Способ получения трансгенных растений табака, устойчивых к вирусу табачной мозаики

 

Использование: в сельском хозяйстве при выращивании табака. Сущность изобретения заключается в том, что в ген растений табака вводят ген а -интерферона человека под контролем промотора вируса мозаики цветной капусты в растения N. tabacum с помощью генетической трансформации растений методом листовых дисков плазмидой pGv 2260, регенерации на селективной среде растений, экспрессирующих человеческий интерферон, и определяют устойчивость трансгенных растений к вирусу табачной мозаики.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) (s1)s С 12 N 15/83

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР ) ОПИСАНИ ИЗОБРЕТЕНИЯ .-,",.".. ;.:,:.

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

6 (21) 4908438/13 (22) 27.12.90 (46) 23.12.92. Бюл. М 47 (71) Институт общей генетики им. Н.И.8авилова (72) С.П.Смирнов, Л.В.Крашенинникова и

В.А.Пухальский (56) Science, 1986, v.232, р.738-743.

Proc. Nat. Acad. Sci.. 1982, v.79, р.22782280. (54) СПОСОБ ПОЛУ"1ЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ

РАСТЕНИЙ ТАБАКА, УСТОЙЧИВЫХ К ВИРУСУ ТАБАЧНОЙ МОЗАИКИ

Изобретение относится к генетической инженерии и может быть использовано в сельском хозяйстве при выращивании табака. Известны методы получения устойчивых к вирусу табачной мозаики (ВТМ) растений табака путем скрещивания чувствительных к ВТМ сортов с устойчивыми видами табака, Однако при этом имеет место случайное наследование различных генов обоих родителей у потомства и теряются выгодные со° четания генов, влияющих на ценность того или иного сорта. Этого недостатка лишен метод введения в растения генов путем генетической трансформации, поскольку в этом случае в растение передается лишь небольшая последовательность ДНК, включающая один или несколько генов и не нарушающая генетического баланса растения.

Другим важным преимуществом этого метода является возможность введения в растение генов из чужеродных организмов, с которыми невозможно осуществить поло(57) Использование: в сельском хозяйстве при выращивании табака. Сущность изобретения заключается в том, что в ген растений табака вводят ген Q -интерферона человека под контролем промотора вируса мозаики цветной капусты в растения N. tabacum c помощью генетической трансформации растений методом лйстовых дисков плазмидай pGv 2260, регенерации на селективной среде растений, экспрессирующих человеческий интерферон, и определяют устойчивость трансгенных растений к вирусу. табачной мозайки. вое скрещивание. И наконец, эти гены можно вводить в растение в составе таких векторов, которые обеспечивают требуемую интенсивность и регуляцию экспрессии вводимого гена. Описан способ получения трансгенных растений табака, устойчивых к

ВТМ, основанный на введении в растительный геном гена, кодирующего белок оболочки данного вируса, подставленного под контро-, ля сильного растительного промотора.

Однако, данный способ не обеспечивает полной защиты от вируса, а дает лишь задержку в появлении симптомов вирусного заболевания при заражении ВТМ, и, кроме того, защитный эффект в этом случае наблюдается лишь при низкой концентрации вируса, осуществляющего заражение.

Описано защитное действие на растения человеческого интерферона в отношении ряда вирусов, в том числе и BTM.

Однако оно было показано лишь для случая экзогенной обработки интерфероном растений.

1782991

40 устойчивость в ВТМ

Цель изобретения — получение трансгенных растений табака, Устайчивых к вирусу табачной мозаики.

Способ предлагает введение гена рекомбинантного а-интерферона человека под контролем промотора вируса мозаики цветной капусты в растения К. tabacum c помощью генетической трансформации растений методом листовых дисков, регенерации на селективной среде растений, зкспрессирующих человеческий интерферон,.и определение устойчивости трансгенных растений к вирусу табачной мозаики, r} р и м е р. Для трансформации растений й. tabacum используют штаммы

АдгоЬасыг}аа тшпетас}епз С158 ВЯ содержащие "разоруженную" Ti-плазмиду . pGV2260, интегрированную с рекомбинантной плазмидой pST20. Плазмида pST20 представляет собой экспрессианный вектор pST6 со встроенным: в экспрессианную кассету пад контроль промотара 35Я вируса мозаики цветной капусты гена рекамбинантного а -интерферана человека.

Вектор содержит также ген неомицинфасфотрансферазы 11, обусловливающий устойчивость трансформированных растений к канамицину. Трансформаци о растений табака осуществляют методом листовых дисков следующим образом. Бактерии, выращенные в минимальной среде А (1 0,5 r/ë

КгНРОд, 4,5 г/л KH2PG<, 10 г/л (КНа)г$0, 0,5 г/л цитрат натрия — 2НгО, 0,5% гл аказы). разводят средой RMNG до плотности

10 кл/мл и погружак>т в полученную суспензию кусочки листьев табака сорта Самсун; выращенного в асептических условиях„на 3 мин, Кусочки листьев промокают фильтровальнай бумагой и переносят на среду для органогенеза и . инкубируют в светотроне 3 недели, Высшие побеги осторожно вырезают и помещают на среду для укоренения и инкубируют еще 3 недели да укоренения побегов.

Укоренившиеся на селективной среде с канамицином растения табака проверяют биохимйческими методами на наличие и зкспрессию гена интерферона. Присутствие вставки гена интерферона устанавливают методом дот-гибридизации. Тотальную

ДНК, выделенную из растений, денатурлруют и HBHocs!T на нитрацеллюлозный фильтр, . после чего проводят иммобилизаци о ДНК на фильтре и гибридизацию с Р-меченной зг

ДНК гена интерферона. Растения, дающие гибридизационный сигнал, содержат вставку гена интерферана.

Транскрипцию гена интерферона в растениях определяют методам ноузерн-гибри5 дизации, Тотальную РНК выделяют из трансгенных растений, фракционируют в денатурирующем агарозном геле с формальдегидам, пе}>еносят на нитооиеллюлозный фильтр и гибридизуют с )

10 "гР-меченной ДНК гена интерферана. О транскрипции гена интерферона судят по появлению зоны гибридизации, соответствующей молекулам PHK с размерам 0,95 т.о.

8 случае контрольных растений табака, не подвергавшихся трансформации, гибридизация с ДНК гена интерферана не наблюдается.

Синтез интерферана в трайсгенных растениях устанавливают с помощью метода иммунафиаоресценции. Используют монокланальные антитела против лейкоцитарного интерферона человека. Препараты готовят из листьев, растирая их в ступке и зкстрагирук>т буферам {25 мМ трис-НС! рН8,35; 195 мМ глицин). Препараты центрифугируют, 5 мин при 12000 аб/мин, к супернанту добавляют зтанол до конечной концентрации 20% и пропускают через нитрацеллюлозный фильтр. Проводят реакцию с монаклональными антителами против лейкацитарнага интерферана человека, промыва ат фильтр и осуществляют реакцию с меченными антителами против }gG мыши.

Фильтры освещают длинновалновым УФсветам и фотографиру от через зеленый светафильтр. При продукции растениями интерферана наблюдается свечение препаратов под УФ-светом. Растения, продуцирун>щие интерферон, исследуют на.У растений в возрасте 2-3 мес берут листья и инфицируют их ВТМ втирая суспензию вируса в концентрации 1 мкгlмл в .

100 мкл фосфатного буфера рН7,5 стеклянным шпателем в лист. Через 10 мин поверхнасть листа промывают дистиллированной водой, промокают фильтровальной бумагой и помещают во влажную камеру в темноте в подвешенном состоянии, где инкубируют 3е сут при 25 С. В.качестве контрольных берут растенйя N. tabacum сорта Самсун, дающих системную инфекцию при зара>кении ВТМ, и гибрида Терновского, образующих локальные некрозы при инфекции ВТМ.

Через 3-е сут на устойчивых к 8IM листьях табака гибрида Терновского образуются четкие лакал ьныенекрозы, в то время как на . листьях чувствительного к ВТМ табака сорта

Самсун некрозов не наблюдается. Листья трансгенных растений табака сорта Самсун, 1782991

Составитель Т. Забойкина

Техред M.Mîðråíòàë . Корректор M. Шароши

Редактор

Заказ 4490 Тираж . Подписное

БНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4Я

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул Гагарина, 101 зкспрессирующие лейкоцитарный интерферон человека, при заражении BTM образуют локальные некрозы, похожие на некрозы, возникающие на листьях табака гибрида Терновского. Реакция локальной некротизации у трансгенных растений свидетельствуют об усилении активирусной защиты у данных растений. Введение и экспрессия гена лейкоцитарного интерферона человека в растения N. tabacum, чувствительных к

ВТМ, приводит к индукции устойчивости к данному вирусу.

Формула изобретения:

Способ получения трансгенных растений табака. устойчивых к вирусу табачной мозаики, предусматривающий трансформацию растительного материала, регенерацию его

5 на селективной среде, укоренение и выращивание побегов, о т л и ч à ю шийся тем, что, с целью повышения устойчивости растений табака, в качестве растительного материала используют листовые диски табака, .

10 а трансформацию проводят с помощью агробактерий, несущих плазмиду pGV2260 с геном интерферонэ человека,