Способ определения стресс-реакции

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ. СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4489405/14 (22) 03.10.88 (46) 23.12 ;92. Бюл. В 47 (71) Свердловский государственный медицинский институт (72) О.Г.Макеев, И.ВЯсырева и А,В.Коротков (56) Авторское свидетельство СССР

N 1293651, кл. G 01 N 33/58, опублик, 1987. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТРЕСС-РЕАКЦИИ (57) Использование: физиология, медицина.

Целью изобретения является повышение точ((остИ способа. Сущность изобретения: в

Изобретение относится к медицийе и физиолотии, а именно к методам исследования эритроцитарных транспортных систем.

Известны способы оценки стресс-реакции путем определения объема кровотока через -голбвной мозг и константы скорости потребления кислорода тканями мозга, анализа электрокардиограммы.

Наиболее близким к изобретению является способ определения реакции организма на воздействие стрессорных факторов, основанный на определении в крови кислой фосфатазы, катепсина Д и щелочной фосфатазы в периоды относительного функционального покоя и действия стрессора. При повышении активности ферментов в условиях стресса менее чем на 20% устанавливают нормальную реакцию организма, а при увеличении более чем íà 20% — патологическую реакцию, (s1)s G 01 N 33/58, А 61 К 47/00 качестве инкубационой среды эритроцитов с мечеными биологически активными веществами (БАВ) используется околоклеточная среда органов и тканей, в которых происходит эритроцитарный обмен БАВ. При этом околоклеточная среда, взаимодействуя с эритроцитами, вызывает отсоединение

БАВ, активно используемых тканями (и недостаток которых имеется в среде), и присоединение к эритроцита(и БАВ, имеющихся в околоклеточной среде в избытке, что моделирует условия обмена БАВ в тканях. По окончании инкубации эритроциты отмывают от инкубационной среды и радиометрируют. 5 табл.

Недостатком способа является низкая ф точность оценки. Последнее обусловлено широкими пределами колебания концентрации ферментов в зависимости от возраста, режима питания, наличия заболеваний, 4 в том числе хронических, групп крови (Кли- . ОО . ническая оценка лабораторных тестов/Под (д . ред, Н,У.Тица. M. Медицина, 480 с).,фЬ.

Целью изобретения является повыше- ф, ние точности способа. С>

Цель достигается тем, что в способе, включающем исследование биологически активных веществ (EAB) крови, эритроциты помещают в биологические жидкости организма, в которые дополнительно вносят меченые БАВ, и при определении отношения приращения связыванйя с эритроцитами

БАВ менее 0,63 устанавливают начальную стадию стресс-реакции, а при значении более 1,37 устанавливают стадию поврежде ния клеточныхмембран.

1783440

Увеличение точности способа происходит за счет того, что начальная стадия стресс-реакции, сопровождающаяся изменением состава и свойств биологических жидкостей, вызывает снижение взаимодействия эритроциты-меченые БАВ, а развитие . стресс-реакции, сопровождающееся повреждением клеточных мембран (повреждение липидного бислоя); приводит к повышению взаимодействия эритроциты— меченые БАВ (в результате увеличения неспецифического компонента взаимодействия).

В осуществлении способа используются БАВ, принимающие активное участие в процессах адаптации и компенсации повреждения — кортикостероиды и простагландин Ez (ПГЕр).

Способ осуществляется следующим образом.

На 1 этапе определяют характеристики эритроцитов и сыворотки интактных доноров. Эритроциты получают посредством центрифугирования интактных доноров.

Эритроциты получают посредством центрифугирования стабилизированной крови и помещают в 0,4 мл биологической жидкости (сыворотки, околоклеточной жидкости), полученной от интактных доноров, в которую внесены меченые кортикостероиды и ПГЕ в концентрациях 10 -10 моль для ПГЕ и кортикостероиды и 10 "o-10 моль. Основное требование при проведении этого этапа — предварительное тестирование крови людей по системе АВО. Спустя 30 мин инкубации этой смеси при 37 С эритроциты отмывают от несвязанного лиганда на миллипоровых фильтрах. Фильтры высушивают и радиометрируют в простом толуоловом сцинтилляторе, На основайии полученных данных строят график зависимости количества связавшегося вещества (ось ординат) от концентрации внесенного в инкубационную среду (ось абсцисс).

На построенном графике определяют место перегиба, необходимость выявления

"которого обусловлена тем, что этой точке соответствует насыщение специфических к данному радиолиганду участков связывания. Дальнейшее связывание (после насыщения специфических участков) обусловлено неспецифическими процессами (липофильностью и гидрофобностью

БАВ), химическими и физическими свойствами мембраны.

Таким образом, смещение точки перегиба свидетельствует об изменении концентрации данного БАВ в окружающей клетку среде, которое вступает в конкуренцию с меченым аналогом за места специфического связывания. Полученная концентрация и превышающая ее на порядок- в дальнейшем используются для оценки стадии стресс-реакции. Дополнительная концентрация (на

5 порядок большая) необходима для оценки неспецифического связывания, которое в основном зависит от химического состава мембран, и=меняющегося под действием стресса.

10 Эритроциты и сыворотку, исследованные на 1 этапе, сохраняют в течение 2-3 недель при I-4 С и используют по мере необходимости на 2 этапе. Экспериментальным путем определено, что исследованные

15 показатели при хранении в этих условиях в течение 3 недель не изменяются.

Проведением 1 этапа(определение концентрации радиолиганда) достигается существенное повышение точности оценки

20 стресс-реакции благодаря исключению погрешностей; связанных с индивидуальными особенностями доноров и качеством использованных в работе реактивов.

На 2 этапе готовят 2 серии инкубацион25 ных культур:

1 серия — эритроциты здоровых доноров (заготовлены на 1 этапе), биологическая жидкость обследуемых;

2 серия — эритроциты обследуемых, би30 ологическая.жидкость здоровых доноров (заготовлена на 1 этапе).

В каждой серии исследуется связывание с эритроцитами меченых ПГЕ и кортизола (кортикостерона у лабораторных

35 животных, что обусловлено особенностями их эндокринной регуляции) в концентраци- ях, определенных на 1 этапе, которые добавляются в среде перед внесением эритроцитов. Режимы инкубации и последу40 ющей радиометрии аналогичны 1 этапу. На основании пОлученных данных рассчитывают отношение приращений связывания лигандов в 1 и 2 сериях по отношению приращений связывания лигандов, пол45 ученных на 1 этапе(эритроциты и сыворотка интактных доноров). При возрастании концентрации меченого БАВ, в среде инкубации на порядок определяют разницу отношений приращений для двух концент50 раций в 1 и 2 сериях, Выявляют вещество, для которого эта величина окажется наименьшей, и на основании этого производят оценку стадии стресс-реакции. Выполнение подобной процедуры приводит к некоторо55 му загрублению метода, однако подобный подход оправдан, так как позволяет снизить влияние случайных факторов на результат, что ведет к повышению точности способа (Горелик Л.А. и др. Методы распознавания.

M.: Высшая школа, 1989, с. 99-111), 1783440

Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1, Возраст обследуемых от

20 до 50 лет. По предлагаемому способу обследовано 120 рабочих. " — 5

Первый этап исследования. Кров здоровых доноров получали со станции перелива ния крови. Полученную кровь тестировали по системе АБО и резус-фактору. Эритроциты из цельной крови получали центрифуги- 10 рованиеми (3,5 тыс. об/мин, 15 мин), дважды отмывали раствороМ Хенкса при тех же ре-"

>кимах центрифугирования, Отмытые эрит- роциты суспендировалй в растворе Хенкса по 25 10 клеток в 50 мкл среды, заливали 15 их в пластмассовйе трубы и для хранейия помещалй в холодильник при 1-4 С.

Сыворотку крови от здоровых донбров фильтровали через миллипоровые фильтры с величиной пор 220 нм и помещали в пла - 20 стмассовые трубы в холодильник при 1-4 С, . На 1 этапе сыворотку крови здоровых доноров в объеме 400 мкл помещали в полистироловые-платы, в которые вносйли меченные по тритию и углеродулиганды(5, 25

6, 8, 11, 12; 14, 15зН-простагландин Е2 фйрмы Амершам, молярная активность — 6,48

ТБк/ммоль) в объеме 50 мкл физраствбра до конечных:Концентраций 500 мкл инкубационной среды"10 11, 2 10 11, 4 10 ", 8 10 ", 30

10 "2,:2 10""o 4 10 "o 8 10 10 моль и

4" С-кортизол (молярная активность 1,8

ТБк/моль, CCCP) в объеме 50 мкл до конечных концентраций 10, 2 10 4 10 ", 8

10", 10, 2 ° 10, 4 10, 8 10, 10 моль 35 по три пробы каждой концентрации, Процедура разведенйя" на примере разведения ПГЕ2.

Удельная радиоактивность ПГЕ2 ito пас- . порту составляет 6,48 ТБк/ммоль, объем- 40 ная радиоактивность флакона по паспорту

-3,7 МБк/мл. Радиоактивность фасовки

1,85 МБк. Следовательно, для вычисления обьема растворителя, в котором поставля45 ется ПГЕ2, необходимо общую активность фасовки разделить на объемную радиоактивность (1,85 МБк;3, 7 МБк/мл=0,5 мл или

500 мкл). Для оп ределеиия количества ве- щества, находящегося в фасовке, общую радиоаКтивность фасовки разделяют на 50 удельную радиоактивность. вещества (1 85"

М Бк:6,48 ТБкlммоль = 0,285 10 ммоль или

0,285 10 моль), Такйм образом; имеется 0,285 10 моль ПГЕ2, растворенного в 500 мкл абсо- 55 лютного этанола (растворитель поставки), Необходимо в инкубационной среде с общим объемом 0,5 мл соз„ать концентрацию ПГЕ2

10 моль (примр), 1 онцентрация 10 М соответствует 10 M в 1 мл или 0,5 10 в

0,5 мл, Для решения атой пропорции 0,5 .10 " М х 500 мкл: 0,285 10 М=8,75 мкл, Следовательно, 0,5 10 М ПГЕ2 содержится в 8,75 10 мкл. Необходимо взять 87 5 мкл и развести в 10 раз. Разь бдение осуществляется поэтапно, На 1 этапе 8,75 мкл исходного раствора "разводят 500,0 мкл физраствора, 50 мкл полученного раствора разводят в 0,450 мл физраствора (разведение в 100 раз). При разведении 50 мкл последнего раствора в 450 мкл среды получают конечную концентрацию (разведение в 10 раз) в инкубационной среде, содержа цгй

cbIBopoTK>t, эритроциты N ПГЕ2.

По той же схеме рассчитывают другие концентрации.

Радиоактивность полученных концентраций рассчитывают по формуле: количество вещества, умноженное на уд. радиоактивность вещества (0,5 10 " x6,48x10

Бк/мол ь=32,4 Бк), Следуетотметить что 10 " моль вещества соответствует 10 (число

Авогардо)х10 = 10 молекул; таким образом, в 0,5 мл инкубационной среды с концентрацией ПГЕ2 10 моль содержится 10 молекул ПГЕ2.

Расчет радиоактивности используют при проведении очистки ПГЕ2 на колонке, заполненной кремниевой кислотой (БИР

РЕД, США), смесью 0,04 обьемных долей метанола и 0,96 обьемных долей хлороформа с последующим упариванием и разведением в абсолютном этаноле. В последнем случае пересчитывают на выход с колонки (65% — х0, 65).

В каждую ячейку платы заливают 25 10 эритроцитов (к уже залитым сыворотке и меченому лиганду) в объеме 50 мкл и помещают в термостат при 37 С.

После.инкубации клетки осаждают на миллипоровые фильтры (450 нм) и отмывают

25-KpBTHblMt t о5ьемами физраствора, содержащего немеченые лиганды (десятикратно превышающие по концентрации использованные). Фильтры высушивают и радиометрируют в простом толуоловом сцинтиллятаре на сцинтилляционном счетчике Бета-2 (эффективность счета по Н— з

57,5%, по С вЂ” 97%) °

Данные представлены в табл.1.

На основании таблицы строили график зависимости количества связавшегося вещества (ось ординат) от концентрации, внесенной в среду инкубации (ось абсцисс) для донора С., 28 лет, Ш rp. крови, резус+.

На построенном графике определяли место перегиба(для ПГЕ2 — 0,9 10 М, для кортизола — 10 М).

1783440

Полученные таким образом результаты являются контрольными для обследуемых, . имеющих группу крови Ill и резус+, На 2 этапе исследования у обследуемых также получали эритроциты крови (3-кратной отмывкой центрифугированием 3.5 тыс. об/мин, 15 мин), стабилизированной гепарином или цитратом венозной крови, и сыворотку(отстаиванием при 4 С в течение 2 ч и последующим центрифугированием 3,5 тыс.об/мин, 15 мин) нестабилизированной венозной крови, Полученную от пациентов кровь тестировали по системе АВ0 и по наличию в крови резус-фактора. При определении И! группы крови и резуса + использовали для проведения реакции эритроциты и сыворотку здорового донора С. Кровь обследуемых с иной группой исследовали с эритроцитами и сывороткой здоровых доноров соответствующей группы крови. . Сыворотку крови рабочего IT,(26 лет, стаж работы 1 год, оператор), имеющего Ш группу крови и резус + в объеме 0.4 мл, заливали в 12 ячеек пластиковых плат (объем ячейки 1,5 мл) и приливали меченый ПГЕ2 в концентрациях, определенных на 1 этапе (0,9 101О-точка перегиба и0,9 109 — в10 раз большая), в 6 ячеек и меченый кортизол (10 9 и 10 моль) в 6 ячеек по 3 на каждую концентрацию, В следующие.12 ячеек заливали сыворотку здорового донора С., в которые аналогичным образом и в тех же концентрациях приливали меченые лиганды (но 3 на каждую концентрацию), Лолистироловые платы разогревали в термостате втечение 5мин(37 С) ив заполненные ячейки вносили эритроциты; в сыворотку крови обследуемого П. —. по 25 10 клеток здорового донора С. в объеме 50 мкл и в сыворотку крови здорового донора С.—

25.10 эритроцитов обследуемого П. (50

6 мкл).

После 30-минутной инкубации при 37 С эритроциты осаждали на фильтры с величиной пор 450 нм, отмывали 25-кратным объемом физиологического раствора, содержащим в избытке немеченые лиганды..

Фильтры подсушивали и помещали в специальные контейнеры, в которых доставляли в лабораторию СГМИ, где радиометрировэли .на счетчике БЕТА-2. На основании полученных данных составлена табл.2.

Пример расчета поданным рабочего П.;

Хопцт 701,1 — 662,2 0 4

Хконтроль 740 — 643,0 где 0,4 —. отношение приращений связывания ПГЕ2 с эритроцитами донора С. при инкубации с сывороткой донора D. По отношению к приращению связывания ПГЕ2 с . эритроцитами донора С, при их инкубации с сывороткой донора С. (Хоп/Хконтр).

Хопыт 736 - 585,51

Хконтр 737,1 — 592,4

- 1,04, (см. табл.1)

10 где 1,04 — отношенйе приращений связывэния кортизола с эритроцитами обследуемого Il. при инкубации в сыворотке донора С. по отношению к приращению связывания кортизола с,эритроцитами донора С. при их

15 инкубации с сывороткой донора С, Как следует из полученных данных, в маибрльшей степени изменяется связыва, ние МГЕ2; поэтому, с целью повышения достоверности, "анализ следует проводить по

20 данным изменения связывания кортизолэ.

Достоверные отличия связывания кортизола получены при инкубации эритроцитов донора С. с сывороткой рабочего П (отношение приращений менее 0,63); следо25 вательно, сыворотка обследуемого П. оказывает ингибирующее действие ма связывание меченого кортизола, что обусловлено избытком немеченого кортизолэ в сыворотке П. Возрастание концентрации

30 кортизола в сыворотке характерно для начальной стадии стресс-реакции.

Таким образом, обследуемый П. нахо дится в начальной стадии стресс-реакции.

На основании проведенных исследовэ35 мий составлена диагностическая таблица, использование которой значительно упрощает диагностическую процедуру (Ta6n.3).

Пример 2. 1 пациент К., 23 года, 1 производство. слесарь КИП, стаж работы 3

40 года.

2 пациент, Il„38 лет, оператор, стаж работы 3 года. . 3 пациент C„24 года, оператор, стаж работы 4 года.

45 Результаты представлены в табл.4, Как следует из данных, полученных при

: исследовании по заявляемому способу 1 па- . циента (К), наименьшей разницей отношений приращений связывания обладает

50 меченый ПГЕ2; следовательно, для повышения точности диагностики стадии стресс-реакции целесообразно использоватьдэнмые, полученные при инкубации эритроцитов с

ПГЕ2. Во всех случаях отношение прираще55 ний связывания находится в пределах 0,631,37. Следовательно, стресс-реакция отсутствует.

При обследовании пациента К. по прототипу обнаружено значительное (на 48 ) 1783440

Пример 3. В эксперименте использо-, вали мышей линии СВА в количестве 40

5 (самцы, возраст 5-6 месяцев, масса 18-22 г).

В ходе эксперимента животных разделяли на 2 группы, у одной из которых вызывали развитие стресс-реакции путем обездвиживания в плексиглазовых трубах в

0 течение 8 ч, другую содержали в обычных условиях (по 20 животных в каждой группе).

S ходе эксперимента использовали метод слепого контроля, состоящий в том, что до конца исследования принадлежность живо5 тного к той или иной группе была неизвестна.

В связи с выполнением эксперимента на животных в методику исследований были внесены следующие изменения:

1) получение крови и сыворотки производили декапитацией животных;

2) групповая совместимость крови не оценивалась, так как была обеспечена генетической идентичностью линии животных;

3) в исследовании вместо "4Ñ-кортизола был использован Н-кортикостерон (1, 2„ 6, з

T Н4-кортикостерон, молярная активность з

2720 ТБк/моль), что связано с особенностью их нефроэндокринной регуляции.

4. Для оценки концентрации ферментов были использованы методические приемы, позволяющие исследовать активность ферментов в микроколичествах крови.

5. Количество добавляемой в платы сыворотки составляло 100 мкл, а меченые лиганды вносились в объеме 10 мкл.

6. Ввиду малого количества сыворотки, получаемой от.животных, на 2 этапе исследования проводили в 2 повторностях, по каждой концентрации меченого БАВ.

% увеличение кислой и щелочной фосфатаз, что, согласно прототипу, расценивается как наличие стресс-реакции. Противоречие диагностики нашло объяснение в том, что у обследуемого К. при клиническом и лабо- 5 раторном исследовании выявлен хронический, вялотекущий пиелонефрит, сопровождающийся нарастанием активности ферментов крови;

При обследовании пациента П, наи- 10 меньшей разницей отношений приращений обладает кортиэол, поэтому анализировали связывание эритроцитами кортиэола. Изменение связывания кортиэола с эритроцитами донора С. при их инкубации.с 15 сывороткой пациента П меньше порогового значения (0.63), в то же время изменение связывания кортиэола при инкубации эритроцитов пациента П. с сывороткой здорового донора С. не превышает пороговое 20 значение (1,37).

Следовательно, пациент П. находится в стадии тревоги. Анализ активности ферментов по прототипу показал повышение активности ферментов на 16,3, что долж- 2 но рассматриваться как отсутствие стрессреакции. Однако при клиническом обследовании данного пациента обнаружена анемия неясной этилогии (эритроциты—

3,6 Тлитр, гемоглобин — 92 Глитр), провале- 3 нием которой является снижение активности исследуемых ферментов.

Анализ данных, полученных при исследовании крови пациента С., продемонстрировал, что с.целью большей достоверности 3 следует иСпольэовать данные по связыванию ПУЕ2; Оценка этих параметров показывает, что отношение приращений связывания ПГЕ2 с эритроцитами обследуемого С. при инкубации последних в интак- 40 тной сыворотке превышает порог 1,37, что свидетельствует о наличии повреждения клеточных мембран. Важно отметить, что у данного пациента при клиническом исследовании не выявлено соматической патоло- 45 гии, активность ферментов свидетельствует о наличии стресс-реакции (возрастание. ак-: тивности на 61,2 ), Последнее совпадает. с данными, полученными по данному способу. Подтверждением адекватности диагно- 50 стики является то, что исследование проведено сразу после ликвидации аварийной ситуации, связанной с выбросом сернистого газа, и работы в средствах индивидуальной защиты (близкие показате- 55 ли в тот день были получены и у других пациентов).

Следует отметить, что среди обследовэнныхлиц клинически выявлено в 52 случаев обострение хронических заболеваний или вновь возникших заболеваний, в патогенезе которых важное место занимает стресс-реакция (язвеннэя болезнь желудка и 12-перстной кишки, гипертоническая болезнь, астено-вегетативный синдром и др.).

В эту группу вошло 32 человека, оцененных кэк находящихся в стадиях стресс-реакции, и 31 человек — в стадии покоя по методу, изложенному в прототипе. В то же время в данную группу (63 человека) вошло 60 чело-. век, у которых обнаружена та или иная стадия стресс-реакции, и 3 человека, состояние которых расценивалось, как состояние покоя по заявляемому способу. Таким образом, ошибочный диагноз по прототипу был вынесен в 31 случае. или в 49,2 По предлагаемому способу ошибочное заключение было сделано в 3 случаях, или в 4,7 .

Следовательно, повышение точности заявляемого способа по сравнению с прототипом составляет 44,5 .

1783440. Данные для поСтроения кривой зави чества веществ, внесенных

28 лет, III гр.крови, рез средних значениях по 3 пр

»й »»»»»»»«»» »<»<<"»Й<<й »»» »»й»»й»й».. ПРо<стагланди»н Ег . Кортизол

«<

° <ъ «<а»йм»» «« »» <»<»»»

Концентрация в среде„пмоль

{моль) ««»«««««»»

Количество

ЛГИ, свЯ" ванного с

25 !0 эритроцитов, смоль

Концентрация в среде пмоль, (моль) Количество кортизола, связанно» го с 25 10 *"" зритроцЫтов„" фмол ь:„.., - -.:,=: - ;:.:. ;,:::, -,.>:< ж:., Радиоактивность "свя" занной с

25<10 зрит-:

6 роцитов < 6.<<< < кок

Радиоактив" ность свя ванной с

25 10 зрит"

6 роцитов метки,. кБк

10 (10 t!) го

1оо (1o >и)

1000 (1о м) 0,15

0,81

2,15

3,34

4,17

4,36

4,53

4,69

4,79!

00 (1О И)

4оо :

8о0

1000 (1О !!)

4аоо

1оооа (1î !!) 1»б»,6",, 97,9 "

251,4

414,6

592,

646,8

611,1 "

737,1

23<3

124,7

331,1

643, 5

672,1

699,8

723,9

740,3

0,029 о,176- 0,452 а,75 .

1,07

1,16

1,09

1 29

1,32

l>k " < < < !<- " < 1 " <»< <»

< < <»

;:- Л..

< <

<,<- ъ <<<» и <.л<м>л<ъ « ll»,"«!

< ь<«

На 1 этапе были определены рабочие концентрации меченых БАВ (ПГЕ2 и кортикостерона), которые для мышей линии CBA " составили 1,9 10 "0M, 1,9 10 9 M и 0,8 10

M соответственно, - - - - 5

Данные представлены в табл.5.

Выбрав БАВ с наименьшей разницей отношений приращений, Которйм в том и другом случае является кортико»СЖфбн,« и< сравнив отношенйя приращений кбртико- 10 стерона в диагностической таблице, можно придти к заключению; что животйое N. 17 находится в начальной стадии стрес&реак- ции — в стадии треноги, а животное М 28 - в- стадии покоя. Между тем актИ»вно»с»ть» фер- 16

МЕНТОВ, ОПрЕдЕЛЕНййХ В СООтВЕтст» Влйй С»Пратотипом, по" отйо шению к""ко! !тролю составило 16 и 14% соответств<е<й»!ло," что rio -" " зволяет квалифициронать"Йх с<осТоянйе как состояние покоя. : " - . 20

Расшифровка протоколов пок»а<злаЛа, члтол животное М 17 отнОсится к группЕ сй1киванием стресс-реак- цией, животное М 28 — как интактное, Таким обр»азом,< r1ри диагйос<тйке состо- 25 яния животного К. 17 по методу, изло>кенному в прототипе, допущейа ошибка,"""Анализ данных всего зкс»пер»йме1-!та показал, что ошибочное решение при илсполь-" эл эовании способа, взятого за прототип, принято в 18% случаев, а при использовании предл<агаем»ого способа — в 5% случаен; следбвательйо, й>овыш»ение точности оценки. стадйи с<тр<6с»с< -ре»акции по предлагаемому. способу составляет. 13%, чтр, однако, существенно йй>Ке, чем при обследовании людей.

Г!одобн»ы»й диссонанс .объясняется тем, . что в< отлич»ие"от обследованных людей в .. эксперименте использовали генетически йдейтичн<ьВ, "зайедомо здоровых, содержащихся в оди!лаковых условиях лабораторных животных, что в реальной ситуациийри, обследон>а<йли»й людей практиче<ски исключено, Формула изобретения

Способ определения стресс-реакций,; вклачающий регистра»ци!о уровня биологи-, чески а<кт<йвных веществ (БАВ) в,крови об-. следуемоглб,"о т л и ч а и щ и и с.я тем, что, с целью riîâûøåíèë точности способа, эрит- роциты доноров и обследуемого помещают в биологические жидкости обследуемого, в-которые предварительно вносят меченые

БАВ; регистриру!от уровень приращения . связывания БАВ с эритроцитами обследуе-:. мого, и при его значении менее 0,63 устанав-: .. лива!от !!алйч<йе стресс-реакции....

Таблица1 сй!лости< связы<в»атыйя< ПГЕ2 и кортизола от коли" в среду инкубации (здоровыГл до!лор О., ус +). Радиоактивность представлен<а< з " " = " - " обам

1783440

Табли ча 2

Данные, полученные при обследовании рабочего П. по заявляемому способу

-ь

Связывание С-кортизола

Связывание зН-ПГЕ

Показатели и характеристики

Эритроц. донора С

+сыворотка обслед.П.

Эритроц. обслед.П

+сыаорот ка донора С

Показатели и херактеристики

Эритроц.

П.+сывоЭтироц. донора

С.+сыворотка обслед.П. ротка донора С. ф»

0,9 ° 10

ПГЕЕ

Фиоль (v) 10 П кор.ф тизол в фноль

620,48 фиоль

585,51

662,2

Фмоль

653 ° 05

Фмоль (Ч) (.0,9 ° 10 10 11 кор» 707 ° 3 736,0

ПГЕХ в . 701,1 784,4 тизол в фноль фиоль

Фиоль фмоль (Ч) (Ч) приращение 38,9 приращение 86,82 150,49 (Т -Т)-Хзянг (Т -Y)-Х

I прираз1еиме 97 ° 3 приращение 144,7 при тех же при тех же ! концентр. концентр. в контр. в контр.

Хкек17 Хтеиев

Г отнощение 0,40 1,35 отноиение 0,60 приращем. лриращан.

Хзе/Х кем Ха8/Хкон равмица 0,95 (1,33-0,4) разница 0,44 (1,04-0,6) приращем. приращен.

° о2и3 во 5 и 6

«оленках колонках теблицм таблицы

» ь й»»

1l р и и е ч а н и е: расчет отноаения приращений при возрастании концентрации метки в среде производили ло формуле

Х Крег/аа ТтЕз)а.-Т каир где Х приращение;

Т - связывание при концентрации метки в среде ! инкубации, соотватствуозай точка перегиба у интактного донора;

Т - связывание метки лри концентрации в среде инкубации, в 10 раз больией

131 36

144,7

97,3

1,04

Таблица 3

Отношение приращений исследуемых показателей, полученных на этапе

П р и м е ч а н и е: в том случае, когда отношение приращений связывания БАВ с эритроцитами здоровых доноров, инкубируемых в сыворотке обследуемого лица, менее 0.63, а отношение приращений связывания БАВ с эритроцитами обследуемого, инкубируемых в сыворотке здоровых доноров, более 1,37, состояние обследуемого следует оценивать как переход от стадии тревоги к стадии повреждения клеточных мембран, Пороги приращений 0,63 и 1,37 получены на основании статистического анализа по связыванию использован-, ных меченых лигандов у людей и лабораторных животных, заведомо находящихся в состоянии стресса или состоялу(я покоя, и соответствуют размахам колебаний средней для нормы величины ++ 38 (р(0,05), 1783440

Таблица 4

Пациент №

Эритроциты обследуемых в сыворотке до но ра С.

ПГЕг ко тизол

ПГЕ2

0,97 кортизол0,68 кортизол

1,31

Разница отношений приращений для ПГЕ 0,14 (1,11- 0,97)

Разни а отношений и ля ко тизола 0,63 1 31 - 0 68

0,53

0,61

1,36 1 25

Разница отношений для ПГЕ 0,83 (1,36- 0,53)

Разни а отношений и и а ений ля ко тизола 0,64 1,25 - 0,61

Таблица 5

Оценка стадии стресс-реакции по заявляемому способу и прототипу животных ¹ 17 и ¹

Отношенйе п и а ений связывания БАВ

Животное №

Эритроциты исследуемых, сыворотка интактных жив,х

ПГЕ2 кортикосте он

ПГЕ2 кортикосте он

1,36 t,19

1,36

1,20

0,52

0,51

0,47

0,43

17

Корректор M.Êåðåöìàí

Редактор Г,Бельская

Заказ 45 12 Тираж . Подпис ое

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101

Данные обследования 3 рабочих газоконденсатного завода, име ощих Ш группу крови и резус+, Представлены данные отношения приращений связывания БАВ к приращениям связывания, полученным при выполнении 1 этапа (эритроциты и сйворотка донора С).

Эритроциты здорового донора С. в сыворотке обслеемых

0,99 0,72 1,59 1,60

Разница отношений приращений для ПГЕ 0,6 (1,59-0,99) Разница отношений и и а ений ля ко тизола-0,88 1,6-0,71

Эритроциты от интактных жив-х, сыворотка исследу-. емых

;!

Составитель О.Макеев

Техред M.Ìoðãåí ал

Активность ферментов в крови жив-х, 7; к контр .