0,5:ГОД 9 ед,акт./мл; пероксидаза 1 ед.акт./мл;

4-ААП 0,050 мг/мл; фенол 0,65 мг/мл;

ЛСА 0,08 мгlмл.

1776692

Продолжение табл. 3

10 В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного раствора рН 7,0 0,5:ГОД 9 ед.акт./мл; пероксидазы 1 ед.акт./мл;

4-ААП 0,050 мг/мл; фенол 0,65 мгlмл;

ЛСА мг/мл.

5,90

11 В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного раствора рН 7,0+0,5: ГОД 9 ед.акт./мл; пероксидазы 1 ед. акт. /мл;

4-ААП 0,050 мг/мл; фенол 0,65 мг/мл;

ЛСР 2 мг/мл.

5,75

12 В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного раствора рН 7,0"0,5:ГОД 9 ед.акт./мл; пероксидазы 1 ед.акт./мл;

4-ААП 0,050 мг/мл; фенол 0,65 мгlмл;

ЛСА 1О мг/мл.

5,70

13 В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного раствора рН 7,0+0,5:ГОД 9 ед.акт./мл; пероксидазы 1 ед.акт./мл;

4-ААП 0,050 мг/мл; фенол 0,65 мг/мл;

ЛСА 11 мг/мл.

6,60

Составитель В.Пупкова

Техред M,Moðãåèòàë Корректор О.Густи

Редактор Т,Иванова

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина. 101

Заказ 4101 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5