Способ получения пенистых клеток из макрофагов мыши
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
coJvIA/1NcTvIvEcKvIx . 1 784g22 A ) ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Н А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 2 цина. Сущность изобретения: на четвертые сутки после внутрибрюшинного введения 103 гликогена мышам внутрибрюшинно вводят среду Хенкса, содержащую ацетилированные липопротеиды низкой плотности или окисленный холестерин из расчета 2 и 1 мг холестерина на 18 г веса живого. Через 24 ч из перитонеальной полости мышей извлекают макрофаги, трансформированные в пенистые клетки. 3 табл. 1 (21) 4888847/13 ..(22) 10.12.90 (46) 30.12.92. Бюл. и 48 (71) Институт терапии СО АМН СССР (72) И.И.Душкин (56) Journal оЕ Biolnp ical С ешдв уь 1980, 255, 9344. ! (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕНИСТЫХ КЛЕТОК ИЗ ИАКРОФАГОВ МЫШИ (57) Использование: биология, меди3 Изобретение относится к биологии холестерина и содержание холестерина и медицине, .в частности к методам ис- в полученных пенистых клетках. следования патогенеза и профилактики .. Недостатки указанного способа за- Ф . a epoc n®Ðoaa / . .. . .êëþ÷àþòñÿ в невысокой точности воспИэвестен способ получения пенистых роизведения условий культивирования ° ввввй клеток, схожих с леткам в атероскле- макрофагов, вариабелЬности использоротической аорте, из макрофагов, за- вания различных серий среды рщ— ключающийся в том, что полученные из : 1640, делипидизации сыворотки крови, ©© перитонеальной полости мышей рези- . .в различии материалов прйменяемой дентные макрофаги культивируют в культуральной посуды, в трудоемкости О пластиковых чашках Петри в среде : .метода культивйроцвания макрофагов в Я RPMY-1640, содержащей 2 мМ глутати- стерильных условиях, в исйользова- M она, l03 делипидированную сывоРоткУ нии дорогостоящих питательных сред крови человека, 100 Ед/мл пеницилли- и ооорудования для клеточных кульна, 100 мкг/мл стрептомицина и 100 мкг тур. Кроме того, культивирование белка модифицированных ацетилляцией макрофагов in vitro йе позволяет липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) моделировать процессы образования хов 1 мл среды, в течение 24 .часов при лестерин-обогащенных пенистых клеток 37 С в атмосфере СО (53) и возду- в органиэмеев ха (953). В конце исследования моно- Предлагаемый способ получения слой клеток промывают средой 199 и пенистых клеток в перитонеальной исследуют влияние антиатерогенных . полости организма жйвых мышей позфармакологических препаратов на ско- .. воляет значительно упростить процерость включения 1 С-олеата в эфиры дуру метода, устранив выше перечис4 и в перитонеальную полость вводили в мл среды RPMI — 1640, содержащую 104, эмбриональную сыворотку телят, 2 мИ глютатиона, 100 Ед/мл гентамицина, брюшную стенку массировали в течение 1 мин и аспирировали шприцом 4 мл перитонеальной жидкости, в которой с помощью камеры Горячева подсчитывали количество клеток. 2 мл среды, содержащей 2 10 6 клеток, вносим в пластиковые чашки Петри диаметром 35 мм и инкубируем при 37 0 в течение 2-х часов в атмосфере СО (53) и воздуха (953). Клеточный монослой отмываем 4 раза средой RPMI — 1640 и полученные пенистые клетки характеризуем по скорости эстерификации холестерина и содержанию свободного и общего холестерина. Определение содержания свободного и общего холестерина в пенистых клетках. Экстракцию липидов из клеток проводим, добавляя 4 мл гексана и изопропанола в объемном соотношении 3:2 в каждую чашку Петри, в течение 30 мин. Экстракт сливаем в стеклянные пробирки и органический растворитель упариваем в токе азота при 60 С. В сухом остатке определяем содержание общего и свободного холестерина в макрофагах энзиматическим методом с помощью набора реактивов нВ о-ЬаЬsistern" (финляндия) . Оставший на чашках Петри после экстракции липидов клеточный белок растворяем в i мл 0,2 И NaOH u определяем концентрацию белка методом Лоури. Содержание холестерина выражаем в мкг в расчете на 1 мг белка. Определение скорости эстерификации холестерина в пенистых клетках. К полученному клеточному монослою вносим 2 мл среды БАРМУ - 1640, содержащей 0,23 альбумин и 0,2 мИ (1 - <4 С) олеата радиоактивностью 1 мкКи/мл среды. Клетки инкубировали в течение 6 часов при температуре 37 С в атмосфере СО (5ь) и воздуха (953). После инкубации клетки промываем охлажденным до 4 С раствором Хенкса и проводим экстракцию липидов гексаном и изопропанолом в объемом соотношении 3:2 описанным выше способом. Разделение эфиров холестерина осуществляем методом тонкослойной хроматографии на пластинах (15515 см) "Силуфол" (ЧССР) в двух системах растворителей:гексан:диэтиловый эфир: 3 1784922 ленные недостатки. Преимущества йредлагаемого способа достигаются в результате способности макрофагов живых мышей накапливать большие количества холестерина и трансформироваться в пенистые клетки при внутрибрюшинном введении эмульсии окисленного холестерина или ацетилированных липопротеидов низкой плотности (ацетил-ЛПНП). Полученй пейистых клеток с высоким содержанием холестерина и скоростью его эстерификации осуществляют с помощью следующего метода: Окисление холестерина проводим на воздухе при температуре 60ОС в течение 6 недель. 20 мг окисленного холестерина растворяем в 60 мкл ацетона при температуре 60 С и быстро вносим 20 в 10 мл раствора Хенкса, содержащего 504 бычий сывороточный альбумин (БСА), Раствор перемешиваем на магнитной мешалке под током азота, поступающего из баллона с азотом, в течение 25 часа для удаления ацетона. Полученная эмульсия стабильная в течение 24 часов. Липопротеиды низкой плотйости (1 019-1,055 гlмл) выделяем из плазмы доноров методом ультрацентри- 39 фугирования ЛПНП (5 мг белка. в 1 мл раствора Хенкса) разбавляем (1: 1, V:V) насыщенным раствором ацетата натрия при температуре 0 С. К разбавленному таким образом раствору ЛПНП 35 (10 мг в 4 мл) периодически, один раз в 15 мин в течение часа, вносим по 2 мкл уксусного ангидрида с помощью микрошприца. Ацетилированные ЛПНП диализуем против 20 л 0,05 И фосфатного буфера, рН 7,4, 0,85 ь хлористого натрия в течение 24 часов при 4 С. Полученные ацетилированные ЛПНП храним в течение трех суток при 4 С.. 45 Для стимуляции выхода макрофагов в перитонеальную полость 5-8 недельным мышам линии С5781 внутрибрюшинно вводили 1 мл раствора Хенкса, содержащего 104 гликоген. На четвертые сутки после введения гликогена мышам внутрибрюшинно вводим раствор ацетилированных ЛПНП или эмульсию окисленного холестерина из расчета 2 или 1 мг холестерина на 18 г веса мыши, соответственно. Через 24 часа после последнего введения из перито неальной полости мышей получаем пенистые клетки. Для этого мышей забивали г г 5 178492 :Уксусная кислота в обьемных соотношениях 60:40:1 и 90:10:1. Пластину проявляем в парах йода и радиоактивность эфиров холестерина подсчитываем в толуольном сцинтилляторе (4 г ., PP0,О, 3 r РОРОР на 1 л толуола) в жидкостном сцинтилляционном счетчике "Марк-III" (США) по программе 2. Скорость эстерификации холестерина выражаем в кмоль включения < С-олеата в эфиры холестерина на 1 мг клеточного белка за 64 инкубации по следующей Формуле: Рад. кл х (С) Суб. вн моль Рад.Суб клеточный белок в мг, где Рад.кл - радисактивность эфирогв холестерина клеток в, имп./мин; Рад.Суб - радиоактивность добавляемого субстрата «Солеата в имп/мин; (C) Суб. - концентрация субстрата (олеата) в среде инкубации в нмоль. Определив таким образом концентрацию холестерина и его эфиров и скорость эстерификации холестерина в полученных клетках, можно определить степень" трансформации макрофагов перитонеальной полости мышей в пенистые клетки и динамику накопления эфиров холе- 35 стерина в клетках. Пример 1. Исследование срав" нительного влияния нативных ЛПНП (1-2 мг холестерина/18 r массы животного), ацетилированных ЛПНП (0,4-2 мг 40 холестерина/18 г массы животного),. очищенного перекристаллизацией холе-. стерина (1-2 мг холестерина/18 г массы животного) на содержание холестери- на и скорость его эстерификации в пе- ° 4Е ритонеальных макрофагах мыши. Через 24 часа, после внутрибрюшинного введения препаратов ЛПНП и холестерина по-, лучаем перитонеальные макрофаги и исследуем скорость эстерификации холестерийа. Результаты исследования, представленные в табл.1, показывают, что наиболее высокое (десятикратное) . повышение скорости эстерификации хо- . лестерина наблюдается при введении ми-. 55 шам ацетил-ЛПНП и окисленного холе стерина в концентрации 2 и 1 мг холе- .. стерина/18 г массы мыши, соответст венно. Как видно из табл.2, введение 2 6 окисленного холестерина и ацетил-ЛПНП повышает концентрацию эфиров холестерина в клетках в 60 раз и уровень свобсдного холестерина в 2 раза по сравнению с контролем. Десятикратное повышение скорости эстерификации холе- . стерина и 60-кратное повышение содержания эфиров холестерина в перитонеальных макрофагах свидетельствует об их трансформации в типичные пени-стые клетки, характерные для ранних стадий развития атеросклероза. г Предлагаемый способ позволяет получить пенистые клетки, которые могут быть использованы для изучения механизмов антиатерогенного действия . Фармакологических препаратов. Пример 2. Исследование действия антагониста кальция верапамила. на скорость эстерификации холестерина в пенистых клетках. Пенистые клетки, получаем,как описано выше после внутрибрюшинного введения окисленного холестерина (1 мг/18 г массы мыши) и по" следующего культивирования их в чашках Петри. К среде для определения скорости эстерификации холестерина, которое подробно изложено выше, микрошприцом вносим верапамил B 5 мкл этило-вого спирта"йа t мл среды культивирования в конечных концентрациях 25, 50, 75 и 100 мкй. Табл.3 демонстрирует, что верапамил дозозависимо ингибирует скорость эстерификации холестерина в пенистых клетках, что, вероятно, свя-зано с его антиатерогенным действием. Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить пенистые клетки в условиях их естественной трансформации из перитонеальных макрофагов живых мышей, которые могут быть использова= ны для изучения"мехайизмов атерогенеза и действия антиатерогенных препаратов. Формула изобретения Способ получения пенистых клеток из макрофагов мыши, включающий воз- действие на макрофаги мышей окисленным холестерийом йли минопротеида- ми низкой плотности, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения выхода жйзнеспособных клеток, воздействие осуществляют in vivo внутрибрюшинным введением вещества в дозе 1"2 мг/18 г массы мыши, затем выдерживают в течение суток и целевой продукт извлекают аспирацией. 1784ÿ22 Скорость включения " С-олеата в эфиры холестерина макрофагов, полученных после внутрибрюшинного введения нативных и ацетилированных липопротеидов, холестерина и его !" окисленных продуктов .(Ktm) »Ю ЮЮЮВ Ю» Концентрац ия ХС в вводимом пре" парате в мг на 18 г веса мыши Включение «С-олеата в ЭХС в нмоль в течение 6 часов культи-. вирования 1 макрофагов Группа животных ° ° М Фю 0 3,56+0,063 1 7,41+0,48 2 11,25z0,52,: 0,4 6,47+0,38 - .. 1 18;9+1,31 1,5 30,08+1,76, 2 36, 11+2,31 0,5 11,23+0,36 1,0 19,6+1,02 2,0 26,4Д,26 0,5 «14,4 0,52 1,0 34,8+1,35 Достоверность всех величин по от. ношению к контролю - Р а 0,001, Табли ца 2 Содержанйе холестерина в макрофагах при внутрибрюшинном введении натйаных и . "ацетилированных ЛПЙП, холестерйна и его,-- окисленных продуктов (И+я) Ю ЮФ Гpyrina животных. n = 6 ав ф» й Концентрация XC в вводимом препарате в мг на 18 г веса мыши Ф Ф МЮФюююМ\В ФФю ЭХС CXC Контроль Нативные ЛПНП Нативные ЛПНП Ацетил ЛПНП Ацетил ЛПНП Ацетйл ЛПНП Ацетил ЛПНП ее» е С» 0,59И,07 1Ц,4+0,69 "+ 16, 2+.О, 94*"" 19,8 1,57""» 25 5+1,94 »" 30,86+2,59" + + 38, 12+2,63» "+ 18,24+0,45 20, 1 0,71. 23,5+, 15" 18,2+0,96 19,311,29 25,5+1,22ЯЯ 28,87+1,33""" 0 1,0 2,0 0,4 1,0 1,5 2,0 Контроль Нативные JlilHll Нативные ЛПНП Ацетйл ЛПНП Ацетил ЛПНП Ацетил ЛПНП Ацетил ЛПНП Перекристаллизованный ХС Перекристалли3088HHblH XC Перекристаллизованный ХС Окисленный ХС Окисленный ХС Содержание ХС в мкг на 1 мг клеточного белка.. 1784922 Продолжение табл. 2 I pynna животных и 6 Содержание ХС в мкг на 1 мг клеточного белка СХС ЭХС 20,39+0,74 11, 42+0,6 Я " l 9, 13+1, 74" 0,5 19,6+0,86 1,0 26,27+1,84" 27,1 «+1, 65" 33,27+1,49» 25,43И, 17„"+ 16,73 1,46""" 38,05 3,42" " 2,0 0,5 1,0 Достоверность отличий по отношению к контролю:; одна звездочка Р (0,01 две -"- P < 0,002 три -"- P (0,001 Таблица 3 Влияние верапамила на скорость включения 1 С-олеата в эфиры холестерина пенистых клеток (М+ш) Составитель М.Душкин Техред М.Моргентал Корректор С.Пекарь и Тираж Подписное комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 РедакторЛ. Павлова За каз 4362 BHHHIIH Государственного 113035, Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 Перекристаллизованный ХС Перекристаллизованный ХС Перекристаллизованный ХС Окисленный ХС Окисленный ХС Концентрация ХС в вводимом препарате в мг на 18 r веса мыши Концентрация верапамила в среде инкубации клеток в мкМ 100 Включение С-олеата в эфиры холестерина в нмоль/мг клеточного белка за 6 часов инкубации 34,8+1,36 26,7+1,12 19,2+0,91 11,1+0,82 6,3+0,54
