Способ получения n-ацильных производных пептидогликанового мономера или их фармацевтических солей

 

ИСПОЛЬЗОЕ ание в биологии и медицине. Сущность изобретения получение М-ациИзобретение относится к способу получения новых биологических активных соединении - N-ацильных производных пептидогликанового мономера или их фармацевтически применяемых солей, которые могут найти применение в биологии и медицине . Известен мономер пептидогликана (PGM), обладающий им,муномодулирующей и актиметастатической активностью PGM - нетоксичное и апирогенное соединение, ходильных производных пептидогликанового мономера формулы I Ctfj СН) но H«jCСН2ОН |Hjr--0((n2v,OH /ф-WWCOWHCHCOVHCHCaW кноссн,/мсссн,,е ЈНнг 7CHJ и / / f 5CHCOWHCHCOWHCHCOC4 , I,п..н % Ь RHtVtH-COV/h сн& С% где R - С2 - Cie ацил неразаветвленной кислоты, Cs разветсленной кислоты, Cis-алкенилкарбоновой кислоты, С ароматической карбоновой кислоты. Реагент 1. соединение I, где R - Н, реагент 2- ROH. Условия реакции: основание, продукты выделяют в свободном виде или в виде соли 2 та б л рошо растворимо в воде, но не растворимо в органических растворителях Благодаря высоко гидрофильной и липофобной природе оно не способно проникать через липофильные мембранв в организме Степень гидрофильности и липофильности таких соединений может значительно влиять на их активность. Цель изобретения - способ получения новых производных пептидогликанового маномера, обладающих более высокой имXJ Ч« Ю to сл 00 СА)

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) СПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К ПАТЕНТУ

° у.

1 с> нон

0Н

Н0

1 НОСС (21) 4743571/04 (22) 26.03.90 (46) 30,11.92. Бюл. ¹ 44 (31) P 626/89 (32) 27.03.89 (33) YU (71) Плива Фармацойтска, Кемийска, Прерамбена и Козметичка. Индустрия С,РО. (YU) (72) Божидар Шушкович, Радмила Наумски, Вера Гомерчич и Зденко Мубрин (YU) (56) Carbohydr Res, 1982 r. 110, с,320 —. 5, Jerne N,К. etal. The agar plague technlgue

for recognizing anti-body cells, In В.Amos Н.

Koprowsku (eds): Cell Bound Antibodies.

Wistar Inst, Press. Philadelphia 1963: 109—

115.

Turk J.L., Delayed Hyperstsltlvity. Third

Revised Editijn. Elsevier/North Holland

Biomedical Press, Amsterdam. 1980. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ N-АЦИЛЬНЫХ

ПРОИЗВОДНЫХ ПЕПТИДОГЛИКАНОВОГО МОНОМЕРА ИЛИ ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ СОЛЕЙ (57) Использо ание: в биологии и медицине.

Сущность изобретения: получение N-ациИзобретение относится к способу получения новых биологических активных соединенйи — К-ацильных производных пептидогликанового мономера или их фармацевтически применяемых солей, которые могут найти применение в биологии и медицине.

Известен мономер пептидогликана (PGM), обладающий иммуномодулирующей и актиметастатической активностью PGM— нетоксичное и апирогенное соединение, хо,„, . Ж„„1779258 А3

fsi)s С 07 К 9/00//А 61 К 37/02 дильных производных пептидогликанового мономера формулы I

СН,ОН CHy CHy

0 о „са-иксиссинснсом Ю ОО

О

Cg снi

H м ссн3 I 1к сн . сн> снсв нснсонснсОсц )

- Па .,, RHhel4 с г" где R — С2 — С1в ацил неразаветвленной кислоты, С5:разветсленной кислоты, С1в-алкенилкарбоновой кислоты, С7 ароматической карбоновой кислоты. Реагент 1: соединение I, где R — Н, реагент 2: ROH.

Условия реакции: основание, продукты вы-! ! деляют в свободном виде или в виде соли. 2,, табл.

1 рашо растворимо в воде, но не растворимо в органических растворителях. Благодаря высоко гидрофильной и липофобной природе оно не способно проникать через липофильные мембраны в организме. Степень гидрофильности и липофильности таких соединений может значительно влиять на их активность, Цель изобретения — способ получения новых производных пептидогликанового маномера, обладающих более высокой им° 3

1779258 подходящей для разделения продуктов от исходных реагентов, такой как система растворителя н-пропанол-вода 7:3 (объем/объем) (система А), Продукт получают после добавления органического растворителя, в котором он не растворим, такого как этилацетат (ЕтОАс), Его чистят с помощью обычных методов, таких, как хроматография на колонке на различных адсорбентах, например, силикагеле, при элюировании названной выше системой А, или на Сефадексе при элюировании водой.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами, Пример 1, Получение N а-соли N-ацетил-PGM.

В раствор PGM (500 r, 0,495 ммоля) в воде (7 мл) добавляют HGcb!ùåí!-!ûé водный раствор бикарбонатэ натрия (1чаНСОз, 2,75 мл) и раствор охлаждают на ледяной бане при 5 С. В охлажденную смесь добавляют по каплям ангидрид уксусной кислоты (2,75 мл, 29 ммолей) и все перемешивают 24 ч при

20 С. Смесь затем концентрируют с помощью выпаривания при пониженном давлении, давая маслянистый осадок (0,95 r), который растворяют в воде (2,5 мл) и разделяют на колонке, заполненной 150 мл Сефадекс 6-25 тонко-дисперсная, после чего элюируют водой, Продукты, включающие фракции, объединяют и лиофилизируют, Выход 490 Mr (92%)..Т.пл. 186 — 188 С, УФмакс. .(вода) (нм): 202, ИК (см ): 3400 — 3240, 1660, 1550, .1410.

Н ЯМР (Д20) (млн.дол,): 1.90 (с.,ЗН

СНзС01чН-Агр), 1,96 (с., ЗН, СНзСО Н-Clc), 2.03 (с., ЗН, С НзС01" 1Н-Mur). Сокращения:

А2ра1-ДИаМИНОПИМЕтИЛ

Mur-мурамоил

G I c-гл юкозами н ил

П р и м е Р 2. Получение N-стеароилP CM.

B раствор PGM (1.546 мг, 1,53 ммоля) в

ДМФ (26.6 мл) добавляют сукциниимидостеарат (800 мг, 2,09 ммоля) и триэтиламин (TEA) (0,4 мл, 2,18 ммоля), и смесь перемешивают 20 ч при 20 — 25 С. Получают желатинообразную суспензию, в которую добавляют по каплям при перемешивании

EtOAc (180 мл), и перемешивание продолжают еще .в течение 5 ч, Осадок отделяют с помощью фильтрования и сушат, Выход 2 г.

Продукт очищают с помощью хроматографии на колонке на силиКагеле (26 r) и при элюировании системой растворителя А.

Фракции, включающие продукт, объединя.. ют и концентрируют с помощью выпаривания растворителя при пониженном давлении, Выход 1.44 r (57%), Т.пл. 217—

СН2ОН СН OH

О

О

HO

ХНОСС НОССН

Н, СН,СНСОХНСНСОХНСНСОХН, сн, СЙ2 СН3 CH3

1 1

С0-.NHÑHÈÂHÑHÑÎNHÑÍÑOÎH

СН2 сн

1 сн, Н НХ-CH-CONH

2 вводят во взаимодействие с ангидридом или сложным эфиром кислоты формулы III 50

R -ОН, где значения R указаны выше. Процесс ведут в присутствии основания и целевой.продаукт выделяют в свободном виде или в виде его фармацевтически приемлемых со- 55 лей, За ходом реакции следят с помощью тонко-слойнои хроматографии (ТСХ) нэ матрице из силикагнеля в качестве адсорбента, и в системе растворителя, которая является

45 мунологической активностью, малотоксичных с более высокой степенью липофильности.

Поставленная цель достигается описываемым способом получения N-ацильных 5 производных пептидогликанового мономера общей формулы I

О

СН2ОН СН PH

О

НО

Он О О ОН 10

NH0eCH

3 Нз

СНР СОХНСНСОХНСНСО 1Н

2. сн2 1.5

СН, СН, .

1 . C0-ХНСНСОХНСНСОХНСНСООН

СН

1Н7.

СН

RHH-СН-СОХИ

2 . где R — ацидильная гРУппа;

C2 — C18 — алкилкэрбоновой кислоты с прямой цепью; 25

С5 — ащ<илкарбоновой кислоты с разветвленной цепью, C18 — алкенилкарбоновой кислоты, C7 — ароматической карбоновой кислоты или их фармацевтически приемлемь1х 30 солей, заключающимся в том, что пептидолгликановый маномер формулы II

1779258 зоат (400 мг, 1,825 ммоля) и триэтиламин (ТЕА) (0,35 мл), и смесь перемешивают 24 ч при 25 С. Добавляют по каплям этилацетат (160 мл) и полученную суспензию выдерживают при перемешивании 5 ч. Осадок отделяют фильтрованием, промывают этилацетатом (2 х 10 мл) и сушат. Выход 1,45

r. Продукт чистят с помощью хроматографии на колонке на силикагеле при элюировании системой растворителя А. Фракции, включающие продукт, объединяют и концентрируют с помощью выпаривания .растворителя при пониженном давлении. Выход 1,04 г (69,1 ) Т,пл. 173 — 175ОС УФ„а1,,(вода) (нм): 203, 224 (плечо); ИКк (см )

3260, 1680, 1515.

220 С, УФ кс, (вода) (нм); 204, ИК . (см );

3280, 2910, 2350, 1635, 1530.

Пример 3, Получение N-пивалоилPGM, В раствор PGM (500 мг, 0,495 ммоля) в 5

ДМФ (10 мл) добавлялся сукцинимидо-пивалат (137 мг, 0,688 ммоля) и триэтиламин (ТЕА) (0,13 мл, 0,7 ммоля), и смесь перемешивают в течение 24 ч при 25 С. В прозрачный раствор добавляют по каплям EtOAc(50 10 мл) и получающийся осадок хранят при перемешивании в течение 2 ч и отфильтровывают. Осадок промывают этилацетатом (2 х

5 мл) и сушат. Выход: 550 мг. Продукт очищают с помощью колонной хроматографии 15 на силикагеле и при элюировании системой растворителя А. Фракции, включающие продукт, объединяют и концентрируют с помощью выпаривания растворителя при пониженном давлении. Выход 270 мг (49,8,). 20 . Т.пл, 202 — 204 С, УФма (вода) (нм): 201;

ИК (см ): 3400, 3300, 3080, 3050, 2980, 1650, 1540, Пример 4. Получение N-оленоил-PGM.

В раствор PGM (500 мг, 0,495 ммоля) в 25

ДМФ (9 мл) добавляют сукцинимидо-олеат (258 мл, 0,679 ммоля) и триэтиламин (ТЕА) (0,13 мл, 0,7 ммоля), и смесь перемешивают в течение 24 ч при 25 С. Добавляют по каплям этилацетат (50 мл), и получающийся оса- 30 док хранят при перемешивании в течение 3 ч. Осадок отделяют фильтрованием и сушат.

Выход 680 мг. Осадок чистят с помощью колонной хроматографии на силикагеле, элюирования системой растворителей А. 35

Фракции, включающие продукт, объединяют и концентрируют с помощью выпаривания растворителя при пониженном давлении, Выход 0,345 г (54,6,). Т.пл. 204—

206 С, УФцдк, (вода) (нм): 198; ИК " (см ): 40

3300, 2950, 2875, 1640, 1555.

Пример 5. Получение N-бензоил-PGM.

В раствор PGM (1,346 мг, 1,33 ммоля) в

ДМ Ф (23,3 мл) добавляют сукцинимидо-бенПример ы 6 — 9. Аналогичным образом, как описано в. примерах 2 — 5, получают следующие PGM производные: каприлоильное, лауроильное и пальмитоильное. Основные физические характеристики указанных производных представлены в табл.1.

Пример 10. Получение N-стеароилPGM.

В раствор стеариновой кислоты (284,5 мг, 1 ммоль) в смеси растворителей этилацетат-тетрагидрофуран (1.1, объем/объем, 25 мл) добавляют N-гидрокси-бензотиазол (X0Bt) (162;2 мг, 1,2 ммоля) и ДСС (247 мг, 1,2 ммоля), и смесь перемешивают 16 ч при

20 — 25 С. Полученный осадок отделяют с помощью фильтрования и промывают на фильтре этилацетатом (2 х 3 мл). Маточную жидкость и экстракты объединяют и выпаривают досуха при пониженном давлении.

Ночищенный продукт (470 мл) чистят с помощью хроматографии на колонке на силикагеле (5 г) с элюированием системой растворителя хлороформ-метанол (100: 1, объем/объем). Получают 350 мл очищенного

N-бензтриазол-стеарата, который растворяют в ДМФ (20 мл), добавляют PGM (511 мг, 0,499 ммоля) и триэтиламин (ТЕА) (0,13 мл), и смесь перемешивают 16 ч при 20 — 25 С.

Получают желатинообразный осадок, к которому добавляют этилацетат (88 мл), и перемешивание продолжают в течение дополнительного часа. Осадок отделяют фильтрованием, повторно суспендируют в этилацетате (45 мл), перемешивают 1 ч и еще раз отфильтровывают и сушат. Выход

621 мг. Продукты чистят с помощью хроматографии на колонке на силикагеле (8 r) при элюировании системой растворителя А.

Фракции, содержащие продукт, объединяют, растворитель выпаривают при пониженном давлени, и продукт сушат. Выход 542.5 мг (85%), Продукт был индентичен продукту примера 2, Пример 11. Получение натриевой соли

N-стеа роил-P G M, N-стеароил-PGM Примера 2 (1.276.5 мг, 1 ммоль) добавляют к воде (20 мл), где растворено эквимолярное количество гидроокиси натрия, Чистый раствор перемешивают в течение 1 ч и лиофилизуют. Выход

1,281 мг.

Пример 12. Получение натриевой соли

N-стев роил-PG M.

Согласно процессу примера 2 неочищенный продукт, полученный после осаждения с помощью добавления зтилацетата, суспендируют в воде, нейтрализуют добавлением гидроокиси натрия до рН 7, после чего прозрачный раствор выливают в колонку, заполненную Sephadex G-25 fine, после

1779258, чего осуществляют элюирование водой, Фракции, включающие индентичный продукт, как в примере !1, обьединяют и лиофил изи руют.

Аналогичным образом, как описано в примерах 11 и 12, получают дополнительные фармацевтически приемлемые соли, Биологическая активность N-ацилпроизводных PGM, Эффект N-ацилпроизводных PGM был исследован на иммунологическую активность. Применялись два иммунологических метода. Один относится к .гуморальной, а другой к клеточной иммунной реактивности.

Гуморальная. имунная реактивность была выражена модификацией технологически клеткообразуемых плашек Легйе и др, (2), Замедленный тип гипсрчувствительно.сти использовался как метод выражения клеточного иммунного ответа (2), Для эксперимента использовались мышь-самец, линии СВА/I, 6 — 8 недельного возраста. В каждую экспериментальную группу включалось 5 — 8 мышей.

Отрицательной контрольной группе вводили обычный соляной раствор.

ПоложительHàÿ контрольная группа получает МДР. Все активные вещества дают вэквимолярных концентрациях,,обеспечивающих 100 мг МДР на мышь. Результаты выражают как абсолютное число PFC на мышь для гуморальной и.отек задней лапы в мм х 0,1 для клеточной имуннореактивнасти, Для статического анализа используют

t-тест Student, потому, что незначительные отклонения от нормального распределения были найдены тестом Смирнова-Холмогорова. Уровень Р < 0,05 рассматривался значительным. Значимость различий оценивалась с помощью двойного испытания при уровне приемлемости, равном или менее 5%. Суммированные результаты действий индивидуальных И-ацильных производных на параметры иммунной ответной реакции приведены в табл,2 и на чертеже.

Статически значимое увеличение веса селезенки было обнаружено после применение натриевой соли М-стеароил-PGM u натриевой соли N-олеоил-PGM (13% и 21% . соответственно по сравнению с контрольными значениями). Относительное увеличение веса селезенки было также найдено после использования Na-соли N-бензоилPGM, Na-соли N-лауроил-PGM u Na-соли Nпивалоил-PGM различия по отношению к контрольным величинам не значительно ,увеличивались, хотя имела место отчетливо выраженная тенденция улучшенной актив ности указанных производных. Изменения числа лимфоцитов селезенки (абсолютное число в 1 мл) отличались для каждого производного. В группе мышей, которые получали

Na-соли N-лауроил-PGM; наблюдалось статистически значимое уменьшение в 20% по сравнению с контрольными величинами. У мышей, которым давали Йа-соль G-каприлоил-PGM, имело место статистически значимое увеличение числа лимфоцитов селезенки (19%). Уменшение 4 — 6% числа лимфоцитов селезенки было обнаружено у

10 мышей после назначения им пивалоильных и ацетильных производных, тогда какувеличение 3 — 9 было найдено у мышей, кото15 рым давали олеоильное,.каприноильное и пальмитоильное производное PGM. Хотя имела место явно определенная тенденция в достигнугых изменениях, последние не представляли статическую значимость, Никакого эффекта нг число лимфоцитов селезенки не было со стороны Na-солей . стеароильных и бензоильных производных20

PGM, Практически все проверенные вещества обнаружили увеличение PFC,. которое варьировало в пределах 10 — 66% по сравнению с контрольными величинами..Статистически значимая разница, однако, была обнаружена только в случае Na-солей Nбензоил, N-лауроил и N-папьмитойл-производных PGM. Все использованные вещества усиливали активность PFC, о чем свидетельствовали данные по отношению к числу лимфоцитов селезенки, л которые

30 варьировали в пределах 9 — 75% по сравнению с величинами, обнаруженными в контрольной группе мышей. Статистически значимое различие было найдено для лауроильного производного PGM. Ясно выраженная усиливающаяся тенденция была обнаружена в случае бензоильного и ацетильного производных PGM, когда различия

40 по сравнению с контрольными значениями практически достигали статистически значимого уровня (0,5 < р < 0,1).

На основании полученных результатов можно сделать вывод, что все проверенные

N-ацил ьн ые производные пептидогликанового мономера проявляют определенную иммуностимулирующую активность, и тем получающихся различий в числе лимфоцитов и увеличении веса селезенки могла бы заключаться в различных механизмах активности PGM и его заявленных К-ацильных производных в отношении клеточной имунной системы. Другой возможной причиной мог бы быть тот факт, что они сходны по механизму активности, и все же отличаются

50 не менее индивидуальные производные отличаются по их эффективности. Одна из возможных интерпретаций разнообразия

1779258

СН20Н

0 0

OH 0

НО н ссн, Hg

СН CHCONHCHCONHCHCONH2

NHaCC

Формула изобретения

Таблица 1

Основные физические характеристики N-каприлоил-, N-каприноил, N-лауроил и

N-пальмитоил-производных PGM по их внутренней (свойственный им) активности, Действие на гуморапьный иммунитет очевидно на основании измерений активности PFC и отличается до некоторой степени от действия на число лимфицитов селезенки. Значительное влияние на общую активность PFC было обнаружено в случае бензоильного, лауроильного и пальмитоильного производных PGM, что существенно не изменяет и не уменьшает число лимфицитов в 1 мг ткани селезенки.

Структурные модификации молекулы

PGM привели в результате к новой и неочевидной биологической активности описываемых N-ацильных произвольных PGM. продемонстрированной двумя различными путями: значительное влияние на клеточную иммунную ответвую реакцию, характерное для лауроильного и каприлоильного производного PGM: с другой стороны, бензоильное, лауроильное и пальмитоильное производные PGM более значительно вовлечены были в гуморэльный иммунитет.

Полученные результаты продемонстировали превосходящую активность соединений по изобретению вследствие их действия на клеточный и гуморальный иммунитет; кроме того, они показали лучшую активность по сравнению с исходными PGM, когда оно назначалось в той же концентрации. При этом соединения по изобретению мало токсичны (от 1 — 5 г/кг) и обладает более высокой липоф ил ь ность ю.

Способ получения N-ацильных производных пептидогликанового мономера формулы сн1

СН2 сн, ! 1

CO NHCHCONHCHCONHCHCOaH

СН2

1 сн, I

СН2

aHN-СН-CONH где R — ацильная групппа С2 С18 алкилкар

15 боновой кислоты с прямой цепью;

С5-алкилкарбоновой кислоты с разветвленной цепью, С18-алкиенилкарбоновой кислоты;

С7 — ароматической карбоновой кисло20 ты,. или их фармацевтически приемлемых солей, отличающийся тем, что, пептидогликановый мономер формулы

cn,он сн2он

1 о о

on p o an но

woccn Nnoccn, Р з

СН2СИСОНН- СНСОНН— СН-СОК 2

30 Сн

l г

СН2 СНЗ СН3

co Nn-cncoNncHcoNHcncoon .СН2

Н2С

СК2 н-ны-сн-cow .2 вводят во взаимодействие с ангидридом или сложным эфиром кислоты формулы R-ОН, где значения R указаны выше, процесс ведут в присутствии основания и целевой про40 дукт выделяют в свободном виде или в виде его фармацевтически приемлемых солей.. 1779258

Таблица 2

Иммунологические эффекты производных N-ацил PGM

В клеточный имм нитет

А мо альный имм нитет PFC изменений

% изменений

+.1 Sd

1 Контроль

2 MDP

3 PGM

4 Acetyl-PGM

5 Benzoyl-PGM

6 Caprloyl-PGM

7 Саргlonyl-PGM

8 Lauroyl-PGM

9 Oleoyl-PGM

10 Palmltoyl-PG M

11 Pivaloyl-PGM

12 Stearo 1-PGM

И- ОЦил-праиз3оддые

Составитель В.Волкова

Техред M.Moðãåíòàë Корректор Н.Милюкова

Редактор З,Ходакова

Заказ 4204 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул,Гагарина, 101

ЮО

УИ

2Я

Од ф М

Ф

Ъ Хд

0 ь

-ХО

66,6

84,0, 85,8

95,7

88,5

81,6

125,4

97,1

95,8, 76.4

93,4

33,86

46,37

33,17

28,45

75,95

79,80

68,45

41,86

75,30

24,94

37,55

126

113

138 159

147

162

113

166

126

0,05

Ns

0,05

Ns

Ns

0.02

Ns

0,05

Ns

0,09

0,20

0,12

0,09

0,18

0,19

0,29

0,21

0,25

0,19

0,06

0,07

0.,0,31

0,069

0,039

0,06

0,103 .

0,101

0,077

0,088

0,078

0,121

0,044

0,100

222

133

211

322

233

277

211 — 34 — 23

0,01

Ns

Ns

Ns

0,05 .

0,01

0,01

0,01

Ns

Ns