Способ конструирования рекомбинантной плазмидной днк pps 20, кодирующей изопенициллин-n-синтетазу, способ получения штамма сернаlоsроriuм асrемоniuм, обладающего активностью изопенициллин-n-синтетазы

 

Изобретение относится к химической инженерии, в частности к получению последовательности ДНК, которая кодирует активность изопенициллин-N-синтетазу Конструируют рекомЬинантную плазмидную ДНК pPS20 путем лигирования Hind III фрагмента плазмиды размером 2,5 кв и Hind III фрагмента плазмиды 335. Полученной рекомбинантной ДНК трансформируют штамм Cephalosporlum acremonlum ATCC 11550 с последующим культивированием, выделением целевого продукта. 1 табл

(19) (11) СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК.3 Г (51) 5- С 12 N 15/52, 15/80

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР

I (ГОСПАТЕНТ СССР) 1 . ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕ НТУ (21) 4027382/13 (22) 21.04,86 (46) 07.12.92. Бюл, 1ч . 45 (31) 725870 (32) 22.04.85 (33) US (71) Эли Лилли Энд Компани (US) (72) Томас Доминик Инголиа, Стефен Виатт

Квинер, Съюллен Мэри Сэмсон и Пол Лютер

Скэтруд (US) (54) СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК pPS 20, КОДИРУЮЩЕЙ ИЗОП ЕНИЦИЛЛИН-NСИНТЕТАЗУ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ

ШТАММА CEPHALOSPORIUM

Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к получению последовательности ДНК, которая кодирует активность изопенициллин-N-синтетазы.

Синтетаза изопенициллина-N является катализатором реакции, в которой из д- (L-ааминоадипил)-L- цистеинил-Д-валина образуется изопенициллин N. Эта реакция является основной стадией в биосинтезе та. ких важных антибиотиков, как пенициллины иэ Penicilllum chrysogenum, Cephalosporlum

acremonlum u Streptomyces clavuligerus, цефалоспоритов из С. acremonium и 7-метоксицефалоспоринов из S, clavuligerus.

Последовательность ДН К, кодирующую активность изопенициллин-M- синтетазы

/ выделяют из Cephaiosporium acremonlum, используют для конструирования. векторов экспрессии, которые обеспечивают экспрессию данного вещества.

Клеточные экстракты из Е. соИ, транс- формированные векторами экспрессии, де-

ACREMONIUM, ОБЛАДАЮЩЕГО АКТИВНОСТЬЮ ИЗОПЕНИЦИЛЛИН-N-СИНТЕТАЗЫ (57) Изобретение относится к химической инженерии, в частности к получению последовательности ДНК, которая кодирует активность изопенициллин-N- синтетазу, Конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pPS20 путем лигирования Hind Ill фрагмента plT221 плазмиды размером 2,5 кв и Hind Ш фрагмента плазмиды plT 335, Полученной рекомбинантной ДНК трансформируют штамм Cephalosporlum

acremonIum АТСС 11550 с последующим культивированием, выделением целевого продукта. 1 табл, монстрируют активность изопенициллин-Nсинтетазы без предварительной обработки.

В результате трансформации

Cephalosporlum векторами экспрессии in

vivo получают более высокие уровни изопенициллин-N- синтетазы в трансформантах.

ДНК, кодирующую изопенициллин-Nсинтетазу, выделяют из Cephalosporlum

acremonlum, Данную ДНК используют для конструирования векторов, которые обеспечивают экспрессию активности изопенициллин-N-синтетазы в широком круге клеток реципиентов. Все организмы, которые продуцируют генициллины и цефалсспорины, используют общие предшественники д (L/à -аминоадипил) - L

- цистеинил-Д-валин и изопенициллин.

Последовательности ДНК получают из геномной ДН К Cephalosporlum acremonlum, они являются гомологичными с нуклеотидной последовательностью соединений ДН К, кодирующих активность синтетазы изопе1780542 экспрессией гетерологическин генов в

С.acremonium.

10 10 : 20 30 40

5 -АТС ССТ ТСС СТТ ССА GTT CCA GTG GCC AAC GTC ССС ССЛ АТС GAT GTC

ИЕТ GLY SER VAL PRO VAL PRO ЧАЬ АЬЛ ASN VAL PRO АРС ILE ASP VAL

5 10 15

15 50 60 70 80. 90

TCG CCC CTA ТТС GGC GAT GAC AAG GAG AAG AAG СТС GAG СТА GCT CGC

SER PRO LEU Р)(Е GLY ASP Л$Р LYS GLU LYS LYS LEU GLU VAL ALA ARG

20 25 30

100 110 120 130 140

GCC АТС GAC GCC GCA TCG CGC САС ACA GGC ТТС ТТТ TAC GCG СТС AAC

ЛЬА П.E ASP ALA AI.À SER ARG Л$Р T((R GLY РНЕ РНЕ TYR АЬА VAI. А$К

35 40 . 45

150 160 170 180 190

CAC GGT GTC GAC CTG CCG TGG СТС TCG CGC GAG АСС ЛЛС ААЛ ТТС CAC (П$ GLY УМ. ASP LEU PRO TRP LEU SER ЛЕС FLU ТНВ ASN LYS РНЕ HIS

50 55 60

200 . 210 220 230 240

ЛТС ЛГС ЛТС ЛСС СЛС СЛС СЛС ЛАС TGG CAG CTC GCC ATC CGG GCC TAC

KT $ЕВ ILE ТЙ Л$Р GLU GLU LYS TRP GLN ЬEV Л?.А ILE АВС AI.Ë TYR

65 70 75 80

250 260 270 280

AAC ЛЛС GAG СЛС GAG ТСС СЛС ЛТС CGG GCG GGC TAC ТЛС CTG CCG АТС

ASN ЬУБ СЬЦ HIS GI.U SER GLN ILE ARG ЛЬА GLY TYB TYR LEU РВО II.E

85 90 95

290 300 310 320 330

CCG Г>СС ЛЛС ЛЛС (СС СТС СЛЛ ТСС ТТС TGC ТЛС СТС РЯС ССС ТСС ТТС

РВО С(Х 1Л$ LYS ЛЬЛ VAI. GI,U $ЕВ PHF. СЪ8 TYR ЬЕ(ASN РВ0 SER РНЕ

100 105 110

340 350 360 370 380 . AGC CCA GAC CAC ССС ССЛ ЛТС AAG GAG CCC ACC ССТ ATG CAC GAG ГТС

SER РВО ASI )(1$ PRO ARG II.Е ЬУ$ GLU РВО flfR PRO ИЕТ HIS СЬ(3 VAI.

115 120 125 нициллина N в Streptomyces clavuligerus, Penlcilllum chrysogenum и других организмах, продуцирующих синтетазу изопенициллина й.

Соединения ДНК, кодирующие изопенициллин синтетазу, можно использовать для скринирования геномных библиотек организмов, которые продуцируют изопенициллин-N-синтетазу.

ДНК, кодирующие изопенициллин-Nсинтетазу, получают из геномной ДН К

Cephalosporlum acremonium и выделяют вместе с последовательностью, активирующей транскрипцию и трансляцию, которая контролирует экспоессию геномной

Д Н К, коди рую щей С.acre mon ium изопенициллин-N-синтетазу. Последовательность

ДНК, активирующую транскрипцию и трансляцию, используют для управления

Данная последовательность содержит

5 регуляторные сигналы IPS гена. которые расположены у 3 конца кодирующей нити

1 кодирующего участка IPS гена. Эти 3 регуляторные последовательности кодируют сигналы конца транскрипции и полиадени10 лирования мРНК и процессинга этого (Р$гена. «Наличие этих сигналов в соответствующем положении рекомбинантной ДНК повышает экспрессию целевого продукта, кодируемого вектором в Cephalosporium

15 acremonlum, Ниже приведена последовательность

ДНК. кодирующая активность синтетазы изопенициллина N и соответствующая последовательность аминокислот

1780542

15

490 500 510 520

GGC ТАС GCT СТС ССС СТА GGT CGC САС GAG GAC ТТС ТТС АСС CGC САС . GLY TYR АЬА 1.Е11 АЕА LEU GLY ARG ASP GLU ASP РНЕ РНЕ THR.ARG HIS

165 170 175

530 540 550 . 560 . 570

ТСС CGC CGT GAC ACG ACG СТС TCG TCG GTC GTG СТС АТС CGT ТАС CCG, SER ARG ARG ASP THR THR LEU SER SER VAL VAL LEU ILE ARG TYR PRO 1 8.0 185 190

- 580 . 590 600 . 610

ТАС СТС GAC CCG ТАС CCG GAG CCG GCC ATC MG ACG GCC GAC

TYR LEU ASP PRO TYR PRO GLU PRO ALA П.Е LYS THR ALA ASP

195 200 205

GAC GGC

ASP GLY

670

ACG GTG

THR VAL. 630 640. 650 660

АСС AAG СТС AGC ТТС GAG TGG CAC GAG GAC GTG ТСС СТС ATC

THR LYS LEU SER PHE GLU TRP HIS GLU .ASP VAL SER LEU П.Е

210 . 215 . .220

680 690 700 710, TTG ТАС CAG TCC СЛС GTG CAG ААТ CTG CAG СТС AAG ACC CCG

LEU TYR GLN SER ASP VAL GLN ASN LEU GLN VAL LYS THR PRO

225 . . 230 235

CAG GGC

GLN GLY

240

730 " 740 750 760

TGG CAG GAC АТС CAG ССТ GAC GAC ACG GGC ТТС СТС ATC ААС TGC GGC

TRP GLN АЯР LE GLN AIA ASP ASP THR GLY PHE LEU ILE ASN CYS GLY

245 :. . 250 ., 255

770 " 780 790 800 810

AGC ТАС АТС GCC CAT ATC ACC САС GAC ТАС ТАС CCG, 4CC CCG ATC САС

SER TYR ИЕТ ALA HIS ILE T11R ASP ASP TYR ТУК PRO ALA ÐRO П.Е HIS

260 265 270

820 830 .- . 840 850 . 860

CGC GTC ААЛ TGG GTC AhC GAG GAG CGC CAG ТСЛ СТС ССС ТТС ТТС GTC

ARG VAL LYS TRP VAL ASN GLU GLU ARG GLN SER ЕЕц PRO РНЕ Р1Я VAL

275 . 280 285

870 880 890 900 910

АЛС CTG GGC TGG GAG GAC АСС ATC САС CCG TGG GAC ССС GCG АСС GCC

ASN LEU GLY TRP GLU ASP ТНВ ILE GLN PRO TRP ASP PRO ALA THR ALA

290 295 . 300

390 400 410 . 420 430

ААС GTC TGG CCG GAC САС GCG AAG САС CCG GGG ТТС CGG ССС ТТС GCC

ASN VAL TRP PRO ASP GLU ALA LYS HIS PRO GLY PHE ARG ALA PHE ALA

° 130 135 140

l 440 450 460 470 480

GAG AAG ТАС ТАС ТСС GAC GTC TTC GGC СТС ТСС ТСС GCG GTG CTG CGC

GLU LYS TYR TYR TRP ASP VAL РИЕ GLY LEU SER SER ALA VAL LEU ARG

145 150 155, 160

1780542

920 930 940 950 960

AAG СЛТ GGG GCC ААС GAT GCC GCC AAG GAC AAG CCG GCC АТС ТСС TAC

LYS ASP GLY ALA LYS ASP ALA ALA LYS ASP LYS PRO ALA ILE SER TYR

305 310 315 320

970 980 990 1000 .

GGA GAG TAT CTG CAG GGG GGA CTG CGG GGC TTG ATC AAC AAG ААТ GGT

GLY GLU TYR 1.FU GLN GLY GLY LEU ARG GLY LEU ILE ASN LYS ASN GLY

325 330 335

20

CAG АСС TAA"3

GLN T1fR

В е кто р, коди рующий иэопе ни циллинN-синтетазу, модифицируют так. чтобы исключить фрагменты ДНК Cephalosporlum

acremonium, имеющиеся в векторе и кодирующие фермент. Полученный вектор обозначают как plT335, его трансформируют в клетки-реципиенты E.coll К 12JA221 и Е.coll

K12JA221/pIT335. Трансформанты депонируют в коллекции Narthern Regional Research Laboratories,Ðåîãlä, Illlnolc под регистрационным номером М RRL В-15960.

Плазмиду plT335 выделяют из E.coll

K12JA221. Плазмиду plT335 используют в качестве исходного материала для конструирования плаэмиды, обозначенной р! Т337, которая обеспечивает экспрессию высокого уровня изопенициллин-N-синтетазы. Плазмиду plT337 конструируют, лигируя 1,5 кв

Ncol-BamHI: рестрикционный фрагмент с

8,7кв N col — Ncol и 1,6кв N col-BamHI рестрикционными фрагментами плазмиды

pCZ106.

Плазмида pCZ106 при низких температурах около 25 С, содержащая репликон неорганического размножения, имеет число копий около 10-15 копий на клетку хозяина

Е.соИ. При повышении температуры до около 37 число копий возрастает до около 1000 . копий на клетку хозяина Е,coll. Клетки хозяева Е.coli К12 PV308/pCZ106 депонируют в

Natthern Regional Research Laboratories, Peorid, llllnolc под регистрационным номером N- RRLB-15959.

1,5 кв NCO 1-BamHI фрагмент плазмиды plT335 содержит полную последовательность, кодирующую изопенициллин-йсинтетаэу, и сайт рестрикции Ncol, который представляет собой, 5 — CCATGG — 3

3 — 66ТАСС вЂ” 5 и содержит последовательность

5 — АТС вЂ” 3

3 — TAC - S. которая кодирует аминотерминальный метиониловый остаток иэопени25 циллин-N-синтетазы, При температурах около 37 C E.coll K12

РЧ308 / NRR L  — 15624) клетки, содержащие плаэмиду plT337, экспрессируют изопенициллин-N-синтетазу с высоким

30 уровнем, достигая 9 от полного числа клеток протеина. Неочищенные клеточные экстракты из этих Е. coll К12 PV308/plT337 тоансформантов способны катализировать превращение д /1 -c -аминоадипил — /1.-ци3S стеинил-Д-валина в изопенициллин N, тогда как клеточные экстракты из нетрансформированных Е.coll К12 PV308 клеток не могут катализировать это превращение, Трансформанты Е.coli р!Т337 экспрес- .

40 сируют изопенициллин-N-сийтетазу с высокими уровнями. достигающими 9 от полного клеточного протеина. Благодаря тому, что культивирование Е.coll менее сложно, чем культивирование природных

45 организмов, которые продуцируют данное вещество Е.coll /р!Т337, трансформанты можно испольэовать для получения изопенициллин-N-синтетазы более эффективно и экономично.

50 Векторы, повышающие внутриклеточную активность изопенициллин-N-синтетазы в клетке реципиенте, трансформированной этой плаэмидой, содержат следующие элементы:

55 1) фрагмент ДНК, кодирующий активность изопенициллин-N-синтетазы;

2) последовательность, активирующую транскрипцию и трансляцию, которая функционирует не только в клетке реципиенте и расположена в правигьной ориентации и

1780542

10 положении, чтобы управлять экспрессией N ñèíòåòàçó Cephalosporium acremonium.

ДНК, кодирующей фермент; Плазмида pPS20 обязательно должна со3) последовательности, обеспечиваю- держать последовательность, актирирующие репликацию, интеграцию, обеспечива- щую транскрипцию и трансляцию данного ют сохранение вектора в клетке хозяине.. 5 фермента.

Естественно, вышеописанный вектор мо- Плазмида pPS20 содержит последоважет также содержать ген, придающий ус- тельность активации транскрипции и транстойчивость к антибиотику или некоторые ляции Cephalosporium acremonlum, которая другие элементы, которые обеспечивают управляет экспрессией ДНК, кодирующей средство отбора клеток реципиентов. 10 активность изопенициллин-N-синтетазы

Плазмида pPS20является примером ти- при конструировании плазмиды pPS20, Она па вектора, сконструированйого для повы- не содержит ни делеций, ни вставок, котошения внутриклеточной. концентрации рые влияли бы на последовательность, актиизопенициллин-N-синтетазы в клетке рецй- вирующую транскип"„""ию и т"а и пиенте и о и г ф, продуцирующегоф-лактамовый ан- 15 ДНК, расположенноис 5 конца кодирующей тибиотик. Плазмиду pPS20 конструируют нити ДНК. Плазмиду pPS20 используют для путем включения 2,7 кв Hind lli рестрик- повышения способности продуцирования ционного фрагмента плазмиды plT221 в антибиотика в клетках Cephalosporium сайт рестрикции Hind ili - 2,7 кв kind ill acremonlum. рестрикционный фрагмент плазмиды 20

plT221 содержит последовательность акти- . Плазмида pPS20 содержит также ген, вирующего транскрипцию и трансляцию re- придающий устойчивость к гидромицину, . на фосфоглицераткиназы (PGK) дрожжей который функционирует в С,acremonlum, и

Saccharomyces cerevisIae, лигированного в позволяетпроизводитьотбор С.acremonlum правильном положении и ориентации для 25 /рР$20 трансформантов. управления экспрессией гена, придающего Плазмида рР$20 трансфо трансформирует сопротивляемость к гидромицину. Так как С.acremonlum через хромосомную интегра2,7 кв Hind- lll рестрикционный фрагмент цию, плазмиды plT 221 может быть включен в Плазмиды pPS20. р(Т335 содержат noHind-1И-расщепленную плазмиду р!Т335 в 30 следовательность, активирующую трансля любой издвух ориентаций, в результате ли- цию и транскрипцию Cephalosporlun, PS20,1. гирования получают плазмиду с pPS20 acremonium. Так последовательнос е ть, акти

P вирующая транскрипцию и трансляцию, 2.7 кВ Hind И1-рестрикционный фраг- С.acremonium, расположена на плазмида мент плазмиды plT221 содержит ген, прида- 35 pIT335 и pPS20 и может регулировать экс.ющий устойчивость к гидромицину, прессиюширокогокругаДНКпоследовательсвязанный с последовательностью, активи- ностей. Активирующая последовательность рующей транскрипцию и трансляцию PGK закодирована на 500 вр Sàl 1-Мсоl редрожжей в правильном положении и ориен- стрикционном фрагменте расположенно т женном ации для экспрессии активности, придаю- 40 непосредственно до и рядом с ДНК, кодирущейустойчивостьк гидромицину(НмР). ющей активность фермента на плазмиде

Плазмида pPS20 содержит ген PGK- plT335 и pPS20. Фрагмент, который вклюнМР и трансформанты Cephalosporlum чает вышеуказанный 500 вр Sal 1-N col

acremonlum (pPS20 отбирают по устойчиво- рестрикционный фрагмент, содержит пости к гидромицину). Плаэмида pPS20 содер- 45 следовательность, an ивирующую трансжит также ДН К, кодирующую крипцию и трансляцию С.acremonlum, изопенициллин-N-сйнтетазу. Частичная ДН К последовательность, аклазмида pPS20 содержит почти 3 кв тивирующая транскрипцию и трансляцию фрагмент геномной ДНК, который располо- Cephalosporlum acremonlum, закодирована жен до ДНК, кодирующей изопенициллин- 50 на плазмиде plT335, — 380 — п.о

ЬААТАСТТС ААТАТТССТТ СИТА .Тратт

ЯСТТАТСААС ТТАТААЯЯАА CCAQCQAgAA ." К И ГЛУБИ !".

1780542

kjfP_#_f gTCKACAT (TTJCACCf9 ЛС А ААА !

САБАМ - 6

Последовательность, активирующую транскрипцию и трансляцию Cephalosporlum

acremonlurn, можно использовать для экспрессии любой ДНК последовательности, что иллюстрирует плазмида pPS 21. Плазмида рР S21 является производной плазмиды

Р1Т221, которая получена в результате замены последовательности, активирующей транскрипцию и трансляцию PGK, на последовательность, активирующую транскрипцию и трансляцию С.acremonlum настоящего изобретения.

Эту замену осуществляют вначале, удаляя 30 вр Хма! фрагмент из плазмиды рIT221 до образования плазмиды pps19.

Плазмиду pPS19 расщепляют BamHI, обрабатывают фрагментом Кленова полимеразы

1ДНК Е,со!1. В результате расщепления Bam

1 получают 230 вр BamHI рестрикционный фрагмент, содержащий последовательность, активирующую транскрипцию и трансляцию PGK, после обработки Кленова получают двунитевую ДНК вне перекрывания однонитевой BamHI. Затем крупный

7,7 кв BamHI фрагмент плаэмиды pPS19 лигируют с 0,8 кв после обработки фрагментом Кленова Ncol рестрикционного фрагмента плазмиды р!Т335, который содержит последовательность, активирующую транскрипцию и трансляцию

С,acremonlum.

Рестрикционный фрагмент Ncol после обработки фрагментом Кленова может быть включен в одной из двух ориентаций, причем только одна из возможных ориентаций достигает цели — правильного расположения последовательности, активирующей транскрипцию и трансляцию Cephalosporium

acremonfum для управления экспрессией гена, придающего устойчивость к гидромицину. .Плаэмида pPS21A использует последовательность, активирующую транскрипцию и трансляцию IPS гена для экспрессии гена, придающего. устойчивость к гидромицину в

Cephalosporlum acremonium. Промежуточную плазмиду, обозначенную pPS23, используют при конструировании плазмиды

pPS21A. Плазмиду pPS23 конструируют, выделяя 850 вр Ncol рестрикционный фрагмент плазмиды plT335, который содержит активирующую последовательность IPS гена, присоединяя линкер-совместимые с

BamHI u Ncol-однонитевые перекрывания с

850 Вр Ncol-фрагментом и лигируя - 860 вр BamHI рестрикционный фрагмент с

BamHI расщепленной плазмидой р VC8. Это приводит к двум плазмидам. обозначенным

5 pPS23 и pPS23.1. которые отличаются только по ориентации включенного BamHI рестрикционного фрагмента.

Плазмиду pPS23 гидролизуют рестрикционным ферментом BamHI и 860 вр

10 BamH! рестрикционный фрагмент. который содержит последовательность, активирующую транскрипцию и трансляцию IPS, выделяют и лигируют с BamHI обработанной плазмидой pPS19. В результате такого лиги15 рования получают ряд нужных плазмид, включая плазмиду pPS21A . Плазмиду рР$21А получают при лигировании 0,86 кв

BamHI рестрикционного фрагмента плазмиды pPS23 с 7,7 кв BamHI рестрикционным

20 фрагментом плазмиды pPS19, Она содержит последовательность, активирующую транскрипцию и трансляцию IPS гена, расположенного в соответствующей ориентации для чпоавления экспрессией гена, 25 придающего устойчивость к гидромицину.

Линкеры, которые используют при конструировании плазмиды pPS23, обеспечивают сохранение соответствующего считывающего фрагмента в плазмиде pPS21A для экс30 прессии гена устойчивости к гидромицину.

Плазмида pPS22 содержит те же самые последовательности, что и плазмида

pPS21A, но BamHI рестрикционный фрагмент, который содержит последовательно35 сти активации IPS гена, ориентирован в противоположном направлении по отношению к ориентации в плазмиде pPS21A, Плазмида рР$22 не сообщает устойчивости к гидромицину Cephalosporium acremonium

40 при высоких частотах, так что плазмида

pPS22 служит удобным негативным контролем в трансформациях С,acremonlum.

Плазмида рР819 содержит последовательность, активирующую транскрипцию и

45 трансляцию PG K Saccharomyces cerevlsiae в соответствующей ориентации для управления экспрессией гена. придающего устойчивость к гидромицину. Обработка плазмиды рР$19 рестрикционным ферментом BamHI

50 приводит к получению двух фрагментов: один фрагмент 230 вр содержит последовательность активации PGK, а другой фрагмент 7,6 кв содержит большую часть

1780542 последовательности, кодирующей ген. при- Плэзмида, обозначенная pPS 6, облададающий устойчивость к гидромицину.. ет повышенной способностью к интегра

В результате циркуляризации 7,6 кв . в хромосомную ДНК С. acremonium за счет

BamHI рестрикционного фрагмента плаз- присутствия ДНК, кодирующей РНК, миды рР$19 получают плазмиду рР$24, в 5 Плазмида pPS 6 содержит 3,7 кв Хма! которой нет последовательйости, активиру- рестрикционный фрагмент rPHK с генами ющей трайскрипцию и трансляцию для уп- Cephalosporlum acremonium. Присутствие равления эксйрессией гена, придающего этого Хма! фрагмента на плазмиде повышаустойчивость к гидромицину, имеющемуся ет вероятность того, что плазмида интегрина векторе, . 10 руется в С. acremonium гомологичной

Плазмиды pPS25 и pPS25Ë получают рекомбинацией при трансформации плазлигированиемдвух BamHI рестрикционных миды в С,acremonlvm. Плазмиды рР$30 и фрагментов плазмиды рР$19 с 860 pPS30,l конструируют путем включения врВавН! рестрикционным фрагментом 3,7 кв XMal рестрикционного фрагмента плазмиды pPS23. B плазмиде pPS25 обе 15 плэзмилы oPS 6, который содержит часть последовательности активирования PGK и генов rPHK С.acremonium в единственном

iPS находятся в нужной ориентации для уп- Хмэ! сайте плазмиды рР5 21А. I!лазмиды равления экспрессией гена, придающего ус- pPS30 и pPS30.I различаются только ориентойчивость к гидромицину. Плазмида pPS25 тацией Хма! рестрикционного фрагмента. содержит последовательность, активирую- 20 Плазмиды рР531 и pPS31,1 констру юlP конструируют щую S, расположенную непосредственно путем включения 3,7 кв XMal рестрикционперед кодирующей последовательностью ного фрагмента плазмиды рР$6 в единстгена, придающего устойчивость к гидроми- венный XMai сайт плазмиды рР$29, цину, и последовательность, активирующую Плазмидные векторы, использующие

PGK и расположенную непосредственно пе- 25 последовательность активации транскрип-!

Р ред последовательностью, активирующей ции и трансляции гена IPS Cephalospo i

S. Плазмида pPS25 придает устойчивость acremonlum для управления экспрессией гек гидромицину Cephalosporium acremonium.. на, придающего устойчивость к гидромициПлазмида pPS25;1 отличается от плаз- ну, значительно лучше плазмид,-которые миды pPS25 только ориентацией- 0,23 кв 30 используют последовательность, активирBamHl рестрикционного фрагмента, кото- ющую PGK Saccharomyces сегейз!ае для упь, активирурый содержит последовательность, активи- равления экспрессией гена, придающего рующую PGK. В плазмиде pPS25.1 устойчивость к гидромицину в последовательность, активирующая PGK, С.acremonium. Преимущество векторов: (1) расположена не в той ориентации, которая 35 частота трансформации, которую измеряют позволила бы последовательности, эктиви- по числу трансформантов СерЬа!озрог!ив рующей PGK, управлять экспрессией гена, acremonium, устойчивых к гидромицину на придающего устойчивость к гидромицину. микрограмм использованного при трансПлазмиду pPS28 получают при исключе-, формации вектора ДНК, в 50-300 раз выше нии из плэзмиды pPS 21А -1,85 кв Ps< I 40 прииспользовании!РЯ последовательности рестрикционного фрагмента, который со- и активации по сравнению с PGK для упрэвдержит источник репли кации ления экспрессией гена, придающего устойCephalosporium. Плазмиду pPS 29 получают чивость к гидромицину на вектор, f2J время в результате делецйи из плазмиды pPS 21 А регенерации, которое определяют как вреPst I фрагмента для получения плазмиды 45 мя, которое необходимо, чтобы колония стаpPS 28 вместе с 0;49 кв Pst I рестрикцион- ла видимой невооруженным глазом после ным фрагментом, котбрый расположен меж- трансформации, примерно на 50 g, меньше ду Cephalosporlum источником репликации при использовании активирующей последои последовательностью активации IPS гена вательности в противоположность PGK, кона плазмиде рР $21А.. 50 торую используют для управления

-3,45 кв Hind III рестрикционный фраг- экспрессией гена, придающего устойчимент плазмиды pPS 21А включают в Hind lli вость к гидромицину на вектор. сайт плазмиды plT335 до йолучения йлаз- Последовательность, активирующую мид pPS 26 и рРЗ 26Л, которые отличаются,, транскрипцию и трансляцию Cephalosporium только в плане ориентации включенного 55 acremonlum, используютдля экспрессии noHind III рестрикционного фрагмента из следовательностиДНК в С. acremonlum. Поплазмиды pPS21A. Плазмиды pPS26 и следовательность, активирующая

pPS26 Л содержат интактный IPS ген из транскрипциюи трансляцию С.acremonium.

Cephalosporium acremonium и ген, придаю- закодирована в -0,5 кв Sall — NCol рестрикщий устойчивость к гидромицину. ционном фрагменте плазмиды plT335.

17В0542

Итак, осуществлено клонирование интактной функциональной последовательности ДНК Cephalosporium acremonium, которая кодирует не только аминокислотную последовательность синтезазы изопенициллина N, но также последовательность, активирующую транскрипцию и трансляцию изопенициллин-N-синтетазы в

С.acremonium, IPS ген содержит последовательность, расположенную после клонирующего участка и ответственную за сигналы окончания транскрипции мНРК полиаденилирования и процессинга, Обычно последовательности, ответственные за окончание транскрипции, полиаденилирование мРНК и процессинг содержатся в участке - 50 вр после стоп-кодона. -0,5 кв BamHI — Pst I фрагмент, который содержит IPS карбокситерминальную, кодирующую ДНК и его последующие последовательности, также содержит сигналы окончания транскрипции и мРНК полиаденилирования и процессинга

IPS гена, Плазмиду pPS 27 конструируют путем объединения 1,4 кв BamHI — Xho I рестрикционного фрагмента плазмиды plT335 и Sal ! — BamHl плазмиды pVCS (перекрывания

Sal! и Xho! совместимы) до получения плазмиды р!ТЗ36, Плазмиду PIT336 расщепляют рестрикционным ферментом Pstl и рециркуляризуютдля исключения всех последовательностей

ДНК Cephaiosporium из плазмиды за исключением 0,5 кв BamHI — Pst рестрикционного фрагмента, который содержит сигналы окончания транскрипции и мРНК полиаденилирования и процессинга IPS гена до получения плазмиды рР$35.

Затем плазмиду pPS 35 расщепляют рестрикционным ферментом HInd !!! и 2,3 кв

Hind ill рестрикционных фрагментом плазмиды pPS 29, который содержит последовательность, активирующую транскрипцию и трансляцию IPS гена, и ген, придающий устойчивость к гидромицину, включают в Hind

lll- гидролизованную плазмиду pPS 35 в нужной ориентации до получения плазмиды

pPS 27.

Производное плазмиды pPS 27 конструируют, выделяя 2,3 кв Hind Ill и 0,5 кв

Hind III — Bam Hl рестрикционные фрагменты плазмиды pPS27, и объединяют эти фрагменты с 5,9 кв Bg ill — Hind ill фрагментом плазмиды plT 335 до получения плазмиды

pPS 34. Плазмида pPS 34 содержит как ген, придающий устойчивость к гидромицину, так и ген, кодирующий синтетазу изопенициллина N, контролируемый регуляторными элементами IPS гена.

Плазмиду Р!Т 3". 6 используют в качестве исходного материала для конструирования плазмиды, которая интегрируется геном

Cephalosporium acremonium в районе гена иэопенициллин-N- синтетаэы.

Плазмиду pPS 37 используют для трансформации штамма С. acremonlum, в результате получают мутанты этого штамма, дефектные по гену IPS, если плазмида pPS

37 интегрирует в кодирующий участок IPS гена, Плаэмиду pPS 37 конструируют путем клонирования 3,45 кв Hind ill фрагмента плазмиды pPS 21А, который содержит ген, придающий устойчивость к гидромицину, под контролем последовательности IPS гена в плазмиду plT336, обработанную Nru I, Плазмида р!Т336 имеет единственный Nru I сайт, расположенный в участке IPS, Включение 3,45 кв Hind — Itl фрагмента, который имеет тупой конец после обработки ферментом Кленова, в Nru !-гидролизованную плазмиду plT336 приводит в действительности к получению двух плазмид, обозначенных как

pPS 37 и pPS 37.1 которые отличаются только по отношению к ориентации включенного фрагмента. Обе плазмиды — плазмида

pPS 37 и плазмида pPS37.1 пригодны для трансформации С. acremonium и получения устойчивых к гидромицину и с нехваткой IPS трансформантов.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

ll р и м е р 1, Культура Е. соИ К12 J А

221/plT335 и выделение плазмиды pIT335.

А. Культура Е,coll K12JA221/ðIT335, Лиофильную Е.coll К12 JA221/plT335 получают из Northern Regional Research

Laboiatories, Reoria, Hlinois под регистрационным номером NRR L В-15960, Один литр 1=бульона (10 г триптона, 10

r NaCI и 5 г дрожжевого экстракта на литр), содержащий 50 мкг/мл ампициллина, засевают культурой Е.со!! К12 J А221/plT335 и инкубируют в воздушном шейкере при 37"С до достижения оптической плотности при

590 нм (О.Д. ago) 1 единицы поглощения. В это время к культуре добавляют 150 мг хлорамфеникола. Инкубирование продолжают около 16 ч, добавление хлорамфеникола ингибирует синтез протеина, но не подавляет плазмидную репликацию.

В. Выделение плаэмиды р!Т335.

Культуру, полученную в примере IA, центрифугируют в роторе со скоростью 6000 об/мин в течение 5 мин при 4 С. Полученную надосадочную жидкость сливают, а клеточный остаток промывают в 40 мл ТЕ буфера (10 мМ Трис-HCI, рН 7,5 10 MM NaCI и 1, мМ ЕДТА), а затем- снова осаждают.

После повторного сливания надосадочной

1780542 жидкости клеточный остаток замораживают между 0,5 и 1,0 ед. поглощения, Когда эти в бане со смесью сухой лед-этанол, а затем значения для культуры достигаютинтервала оттаивают. Оттаявший клеточный сгусток 0,5 — 1,0 ед, поглощения в оптической плотповторно суспендируют в 10 мл раствора ности, температуру повышают до 37 C и ин25% сахарозы и 50 MM ЕДТА. Затем добав- 5 кубирование продолжают в течение 2-6 ч, ляют и перемешивают 1 мл 5 мгlмл лизо- Репликон неограниченного размножения, цимного раствора, 3 мл 0,25 М ЕДТА, рН 8,07 как было указано ранее, чувствителен к теми 100 мкл 10 мг/мл R ИАзы А, раствор инку- пературе и теряет контроль за числом копий бируют на льду в течение 15 мин, 3 мл лизи- при 37 С. Инкубирования при 37 С в течерующего раствора, полученного при 10 ние2 — 6чдостаточнодлянеконтролируемой смешивании 3 мл 10% Тритон-Х 100, 75 мл, репликации.

0,25 M ЕДТА, рН 8,15 мл 1М Трис-HCI, pH После инкубирования при 37 С в тече8,0 и 7 мл воды, добавляют к клеткам; обра- ние 2 — 6 ч клетки собирают и выделяют плазботанным лизоцимом, перемешивают и миную ДНК pCZ106. Получают около 5 мг полученный раствор инкубируют на льду в 15 плазмидной ДНК pCZ106 и суспендируют в течение еще 15 мин. Лизированные клетки 5 мл ТЕ буфера. замораживают в бане со смесью сухой лед- В. Ncol u BamHI расщепление плазмиэтанол, а затем оттаивают. ды pCZ106 и выделение 8,7 кв Ncol — Ncol u

Клеточные осколки удаляют из раствора 1,6 кв Ncol- BamHI рестрикционных фрагцентрифугированием при 25000 об/мин в 20 ментов плазмиды pCZ106. течение 40 мин в SW 27 роторе и экстраги- Приблизительно 25 мкг, что соответстрованием буферированным фенолом. После вует25 мкл, плазмидной ДНК рС2106 добавдобавления 30,44 r CSCI и 1 мл 5 мг/мл ляют и перемешивают с 10 мкг 10Х BamHI раствора этидиумбромида обьем раствора реакционного буфера — 1,5 М NaCl, 60 мМ устанавливают 40 мл и помещают в кювету 25 трис-HCI, рН 7,9, 60 мМ MgClz и 1 мг/мл

VTi 50 ультрацентрифуги, После герметиза- бычьей сыворотки альбумина (BSA), 5 мкл ции кюветы раствор центрифугируют в VTI (50 единиц) рестрикционного фермента

50 роторе при 42000 об/мин в течение 16 ч. BamHI,5мкл(50единиц) рестрикционного

Полученную плазмидную полосу визуализи- фермента Ncol и 55 мкл Н О. Полученный руют, облучая ультрафиолетовым светом, 30 реакционный раствор инкубируют при 37 С выделяют, а затем помещают в VTI 75 кюве- в течение 4 ч, после чего реакция практичету и ротор и центрифугируют при 50000, ски завершается, об/мин в течение 16 ч. Все необходимые Ncol — BamHI реакционную смесь обраизменения в объеме осуществляют, добав- батывают электрофоретически на 1%-ном ляя TES, содержащий 0,761 гlмл CSCI, Плаз- 35 агарозном геле до четкого отделения целемидную полосу снова выделяют, вых фрагментов 1,6 кв Ilcol-BamHI и 8,7 экстрагируют насыщенным солевым изо- квйсо!-Ксо!отдругогопродукта расщеплепропанолом для удаления этидиумбромида ния., 0,3 кв рестрикционного фрагмента. и разбавляют 1; 3 ТЕ$ буфером. Затем к Визуализацию обработанной электрофорераствору добавляют два обьема зтанола и 40 зом ДНК осуществляют подкрашиванием инкубируютв течение ночи при-20 С. Плаз- геля в разбавленном растворе (0,5 мкг/мл) мидную ДНК таблетируют центрифугирова- этидиумбромида и экспонированием поднием раствора в SS 34 роторе в течение 15 крашенного геля длинноволновым ультра-. мин при 10000 об/мин. фиолетом. После определения положения

1 мг плазмидной р!Т335 ДНК.. получен- 45 целевых фрагмейтов s геле делают небольной таким способом, суспендируют в 1 мл шую щель перед каждым из целевых фрагTE буфера (10 мМ Трис-HCI, рН 8,0 и 1 мМ ментов и,в каждую щель помещают

ЕДТА) и хранят при -20 С. - - -- .: небольшие кусочки мембраны, При продолПример 2. Конструирование плазми- жении электрофореза ДНК нековалентно ды plT337. А. Культура Е.соИ К12 PV308/рС 50 связывается с ДЕАЕ мембраной. После того

Z106 и выделение плазмиды pCZ106. как целевые фрагменты связывают с ДЕАЕ

Лиофил культуры E.coll К12 мембраной, эти мембраны извлекают и проРЧ308/pCZ106 получают из Северных реги- мывают буфером с малым содержанием соональных исследовательских лабораторий, ли (100 мМ KCI, 0,1 М ЕДТА и 20 мМ

Пеория, Иллинойс, под регистрационным 55 Трис-HCI, рН 8). Затем каждую мембрану. номером N. RR LB-15959, Лиофил использу- помещают в небольшую ампулу и погружают для инокулирования 1 л L-бульона, со- ютвбуферсвысокимсодержаниемсоли(1М держащего 50 мкгlмл канамицина, а затем NaCI, 0,1 мМ ЕДТА и 20 мМ Трис-HCI, pH 8) инокулированный бульон инкубируют при и инкубируют при 65 С в течение 1 ч для о

25 С в воздушном шнейкере до О.Д, 59ц удлинения ДНК из ДЕАД бумаги. После ин19

1780542

20 кубирования при 65ОС инкубационный буфер собирают и мембрану промывают концентрированным солевым раствором.

Промывочный раствор сливают с инкубационным буфером перед сбором целевых фрагментов ДН К, . Обьем раствора ДНК с высоким содержанием соли устанавливают так, чтобы концентрация NaCI была 0.25 М и затем добавляют три объема холодного абсолютированного этанола. Затем полученные растворы смешивают и помещают при-70 С на 10 — 20 мин. После охлаждения растворы центрифугируют при 15000 об/мин в течение 15 мин. После еще одного осаждения для удаления остаточной соли ДН К таблетки промывают этанолом, сушат, повторно суспендируют в 20 мкл буфера ТЕ и они содержат 5,0 мкг целевых 1,6 кв Ncol-ВагпН! и 8,7 кв Ncol — Ncol рестрикционных фрагментов плазмиды pCZ106, Полученные очи, щенные фрагменты отдельно растворяют s

25 мкл ТЕ буфера и хранят при -20 С.

С.Ncol u BamHI гидролиэ плазмиды

PIT335 и выделение 1,5 кв Ncol — BamHI фрагмента, который кодирует изопеницил. лин-N-синтетазу, Приблизительно 25 мкг соответствующих 25 мкл ДНК плазмиды plT335 расщепляют рестриктазами Ncol и BamHI, Ncoi — BamHI, обработанную ДН К, rioMeщают на 1 ) -ный агарозный гель и выделяют целевой 1,5 кв Ncol-BamHI фрагмент.

Получают приблизительно 5 мкг целевого фрагмента, суспендированного в 25 мкл ТК буфера, и хранят при -20 С.

Д. Окончательное конструирование плазмиды р1Т337, 5 мкл 1,6 кв Ncol-BamHI и 2,5 мкл 8,7 йсо Ncol фрагментов плазмиды pCZ106лигируют с 5 мкл 1,5 кв Ncol-BamHI фрагмента плазмиды р1Т335 до получения плазмиды plT337. Реакционный объем составляет 30 мкл и включает указанные фрагменты ДНК, 1,1 мкл (100 ед) Т4

ДНКлигазы, 3 мкл 10Х лигирующего буфера (0,05М Трис-HCI, рН 7,8, 100 мМ МоС12, 200 . MM дитиотреитола QTT), 10 мМ АТР, и 1 мг/мл BSA) и 13,4 мкл Н20. Реакционную смесь инкубируют при 15 С в течение 2 ч, после чего реакция практически завершается. Лигированная ДНК составляет целевую плазмидную ДНК plT337.

Пример 3. Конструирование Е.coll

К12 PV308/р1Т337 и анализ Е.coll продуцирующей иэопенициллин-N-синтетазы.

А. Конструирование Е .coll К12

РЧ308/р! Т337, 50 мл культуры Е.coll К12 PV308/N.RR

LB — 15624/ в L-бульоне выращивают до

О.Д. 590 0 5 единиц поглощения, Культуру охлаждают на льду в течение 10 мин и клетки собирают центрифугированием. Клетки повторно суспендируют в 25 мл холодного 100 мМ CaCI2 и инкубируют на льду в течение 25 мин. Клетки еще раз осаждают цейтрифугированием, повторно суспендируют в 2,5 мл холодного 100 мМ CaCI2 и инкубируют на льду в течение ночи. 200

10 мкл этой клеточной суспензйи смешивают с легированной ДНК и инкубируют на льду в течение 20 мин, а затем клетки собирают центрифугированием. Клетки повторно суспендируют в 1 мл L-бульона и эту суспенэию

15 инкубируют при 25 С в течение часа, Аликвотные части смеси клеток помещают на

1:агарные (1=бульон с 15 г/л агара) пластины. содержащие 50 мкг/мл канамицина и эти пластины инкубируют при 25ОС. Транс20

55 форманты Е.coll K12 PV308/pIT337 проверяют отбором на устойчивость к канамицину и рестрйкционным. ферментным анализом плазмидной ДНК трансформантов. Плазмидную ДНК получают иэ

Е.coll К12 PV308-plT337 трансформантов, но в меньшем количестве и опускают стадии

CS CI-градиента.

B. Культура Е,coll К12 P V308/plT337 для экспрессии активности синтетазы изопенициллина N;

Некоторые иэоляты E.coll К12

РЧ308/р!Т337 инокулируют в 5 мл аликвотных частей L -бульона, содержащего 50 мкг/мл канамицина, и эти культуры инкубируют в воздушном шейкере при 25ОС до тех пор, пока О.Д.ggo не составил 0,2 ед. поглощения. Затем культуры переносят в воэдушный шейкер при 37 С и инкубируют в течение приблизительно 6 ч.

Спустя 6 ч инкубирования. при 37 С собирают по 1 мл каждой культуры и клетки спрессовывают центрифугированием. Клеточные лепешки по отдельности промывают

1 мл 10 мМ NaCI, а затем повторно суспендируют в 1 мл IPS экстракционного буфера (0,05 М Трис-HCI, рН 8.0 0,01 М KCI и 0,01 М

Mg SO4). Затем клетки обрабатывают ультразвуком импульсами по 5,6 с. Время между импульсами облучения ультразвуком составляет 60 с и полученную смесь выдерживают в бане лед-этанол во время этой процедуры. После обработки ультразвуком клеточную смесь центрифугируют для удаления осколков, а затем используют непосредственно в анализе.

С, Анализ активности пенициллин-Nсинтетаэы.

Реакцию контроля фермента проводят в полном объеме 500 мкл. Для начала реакции

1 мл раствора 1,4 мМд (L -а аминоадипил) 1780542

- L -цистеинил-Д-валина и 3,75 мМ ДТТ ос- пептона 5 r, Dlfco дрожжевого экстракта 1,5 тавляют реагировать при комнатной темпе- г, хлористого натрия 3,5 r, безводного двуратуре в течение 30-60 мин для приведения замещенного калий фосфата 3,7 r, монокалюбых димерных трипептидов в мономер- лий фосфата 1,3 г, Difco бычьего экстракта ную форму, 50 мкл каждого из последующих 5 1,5 в 1 л деионизированной воды. Раствор исходных растворов помещают аликвотны- доводят до кипения, охлаждают до 25оС ми частями в каждую контрольную ампулу доводятдо рН 71н.HCI или1н,.NaOM, a затем (стерильные, стеклянные ампулы 13 х 100 выдерживают в автоклаве в течение 20 мин мм1: при 121ОC и давлении 1,055 кг/CM перед

500 мМ Трис-HCl,рН 7,4, 100 мМ KCI, 10 употреблением, Засеянный агар помещают

100 MM М9804, 2 мМ ЕеЯО4 и 6,7 мМ аскор- в пластины 100 х 15 мм в количестве 15 мл биновой кислоты. Затем добавляют различ- засеваемого arapa на пластину, Углубления ные количества экстракта, разбавленного получают отсасыванием 5 мл пипеткой, кажводой до объема 150 мкл, Около 100 мкл дое углубление было 10 мм диаметром. аликвотных частей раствора трипептида до- 15 После подготовки пластин образцы побавляют затем в каждую ампулу, добавлени- мещают в эти углубления, пластины помеем трипептида начинают реакцию. Каждую щают в инкубатор при 37 С на 18 ч, ампулу вращают после добавления субстра- Результаты анализа определяют, иэмета,.Ампулы с реакционной смесью помеща- ряя диаметр чистых поверхностей вокруг ют затем в шейкерную баню при вращении 20 каждого углубления с образцом, которое обсо скоростью 250 об/мин при температуре разовывалось из-за того, что М. Iuteus не инкубирования 25 С, Время реакции со- могут расти в присутствии пенициллина, ставляет 45 мин. Результаты этого анализа приведены

После продолжения реакции 45 мин от- ниже, бирают 2 образца по 100 мкл каждый и ка- 25 Хотя линейность анализа по измерению пают в выемки в пластинах для биоанализа, размера зон заметно падает, ко да размер а к остальному добавляют 100 единиц пени- зоны превышает 21 мм, результаты анализа циллинаэы А. Пенициллиназу А продают в,: четко показывают, что Е.coll К12 ампулах по 100000 единиц, которые затем PV308/pIT337 трансформанты экспрессирегидратируют до 5 мл, добавляя Нг0. В 30 руютактивностьизопенициллин-N-синтетакаждую реакционную смесь добавляют по 5 эы, тогда как трансформанты Е.coli К12 мкл (100 ед) регидратированной пеницилли- PV308/pCZ106 этого не делают. назы А, оставляют реагировать в течение 5 Материал, продуцируемый Е,coll, сущемин при комнатной температуре, а затем по ственно более стабилен, нежели синтетаэа

100 мкл каждого экстракта, обработанного 35 и за и е н и ц и л л и í a N, и ол у че н н а я и з пенициллиназой А, помещают в углубление Cephalosporlum acremonlum, Эта более вына пластинке для биоаналиэа. Такую обра- сокая стабильность была впервые обнаруботку пенициллиназой А проводят для про- жена в экспериментах по замораживанию и верки того, чтобы увериться, что зоны на оттаиванию. Активность изопенициллин-Nпластине для биоанализа связаны с наличи- 40 синтетазы С,aremonium быстро инактивируем пенициллина, а не цефалоспорина или ется при замораживании и оттаивании, но других примесей, фермент, продуцированный Е,coli, достаСтандартную кривую пенициллина N точно устойчив к замораживанию и оттаиваполучают, добавляя 0,5, 2,0, 5,0, 10,0 и 20,0 нию, Вероятно, что более высокая мкг пенициллина N в углубление на пла- 45 стабильностьсвязанасразницейвобработстинках для биоанализа, Активность пени- ке фермента между С.acremonlum u E.coll. циллиназы А проверяют также добавляя 5 Так, изопенициллин-N-синтетаза, выделенмкл ферментного препарата к 200 мкл 0,2 ный из С.acrernonium, по-видимому, не сомкг/мл пенициллина N, держит первых двух аминотерминальных

Пластины для биоанализа состоят из 50 аминокислотных остатков, метионина и глиК131 питательного агара, который получа-, цина. Е,coll продуцирует пептидазу, котоют, растворяя 30,5 ВВ LAntibiotic Medium ь1 рая отщепляет аминотерминальный литре деиониэированной воды, доводя рас- метиониновый остаток протеина, когда потвор до кипения, охлаждая до 70 С, а затем следующий остаток имеет относительно невыдерживая в автоклаве 35 мин при 121 С 55 большую боковую цепь. В протвине IPS эа и давлении 1,055 кг/см, Далее пластины аминотерминальным метионином следует г засевают 4 мл свежей ночной культуры остаток глицина, поэтому аминотерминальMicrococcus luteus АТСС 9341/ на 700 мл ный метионин отщепляется. агара. М. Iuteus выращивают в К544 пита- Пример 4. Конструирование плазмительном бульоне, который состоит из Difco ды pPS20, I

1780542

А. Получение Hind-III гидролизованной плазмиды piT335.

5 мкл ДНК плазмиды рlТ335, что соответствует 5 мкг плазмидной ДНК, добавляют и перемешивают с 5 мкл 10X Hind-!!! реакционного буфера (500 мМ Трис-НС1, рН

8,0, 100 мМ MgCIz, и 1 мгlмл BSA), 5 мкл (50 единиц) рестрикционного фермента

Hind-И! и 35 мкл НгО. Полученную реакционнуюю смесь инкубируют при 37 С в течение

4 ч. Расщепленную HInd-Ø плазмидную

plT335 ДНК экстрагируют один раз фенолам, а затем экстрагируют один раз СНСlз.

После этих экстракций расщепленную

Hind — lil плазмидную р!Т335 ДНК доводят да 0,25 M в NaCI, разбавляют двумя объемами абсолютированного этанола, охлаждают в бане сухой лед-этанол и затем осажденную ДНК собирают центрифугированием. В результате этой процедуры получают 5 мкг расщепленной Hind — III плазмидной pIT335

ДНК, которую растворяют в 10 мкл TE буфера и хранят при -20 C.

В. Hind — lii обработка плазмиды plT221 и выделение 2,7 кв.

Hind — !!! фрагмента плазмиды plT221, который содержит ген, придающий устойчивость к гидромицину.

Выделяют плазмиду PIT221 из E,coll

К12 А221/рlТ221. Около 50 мкг плазмиды

plT221 расщепляют в 100 мкл IX Hind — !!! реакционного буфера со 100 единицами рестриктазы. После экстрагирования, осаждения и повторного растворения гидролизаван ной Hind-I II плазмиднай

plT221 ДНК, ДНК помещают на 1%-ный агарозный гель и осуществляют электрофорез.

Выделяют целевой 2,7 кв Hind-!!! рестрикцианный фрагмент плазмиды pIT221, который содержит последовательность, активирующую транскрипцию и трансляцию фосфоглицераткиназы дрожжей

Saccharornyces сеген!з!ае и кодирует фасфотрансферазный фермент, который придает устойчивость к гидромицину, и очищают от геля и других продуктов расщепления.

Описанным способом выделяют около 5 мкг целевого 2.7 кв Hind-111 рестрикционного фрагмента. Полученный очищенный фрагмент растворяют в 10 мкл ТЕ буфера и хранят при -200С.

С, Окончательное конструирование плазмиды pPS20.

Около 1 мкл Hind-lli гидрализованной плазмидной рlТ335 ДНК и 4 мкл 2,5 кв Hind111 рестрикционного фрагмента плазмиды

plT221 лигируют в ЗО мкл лигирующего Gyфере со 100 единицами Т4 ДНК лигазы. Лигированная ДНК составляет целевую плазм иду pPS20.

2.7 кв Hind III рестрикцианный фрагмент может включаться в плазмиду рlТ335 в любой из двух ориентаций, так чта лигираванная ДНК представляет также и другую плазмиду, обозначенную как плазмида pPS

20.1, Плазмида pPS20,1 функционально эквивалентна плазмиде pP 820 и отличается ат плазмиды pPS20 только в отношении ориентации 2,7 кв Hind — III рестрикцианнаго фрагмента.

Д. Конструирование Е .coll К12

JA221/pPS20 и выделение ДНК плазмиды

pPS20.

50 мл культуры Е.coil K12 JA221(NRR

LB — 152 t1) в !=бульоне выращивают да

О.Д.No порядка 0,2. Культуру охлаждают на льду в течение 10 мин, а затем клетки собирают центрифугираванием. Клеточный осадок повторна суспендируют в 25 мл холодного 100 мМ СаС1 и инкубируют на" льду в течение 25 мин, Клетки еще раз выделяют центрифугираванием, осадок повторна суспендируют в 2,5 мл холодного 100 мМ

СаС12 и инкубируют на льду в течение ночи.

25 200 мкл этой клеточной суспензии смешивают с лигираваннай ДНК и инкубируют на льду в течение 20 мин, Затем полученную смесь инкубируют при 40 С в течение 2 мин, а затем 10 мин при комнаткой температуре.

30 K Iклеточной смеси добавляют 3 мл L-бульона и затем клетки инкубируют в воздушном шейкере при 370С в течение 2 ч. Аликватные части клеточной смеси помещают на 1=агарные (I,-бульон с 15 г/и бульона) пластины, 35 содержащие 100 мкг/мл ампициллина, а затем пластины инкубируют при 37 С Е.саИ

К12 J А221/pPS20трансфарманты проверя>от рестоикцианным ферментным анализом плазмиднай ДНК устойчивых к ампицилли40 ну трансфармантав, Плазмидную ДНК палучаiат из Е. саИ К12,3А221/pPS 20 и Е.coli

К12 J 221/ppS20.1.

Пример 5. Конструирование плазмиды pPS 21, 45 A. Гидрализ Ncol и обработка Кленова плазмиды р1Т335 ДН К и выделение полученного 0,85 кв фрагмента, который кодирует последовательность, активирующую транскри и цию и трансляцию Cepha los porlum

5Q acremonlum.

Приблизительно 50 мкл, что соответствует 50 мкг плвзмиднай р1Т335 ДНК, смешиваютс10мкл10ХВавН!буфера,5мкл (50 единиц) рестрикцианнаго фермента Ncol u

55 35 мкл Н О. Полученную реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 4 ч.

Затем реакционную смесь доводят до 0,25

М в NaCI, разбавляют двумя объемами абсалютираваннага этанала, охлаждают в течение 10 мин в бане са смесью сухой

1780542

26 лед-этанол и центрифугируют до получения Расщепленную BamHI, обработанную по лепешки осажденной ДНК. Кленову ДНК плазмиды pPS 19. помещают

Плазмиду р!Т335, расщепленную Ncol, íà 1 -ный агарозный гель и 7.7 кв фраграстворяют в 50 мкл IX буфера Кленова (40 мент выделяют и оч щают. П мМ КРО Н7, т и оч! щают. опучают оком 4р,5,6,6мМMgClz 1,0мМ2-мер- 5 ло 5 мкг целевого фрагмента, растворяют каптоэтанола, 33 мкм dATP,33 мкм dCTP, 33 его в 10 мкл ТЕ буфера и хранят при темпемкМ dGTP и 33 мкМ dTTP, 2 мкл (10 единиц) ратуре около -20 С. крупно о фрагмента Е.coil ÄÍÊ полимеразы Д. Окончательное конструирование

I, известной как полимераза Кленова, до- плазмиды pPS21. бавляют и смешивают с ДНК, а полученную 10 2 мкл 0,85 кв фрагмента лигируют с 2 реакционную смесь инкубируют при 16 С в, мкл 7,7 кв фрагмента в 30 мкл IX буфера течение одного часа. Реакцию заканчивают лигирования, содержащего 500 единиц Т4 экстрагированием буферированным фено- ДНК лигазы. Реакционную смесь для лигилом. Плазмидную р!Т335 ДНК, обработан- рования инкубируют при 12 С в течение 16 ную Ncol и фрагментом Кленова, помещают 15 ч и лигированная ДНК представляет ДНК затем на 1 -ный агарозный гель для обра- плазмиды pPS 21. ботки электрофорезом. Из геля выделяют Е. Конструирование Е.coli К12

0,85 кв рестрикционный фрагмент, кото- А221/pPS21. рыйсодержитпоследовательность,активиру- Лигированную ДНК используют для ющую транскрипцию и трансляцию 20 трансформации Е .coll К12 JA221. УстойчиCephalosporium acremoniurn гена I PS. Получа- вые к ампициллину трансформанты скриниют около 4 мкг целевого фрагмента и суспен- руют по наличию плазмиды pPJ21 дируют в 10 мкл ТЕ буфера. рестрикционным ферментным анализом

В, Конструирование промежуточной плазмидной ДНК трансформантов, Так как плазмиды pPS 19. 25 0,8 кв фрагмент включает 7.7 кв фрагмент

Один мкг ппазмиды plT221 растворяют плазмиды pPS 19 в одной из двух ориентав 5 мкл 10 X Xmal буфера (250 мМ NaCI, 60 ций и так как только одна орйентация прамМ Трис-HCI, рН 7,5, 60 MM MgClg, 60 MM вильно располагает последовательность, 2-меркаптоэтанола и 1 мг/мл BSA), 43 мкл активирующую транскрипцию и трансляzO и 2 мкл(10 единиц) рестрикционно- 30 цию Cephalosporium acremonlum для эксго фермента Xmal. Полученную реакцион- прессии гена, придающего устойчивость к нуюсмесьинкубируютпри37 Свтечение4 гидромицину, только половина трансфорч. Реакцию заканчивают экстракцией фено- мантов будет"целевой Е.coli К12 JA221/ Р$ р лом. После следующей экстракции реакци- 21. Один такой Е .coli К12 J A221/pPS 21 онной смеси Хва! СНС!з зту смесь доводят 35 трансформант используют для получения до 0,25 M в NaCI, разбавляют двумя объема- плазмидной pPS 21 ДНК. ми этанола, охлаждают в течение 10 мин в Пр и м е р 6, Генетическая трансформабане сухой лед-этанол и осаждают, Xmal- ция Cephalosporium acremonium плазмидагидролизованную плазмидную plT221 ДНК ми рР S20 и рР S21. собирают центрифугированием, 40 Ампулу спор (приблизительно 10 кониXmai расщепленную плазмидную plT дий в 1,5 мп консервирующей среде: 5

221 ДНК повторно растворяют в 100 мкл IX лактозы, 10/ глицерина и 0,1 /, Твин 80) легирующегобуфера,содержащего500еди- либо лиофилизируют, либо берут из храниниц Т4 ДНК лигазы. Реакционную смесь ли- пища в жидком азоте и оттаивают при комгирования инкубируют в течение 45 натной температуре, разбавляют в 5 мл приблизительно 16 ч при 12 С, а затем ис- стеоильного физиологического раствора. пользуют для трансформации Е.coll К12 J А Около 0,1 мл этой суспензии используют для

221. Устойчивые к ампициллину плазмид- инокулирования каждого из приблизительные pPS 19 трансформанты идентифициру- но 50 слантов, содержащих 20 мл соевого ют рестрикционным ферментным анализом 50 агара с Триптиказой в качестве среды. Пеплазмидной ДНК трансформантов, ред инокупированием среде дают подсохС, BamHI расщепление и обработка нуть до тех пор, пока влага на поверхности

Кленова плазмидной pPS19 ДНК и выделе- - уже не будет видна. Инокулированные клетки

we фрагмента 7,7 кв, инкубируют в течение около 4 дней при 25 С.

50 мкг плазмидной pPS 19 ДН К расщеп- 55 Около 10 мл консервирующей среды добавляют рестрикционным ферментом BamHI и ляютдля роста мицепия, который покрывает обрабатывают ферментом Кленова за иск- поверхность среды, Клетки выращивают для лючением того, что используют рестриктазу суспендирования конйдий и конидиальную

BamHl вместо Ncol рестриктазы лпя рас- суспензию собирают и аликвотные части по щепления ДНК плазмиды pPS 19. 10млзаморакиваютпри-80 С.Заморожен28

1780542

10

55 ная конидиальная суспенаия медленно теряет жизнеспособность и ее не следует использовать после 3 месяцев хранения при80 С.

Выращивание клеток для получения протопластов, Приблизительно 106 мл водной среды в

500 мл шейкере инокулируют клетками от 10 мл замороженной конидиальной суспензии.

Клетки получают центрифугированием (10 мин х 2600 об/мин), а затем непосредственно суспендируют в водной культуральной среде. Декантирование надосадочной жидкости проводят перед суспендированием, так как лактоза и глицерин вредно влияют на рост клеток. Колбу, содержащую суспендированные клетки, помещают в гироскопический шейкер с водяной баней и инкубируют при 29 — 30 С в течение 24 ч при

285 об/мин. Рекомендуемая температура

29 — 30 С на стадии культивирования особенно предпочтительна для получения трансформируемых протопластов, но возможны также и более низкие температуры

25î С

Водную культуральную среду получают следующим образом.

100 мл раствора А помещают в 500 мл шейкер, колбу закрывают коммерческой пробкой и помещают в автоклав при 121 С на 20 мин, 2 мл раствора В и 4 мл раствора

С добавляют затем к раствору А для получения водной культуральной среды.

Раствор А. Сахароза, 36 г/л, L — аспарагин 7,5 г/л, КН2РО4 15 r/ë, К2НРО4 21 г/л, Na2S040,75г/л, MgS04 7Н2018 г/л, CaCI2

0,06 г/л, солевой раствор 1 мл/л, природный рН. Солевой раствор: Fe/МН4//$0д/2 х6Н О 15г/л, MgSO4 4Н20 Зг/л, ZnSOa х7Н20 3 г/л, CuS04 5 Н О 0,8 г/л.

Раствор В. Глюкоза 108 г/л (автоклав пои 121 С, 30 мин)

Раствор С. Сахароза 25 г/л, жидкость от замочки зерна (4 вес/объем /азот) 12,5 мл, ацетат аммония 5,5 г/л, СаСОз 5 г/л, рН устанавливают 6,5 КОН, и автоклав при

121 С в течение 30 мин.

Получение Cephalosporium протопластов.

Клетки 24-часовой культуры собирают фильтрованием с подсосом и суспендируют в буфере рН 7,1 0,1 М лимонной кислоты и

0.2 M двухосновного натрийфосфата, к ним добавляют дитиотреитол до концентрации

0,01. М, Добавляют достаточно буфера для получения окончательной концентрации 1 r (взвешивают после фильтрования с подсосом) клеточной массы нэ 20 мл буфера. Клеточную суспензию помещают в гироскопический шейкер с водяной баней в

50 мл колбу и инкубируют при 29 — 30 С в течение 90 мин при 140 об/мин, Клетки, обработанные дитиотреитолом, промывают водой, а затем повторно суспендируют в растворе фермента (25 мгlмл бета-глюкуронидазы в буфере рН 6,35, дополненном 0,8

M NaCl и 0,02 M MgSO4), Окончательная клеточная концентрация составляет 1 r обработанной клеточной массы на 10 мл раствора фермента, Затем клеточную суспензию помещают в гироскопический шейкер с водяной баней при 29-30 С на 3 ч при 120 об/мин, Суспензию протопластов разбавляют 4 объемами промывочного раствора (0,8 М NaCI и 0,02 M MgS04), а затем фильтруют под действием силы тяжести через два слоя бумажного полотенца, Фильтрат, содержащий протопласты, центрифугируют при комнатной температуре в течение 5 мин при 2600 об/мин. Надосадочную жидкость декантируют и протопласты суспендируют в 10 мл раствора.

После повторения процедуры промывки дважды, протопласты повторно суспендируют в достаточном количестве 0,8 М NaCI до достижения концентрации от. 2 до 3 х 10 протопластов на мл flo гемацитометру.

Трансформируют 1 мл суспензии

Cepha los porium и ротопластов (от 2 до 3 х 10 на мл) в 0,8 М NaCI, добавляют к 0,005 мл свежеперегнанного ДМСО, а затем доводят до 80 M CaCIz. Около 20 мкг трансформированных плазмид либо pPS 20, либо pPS 21 в зависимости от трансформации и полиэтиленгликоль 4000 (>20 вес/объем в воде) добавляют к суспензии протопластов до достижения объема смеси 10 мл, Полученную смесь инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре, а затем центрифугируют при 700 об/мин в течение 5 мин, после чего центрифугируют со скоростью

2500 об/мин B течение 10 мин, Лепешку протопластов суспендируют в 1 мл 0,8 M

NaCI. Аликвотные части (0,1 мл) помещают на поверхность среды соевый агар-триптиказа (BBI), которая была обогащена 10,8 сахарозы для осмотической стабилизации протопластов, Затем чашки Петри инкубируют при 15 С в течение 24 ч, в каждую чашку Петри добавляют 4 мл ожиженного агара (0,41 /, вес/объем при 43 С), содержащего 0,8 М хлористого натрия и достаточно гидромицина для достижения окончательной концентрации 100 мкгlмл. После отверждения поверхностного слоя чашки Петри инкубируют при 25 С в увлажненной камере, Хотя колонии трансформантов достаточного размера для субкультуры наблюдают через 12 дней после трансформации, более

29

1780542

30 медленный рост трансформантов может эа-, Синтезируют одиночные нити следуюнять и 60 дней для достижения подходящего щих линкеров в автоматизированном ДНК размера субкультуры. Абортивные транс- синтезаторе: форманты легко отличимы от стабильных 5 — CATGAACAAG — 3 трансформантов, так какабортивные транс- 5 3 — ТТСТТССТАΠ— 5 форманты не растут в субкультуре в свежей . Около 75 пикомолей каждой одиночной среде, содержащей 100 мкгlмл гидромици- нити линкера отдельйо растворяют в 22,5 на. Cephalosporium acremonlum pPS 20 мкл Н20 и 2,5 мкл лигазного буфера. Около трансформанты экспрессируют активность 1 мкл (-10 единиц) Т4 ДНК киназы добавляфермента с гораздо более высоким уровнем 10 ют к каждому раствору однонитевой ДНК и по сравнению с С. acremonium трансформи- реакционную смесь инкубируют при 37 С в рованными плазмидами plT221. течение 10 мин. После реакции кинаэы peCephalosporium acremonIum pPS 21 акционные смеси инкубируют при 70 С в трансформанты устойчивы к гидромицину, течение 15 мин. Затем для отжига одноничто указывает на функциональность после- 15 тевой ДНК до образования линкера смешидовательности, активирующей транскрип. вают две реакционные смеси, инкубируют цию и трансляцию С. acremonium при 65ОС в течение 10 мин, инкубируют при настоящего изобретения. комнатной температуре в течение 2 ч, а затем инкубируют при 4 С в течение ночи, Пример 7. Конструирование плазмид 20 Окончательное конструирование плазpPS21A, pPS22, pPS23, pPS23.1, pPS24, мид pPS 23 и pPS23.1.

pPS25 и pPS25.1, Один мкл BamHI расщепленной плазА, Конструирование промежуточных мидной pUC8 ДНК добавляют к смеси 4 мкл плазмид pPS23 и pPS23.1. 0,85 кв Ncol рестрикционного фрагмента

Получение BamHI — гидролизованной 25 плазмиды р1Т335и10мкготожженноголинплазмиды pPUCS.. кера. Около 4 мкл 10Х лигазного буфера, 2

Около 5мкг плазмиды pUC8 растворяют мкл (1500 единиц) Т4 ДНК лигазы и 29 мкл в5мкл 10Х BamHI рестрикционного буфера.. H20 добавляют к смеси ДНК и полученную и 40 мкл Н20. Около 5 мкл (- 50 единиц) реакционную смесь инкубируют при 4 С в рестрикционного фермента BamHI добав- 30 течение ночи, Лигированная ДНКсоставляляют к раствору ДНК, а полученную реакци- ет целевые плазмиды pPS 23 и pPS 23.1. онную смесь инкубируют при 37 С втечение 50 мл культуры Е,coli К12 М109. доступ2 ч. Реакцию заканчивают экстрагировани- ных из Pharmacia Р-L Biochemical, в L-бульем буферированным фенолом с последую- сне выращивают до значения О.Д.qgo щей экстракцией хлороформом. BamHI — 35 приблизительно 0,5 единиц поглощения, расщепленную плазмидную pUCS ДНК Культуру охлаждают на льду в течение 10 осаждают при добавлении NaCI до концен- мин и клетки собирают центрифугированитрации 0,25 м, добавления 2 объемов этано- ем. Клеточный осадок повторно супендирулаиохлаждениядо-70 Сна10мин. BamHI . ют в 25 мл холодной 100 MM CaClz u — гидролизованную плазмидную pUCS ДНК 40 инкубируют на льду в течение 25 мин. Клетсобирают центрифугированием и повторно ки еще раз осаждают центрифугированием суспендируют в 5 мкл Н20. и повторно суспендируют в 2,5 мл холодного

100 мМ СаС 2 и инкубируют на льду в течеВыделение 0.85 кв Ncol фрагмента ние ночи. плазмиды plT335. 45 200 мкл этой клеточной суспензии смеОколо 10 мкг плазмиды plT335 раство- шивают с лигированной ДНК. полученной ряют в 5 мкл 10 Х BamHI буфера и 40 мкл ранее, и инкубируют на льду в течение 20

HgO. Около 5 мкл (- 50 единиц) рестрикци- мин. В конце этого периода клетки помещаонного фермента Ncol добавляют к раство- ют в водяную баню при 42ОC в течение 2 ру ДНК и полученный реакционный раствор 50 минут, а затем возвращают на лед еще на 10 о инкубируют при 37 С в течение 2 ч, Затем мин. Клетки собирают центрифугированиреакционную смесь помещают на 17-ный ем, повторно суспендируют в одном мл .агарозный гель и выделяют целевой 0,85 бульона и инкубируют при 37ОC в течение 2 кв Ncol рестрикционный фрагмент. который ч. Аликвотные части клеточной смеси помесодержит последовательность, активирую- 55 щают на L-агарные(-.бульон с 15 г/л агара) щую транскрипцию и трансляцию IPS гена. пластины, содержащие 100 мкг ампициллиОколо1мкгцелевогофрагментаполуча- на (мл, 40 мкг Хва!/мл и 40 мкг IPTG/ìë, ют и суспендируют в 5 мкг Н20. Пластины инкубируют при 37 С в течение

Получение линкера, используемого при ночи. Колонии, которые содержат плазмиду конструировании плазмиды pPS 23, без вставки, такие, как Е. соИ К12 JM109/р

32

1780542

30

U68, проявляются синими на этих пластинах, Колонии, которые содержат плазмиду со вставкой, такой, как Е. coll К12

JМ109/pPS23, — белого цвета, Некоторые белые колонии отбирают и скринируют рестрикционным анализом их плазмидной

ДНК на наличие 0,85 кв BamHI рестрикционного фрагмента, содержащего IPS активирующую последовательность. Получают плаэмидную ДН К из Е . coll К12 J M109/pPS

23 и Е.coll К12 JM109/pPS23.1.

В.Выделение 0,85 кв BamHI рестрикцион ного фрагмента плазмиды pPS 23. . Около 50 мкг плазмидной ДНК растворяют в 15 мкл 10X BamHI реакционного буфера и 125 мкл Н20. Около 10 мкл (100 единиц) рестрикционного фермента BamHI добавляют к раствору ДНК, и полученную реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 2 ч. BamHI — расщепленную плазмидную pPS 23 ДНК помещают ía 1% агарозный гель и 085 кв BamHI рестрикционный фрагмент, который содержит активирующую последовательность IPS гена. Около 5 мкг целевого фрагмента получают и суспендируют в 10 мкл Н20, С. Получение BamHI — расщепленной плазмидной pps 19 ДНК.

Около 5 мкл плазмидной pPS 19 ДНК растворяют в 10 мкл 10X BamHI реакционного буфера и 35 мкл HzO. Около 5 мкл (50 единиц) рестрикционного фермента BamHI добавляют к раствору плазмидной pPS 19

ДНК и полученный реакционный раствор инкубируют при 37 С в течение 2 ч. Реакционную смесь BamHI-расщепленной плазмидной pPS 19 ДНК экстрагируют 1 раз буферированным фенолом, а затем дважды фенолом, Затем ДНК осаждают, собирают центрифугированием и повторно суспендируют в 10 мкл Н О.

Д. Окончательное конструирование плазмид pPS 21À, pPS22, pPS24, рР25 и pPS

25.1.

Около 1 мкл 0,86 кв BamHI рестрикционного фрагмента добавляют к 1 мкл BamHI — расщепленной плазмидной pPS 19 ДН К, 3 мкл 10Х лигазного буфера, 2 мкл Т4 ДНК лигазы и 23 мкл Н20. Полученную смесь реакции лигирования инкубируют при 15 С в течение ночи. Лигированная ДНК составляет целевые плазмиды pPS21A, pPS24, pPS25 и pPS 25.1.

Лигированную ДНК используют для трансформации Е.coli К12 С600 штамма, доступного из Американской коллекции типовых культур, Роквил, МД 20852 под регистрационным номером АТСС 33525.

Трансформированные клетки помещают на

L.-агарные пластины, содержащие 100

55 мкг/мл ампициллина, и эти пластины инкубируют при 37 С в течение ночи.

Отдельные колонии снимают с трансформированных пластин, культивируют и используют для получения плазмидной

ДН К. Плазмидную ДН К анализируют рестрикционным ферментным анализом, Нижеприведенная схема демонстрирует соответствующие рестрикционные ферментные расщепления, которые можно использовать для определения плазмид.

Плазмиды pPS 21А. pPS25,1 и pPS 25 используют для трансформирования

Cephalosporium acremonlum, С.acremonlum рР$21А, С acremonium

pPS 25.1 и С. acremonlum pPS25 трансформанты устойчивы к гидромицину, Плазмиды

pPS 22 и pps 24 используют для трансформации С. acremonium. но эти плазмиды трансформируют С.acremoniun в устойчивые к гидромицину с гораздо меньшей частотой, чем это делают плазмиды pPS 21А, pPS 25,1 и pPS 25 потому, что плазмиды pPS

22 и pPS 24 должны интегрировать в

С.acremonium геном в нужном положении для геномной последовательности активирующей С. acremonium для управления экспрессией гена, придающего устойчивость к гидромицину, R р и м е р 8 Конструирование плазмид

pPS 28 и pPS 29.

Около 20 мкг плазмидной pPS 21À ДНК растворяют в 10 мкл 10X Pst! реакционного буфера(1.0 М NaCI, 100 мМ Трис-HCI, рН 7,5, 100 мМ Mg Clz и 1 мгlмл BSA/ и 88 мкл Н О.

Около 2 мкл (150 единиц) рестрикционного фермента Pst I добавляют к раствору ДНК и реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 5 мин, а затем реакцию завершают инкубированием при 70 С в течение 10 мин.

Частично расщепленную Pst I плазмидную

1780542

34

pPS 21А ДНК помещают на агарозный гель манты идентифицируют по их фенотипу, уси после электрофореза и подкрашивания тойчивому к ампи и геля наблюдают следующие фрагменты: 8,5 ным ферментным анализом их плазмидной кв (линеаризированная плазмида), 8,0 кв, ДНК. кв, 1,9 кв 1 5

7,5 кв, 7,0 кв, 6,6 кв, 6,1 кв, 5,2 кв, 3,3 кв, 2,3 5 Плазмиды рР$26 PS 26.1 р . использукв Pst I т к, 1,5 кв, 1,0 кв. 0 5 кв, 6,6 кв и 6,1 ют для трансформац С h 1 ии ер à osporlum ля т рестрикционные фрагменты, выде- acremonlum, Плазмиды PS26 PS 26. ю около 0,5 мкг каждого фрагмента. трансформирую C. 1 р. и р .1

6,6 кв Pst I т .acremon um a устойчикв st I рестрикционный фрагмент вый к гидромицину с высокой частотой, а С. растворяют в 3 мкл 10Х лигазного буфера и 10 acremonlum рР$26 С. и . acremonlurn рР$ нты продуцируют значимкл 20. Около 2 мкл Т4 ДНК лигазы 26.1 трансформанты и о добавляют к раствору ДНК и полученный тельно больше фе льше фермента по данным, ползмерении зон подавления реакционный раствор инкубируют при 15 С ученным при измере оссиз цтеиз, нежели их нетрасв течение ночи, Лигированная ДНК состав- роста Mlcrococc з I t ляет целевую плазмидную ДНК, которую ис- 15 формированные дубликаты. пользуют для трансформации Е .coll К12 С р и м е р . онструирование плазмид

600. Аналогичным образом -6,2 кв Pst I ре- рР$30, рР$30.1, pPS 31 и pPS 31.1. стрикционный фрагмент циркуляриэуют-ли- А. Выделение 3 7 XmA I ги ованием р до получения плазмиды pPS29, ного фрагмента из плазмиды pPS6. ие, m рестрикционкоторую также трансформируют в Е.соИ К12 20 Около IO мкг пл Р$ 6 мкг плазмиды р растворяют в 20 мкг 10Xma реакционного буфера

Плазмиды pPS 28 и pPS 29 используют (250 мМ MaCI, 100 мМ Трис-HCI рН 7,5, 100 для трансформации Cephalosporium мМ МдС!2, 100 мМ 2-меркаптоэтанола и 1

acre mon t um. мгlмл BSA) и 165 мкл Н20. Около 15 мкл (30

С,acremonium pPS 28 и С.acremonlum 25 единиц) рестрикционного: фермента Xma I

pPS 29 трансформанты демонстрируют фе- добавляют к раствору плаз PS 6, ус оичивыи к гидромицину, и плаз- полученный реакци миднои р и р кционныи раствор инкубир и р 29 ДНК руют при 37 С в течение4 ч. Xma I — расщептрансформируют С.acremontum устойчи- ленную плазмидную рР$6 ДНК вый к ги

Д помещают

П име 9 Конт дромицину с высокои частотой. 30 íà 1% агарозный гель и б б ь и о ра атывают элекр и м е р .. онструирование плазмид трофоретически до тех по, пок 3 7 Х

1 рестрикционный фрагмент четко не выдеяютв1

Около 20 мкг плазмиды pPS 21А раство- лится от остальных про .,р дуктов расщепления. ряют в 0 мкл 10X Hind — tl t реакционного Около 5 мкг целевого 3,7 Xma I рестрикцибуфера и 85 мкл HzO. Около 5 мкл (50 еди- 35 онного фрагмента получают и суспендир ют ниц) рестрикционного фермента Hind — III в 10 мкл Н20. добавляют к раствору ДНК и полученный В, Окончательное конструирование раствор инкубируют при 37 С в течение 2 ч. плазмид pPS 30 и pPS 30.1. °

Hind-Ill — расщепленную плазмидную

pPS21A ДНК помещают на 1 $ агарозный 40 . Около 1 мкг плэз ДНК г плэзмиднои Д растворягель и проводят электрофорез до тех пор, ют в 2 мкл 10Х Х t мкл ma рестрикционного буфеН!пд — ill пока 3,45кв, 3,16кв,-1,2кви 69кв ра и 6 мкл Н О. О 2 (n — рестрикционные фрагменты не ста- рестрикционного фермента Xma I добавляновятся четко выделенными на геле. Выде- ют к раствор " ДЙК ляют Н!пб — ill ляют и — рестрикционный фрагмент, 45 ный реакционный раствор инкубируют при

Около 5 мкг целевого 3,45 кв Hind-III ре- 37 С в те 4 . P в течение ч. еакцию заканчивают стрикционного фрагмента получают и сус- экстрагированием б фе и в .и м уферировавным фенолом с последующими двумя экстракциями коло 2 мкл .3,45 кв Hind-И! рестрик- хлороформом. Затем реакционную смесь ционного фрагмента плазмиды pPS 21À до-" 50 осаждают, собирают ф авляют к мкл Н! пб — t fl расщепленной и повторно суспендируют в,23 мкл Н20. Окогоб е а

plT335 плазмидной ДНК, 3 мкл 10Х лигазно- . ло 2 мкл этого - 3 7 Х I мкл этого, кв ma I рестрикционго уфера, 22 мкл HzO и 2 мкл Т4 ДНК лига- ного фрагмента плазмиды рР$6.3 мкл 10Х зы. Полученный раствор реакции лигазного буфера и 2 мкл Т4 ДНК лигазы лигирования инк би ют и и 15 у ру т при С в тече- 55 добавляюткрастворуХта I-расщепленной

Д и полученный рас-. ние ночи. Лигированные ДНК составляют плазмиднойрР$21АДНК целевые плазмиды pPS 26 и pPS 26.1. Лиги- теор для реакции лигиров б кции лигирования инкубируют р Д К используютдля трансформа- при 15 С в течение ночи. ЛигированнаяДНК ции Е.со!! К12 С600,Е. colt К 12 С600/ pPS составляет целевые плазмиды рР $30 и pPS

26 и Е.coll с К12 С 600/pPS 26.1 трансфор- 30.1, которые отличаются только в отноше36

1780542

35 нии ориентации 3,7 кв Xma I рестрикционного фрагмента.

Е.coll К12 С600/рРЗ 30 и E.coll К12

С600/рР$ 30.1 трансформанты идентифицируют по их фенотипу, устойчивому к ампициллину и рестрикционным ферментным анализом их плазменной ДНК.

Плазмиды рР$30 и pPS 30,1 используют также для трансформации Cephaiosporium

acremonlum С, acremonlun (рР$30 и С.

acremonlum) pPS 30.1 трансформанты ус-. тойчивы к гидромицину, С. Окончательное конструирование плазмид pPS31 и pPS31,1.

Плазмиды pPS 31 и pPS 31.1 конструируют, а затем трансформируют в Е.coll К12

С600 и Cephalosporium acremonium за исключением того, что в.качестве исходного материала используют плазмиду pPS 29, а не плазмиду pPS21A.

Пример 11. Конструирование плазмиды pPS 27.

А. Конструирование плазмиды plT336, Около 1 мкг плазмиды pUC8 раСтворяют в 2 мкл 10Х BamHI реакционного буфера и

16 мкл HzO; Около 2 мкл (20 единиц) рестрикционного фермента BamHI добавляют к раствору плазмидной рОС8 ДНК, полученный реакционный раствор инкубйруют при

37 С в течение 2 ч. BamHI расщепленную плазмидную pUC8 ДНК осаждают, собирают центрифугированием и повторно суспендируют в 2 мкг 10Х Хва 11 реакционного буфера (1,5 M NaCI, 60 мМ Трис-НСI, рН 7,9.

60 мМ Mg Clz. 60 MM 2-меркаптоэтанола и 1 мг/мл BSA) и 16 мкл Н20. Около 2 мкл (20 единиц) рестрикционного фермента Хва II добавляют к раствору BamHI- расщепленной плазмидной pUC8 ДНК и полученный реакционный раствор инкубируют при 370С втечение 2 ч. Реакцию заканчивают, экстрагируя фенолом с последующими двумя зкстракциями хлороформом, Xaall-BamHI— расщепленную плазмидную pSM8 осаждают, собирают центрифугированйем и повторно суспендируют в 5 мкл HzO..

Около 10 мкг плазмиды р!Т355 растворяют в 10 мкл 10X BamHI реакционного буфера и 80 мкл 120. Около 5 мкл (50 единиц) каждого из рестрикционных ферментов Xho

1и BamHI добавляют к раствору плазмидной

plT355ДНК" и полученный реакционный раствор инкубируют при 37 С в течение 2 ч.

Затем реакционную смесь помещают на

1 -ный агарозный гель и проводят электрофорез до тех пор, пока 1,4 кв BamHI Хва! рестрикционный фрагмент не выделится от остальных продуктов реакции, которыми являются 5,6 кв, 1,3 кв и 0,01 кв фрагменты.

1,4 кв BamHI — Хваl рестрикционный фрагмент, который содержит сигналы окончания транскрипции мРНК полиаленилирования и процессинга IPS гена, выделяют, Получают около 2 мкг целевого продукта и его суспен5 дируют в 5 мкл Н20.

5 мкл Sall — BamHI расщепленной плаз- миды pUC8 добавляют к 2 мкл 1,4 кв

BamHI- Xho рестрикционного фрагмента плазмиды р!Т335, 3 мкл 10Х лигаэного буфе10 ра, 18 мкл Н20 и 2 мкл Т4 ДНК лигазы.

Полученный реакционный раствор инкубируют при 150С в течение ночи. Sall — Xhol перекрывания совместимы с лигированием, .но будучи один раз лигированы, ни Sall, ни

15 Xhol не будут отщеплять ДНК по соединению. Лигированная ДНК составляет целевую плазмиду р1Т336 и ее используют для трансформации Е.col! К12 RRib М15 доступной из NRRL под регистрационным номе20 ром МЯВ! В-15440. Трансформированные клетки помещают на 1-агарные пластины, содержащие 100 мкг ампициллина, 40 мкг/мл Х вЂ” gal и 40 мкг/мл IPTG. Колонии, которые не показывают синего цвета на

25 трансформированных пластинах. культивируют, используют для получения плазмидной ДНК и плазмидную ДНК анализируют рестрикционным ферментным анализом для идентификации E.coll К12 RRI

30 М15/pIT336 трансформантов.

В. Конструирование плазмиды pPS 35.

Около 2 мкг плазмиды pIT336 растворяют в 2.мкл 10Х Pstl реакционного буфера и

17 мкл HzO. Около 1 мкл (10 единиц) ре35 стрикционного фермента Pst 1 добавляют к раствору р1Т336 ДНК и полученный реакционный раствор инкубируют при 37 С в течение 2 ч. Реакцию заканчивают экстрагированием фенолом с последующими двумя

40 экстракциями хлороформом. Рзт 1 — расщепленную плазмидную plT336 ДНК осаждают, собирают центрифугированием и повторно суспендируют в 86 мкл Н20.

45 Около 10, мкл 10Х лигазного буфера и 4 мкл Т4 ДНК лигазы добавляют к раствору

Pst I — расщепленной плазмидной р1Т336

ДНК и полученный реакционный раствор инкубируют при 150С в течение. ночи. Лиги50 рованная ДНК составляет целевую плазмиду pPS 35 и ее используют для трансформации Е.coll К12 JA221, доступный из hLRRt под регистрационным номером

ЬЬВВ LB-15211. Трансформированные клет55 ки помещают на L-агарные пластины, содержащие 100 мкг/мл ампициллина. Выделяют некоторые устойчивые к ампициллину колонии и используют для получения плазмидной ДНК. Целевые Е.coll К12 JA221/pPS35 трансформанты идентифицируют рестрик1780542.5 -ATG ССТ TCC GTT CCA GTT ССЛ GTG GCC AAC CTC CCC CGA

ATC GhT GTC TCG CCC CTA TTC CGC CAT CAC AAG GAG AAG AAG

20 стс слс стл Гст ссс ссс Атс слс ссс ссл тсс ссс Глс Асл

ССС слс сст стс слс стс rcc тсс,.

CTC ТТС СЛС ATG ЛГС ATC ЛСС СЛС

CGG CCC TAC ЛЛС AAG GhG

Г сс тлс тлс стс ссс лтс ссс

ТТС TCC TAC CTG AAC CCC ТСС

ЛТС ЛЛС СЛС ССС ЛСС ССТ ЛТС

Глс Глс ссс hhr слс ссс ссс

ТТс ттт Thr. GcG GTG Алс

ТСС ГГС ГЛС ЛСС ЛЛС АЛЛ ттс ссс ссс ттс ссс слс AAG тлс TAc TGG cAc GTc TTc ccc стс тсс тсс ссс Гтс стс ссс сас тлс сст стс ссс стл Сст

30 ccc Ghc Ghr слс ттс ттс лсс ссс слс тсс ссс сст Глс лсС

ACG CTC TCG TCG GTC GT<, CTC ATC CCT TAC CCG TAC CTC GAC ссс тлс сcG Gi

AhG стс лсс

GTG TTG TRC ттГ слс TGG cAc

СЛС Т<. С СЛС G-.G

ТГC ГЛС Г r. АтС

" СГ Гс<. Лсс тлс

ССС ССС <<ТС CAC тсл стс ссс ттс

ГЛС ССС Т"С CAC

< CC < СС h in GAC

T;,л-:3

GhG CAC GTG

ChG РЛТ CTG

САС" ССТ GAC

ATG CCC CAT

CGC GTC hAA ттс GTc Ahc

ССС GCG ACC ллс ссс ссс

CGG GGC TTC

TCC CTC ЛТГ ACG

ChG GTC AAG hCC

CAC hCG ССС TTC

ATC ЛСГ GRC ГЛС

ТГС СТС ЛЛС ГЛС

CCG

CTC

ThC

GhC

CAC

GCC

GRG

С

ГЛС ССС

ATC RRC т c с.с

ССС СЛГ лсс лтс

hhG слт т iT ст"

< < С <

CTC GCC TGG GAG

GCC hhG СЛТ 4GG

RTC ТСС ТЛ< GCA

hTC AAC ЛЛG ЛЛT ционным ферментным анализом их плазмидной ДНК.

С.Окончательное конструирование плазмиды pPS 27, Около 2 мкг плазмиды pPS 35 растворяют в 2 мкл 10Х Hind III реакционного буфера и 17 мкл Н20. Около 1 мкл (10 единиц) рестрикционного фермента Hind III добавляют к раствору плазмиды pPS 35 ДНК и полученную реакционную смесь инкубируют при

37 С в течение 2 ч. Реакцию заканчивают экстрагированием фенолом с последующими двумя экстракциями хлороформом. Hind

1Il — расщепленную плазмидную ДНК, осаждают, собирают центрифугированием и повторно суспендируют в 3 мкл 10Х лигазного буфера и 23 мкл Н20. Получают около 2 мкл

2,3 кв Hind III рестрикционного фрагмента плазмиды pPS29, используя в качестве исходногоматериала плазмиду pPS29 вместо плазмиды pPS 21А; который содержит ген. придающий устойчивость к гидромицину, управляемый активирующей последовательностью IPS гена, и 2 мкл Т4 ДНК лигазы добавляют к раствору Hind lll расщепленной плазмидной pPS 35 ДНК, Полученную смесь лигируют при 15 С в течение ночи.

Лигированная ДНК составляет целевую-. плазмиду pPS27 и ее используют для трансформации Е.coll К12 JA221, Трансформанты, устойчивые к ампициллину, культивируют и используют для получения плазмидной ДН К, которую анализируют рестрикционным ферментным анализом для идентификации целевых Е. слс Глс ллс Tcr слс стс ссс слс слс тсс chr лтс С<.с ссс

25 GGc ллс ллс с< с стс GAA тсс

ТТС AGC ССЛ СЛС СР<С CCG ССР

CAC СЛГ CTC AAC GTC ТГС CCG

coll К12 JA221/pPS 27 трансформантов.

Только одна ориентация вставленного

3.45 кв Hind ill рестрикционногофрагмента приводит к получению целевой плазмиды

5 pPS 27.

Плазмиды pPS 27 трансформируют

Cephalosporium acremonlun в фенотип, устойчивый к гидромицину с высокой частотой.

10 Формула изобретения.

1. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pPS 20, кодирующей изопенициллин-N-синтетазу, заключающийся в том. что осуществляют

15 инкубирование рестрикционного фрагмента Hind ill размером 2,5 кв плазмиды plT221

Hind III фрагмента плазмиды plT335 и ДНК вЂ” лигазы в 50 мм трис - HCI рН 7,8 С10 мМ

MgCIz, 20 MM ДТТ, 10 мм АТФ и 1 Mr/Më

20 БСО при 15 С до завершения реакции лигирования, трансформацию полученными

ДНК штаммов бактерий Escherichia соП с последующим отбором клонов, содержащих целевую плазмиду.

25 2. Способ получения штамма

Cephalosporium acremonium. обладающего активностью изопенициллин-N- синтетазы. заключающийся в том, что осуществляют трансформацию С.acremonium А ТСС 11550

30 плазмидой pPS20, причем трансформирующая плазмида содержит рестрикционный фрагмент Nco1 = BamK1 размером 1,5 кв плазмиды plT 335, кодирующей изопенициллин-Nсинтетазу, при этом кодирующая нить ДНК

35 последовательности представляет собой:

1780542

40

Активность йзопенициллин-N-синтетаз из клеточных экстрактов из Е.coll К12

P V308/pIT337

Об азе

Разме зоны мм

2 мкг пенициллина N стандарт

5 мкг пенициллина N стандарт

10 мкг пенициллина N стандарт

20 мкг пенициллина N стандарт

25 мкл клеточного экстракта Е.

coll К12 PV308/plT337

50 мкл клеточного экстракта E.coll

К12 РЧ308/pIT337

100 мкл клеточного экстракта Е.coll К12 PV308/р! Т337

150 мкл клеточного экстракта Е,coll. К12 PV308/plT337

Все обработанные пенициллином образцы

Контроль клеточный экстракт E.coll

К12 РЧ308/pCZ106

Конт ольная еак ия без с бст ата

16

18

27

10

27

29

О

Составитель H. Кузен кова

Техред М.Моргентал Корректор О.Кравцова

Редактор

Заказ 4445; Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета поизобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул, Гагарина, 101

-с-последующим культивированием трансФор- среде с триптиказосоевым агаром и гигроо мированной клетки-реципиента при 25 С. на мицином в концентрации 100 мкг/MR,