Способ очистки нуклеотидов, меченных фосфором-32 и фосфором- 33

 

Использование: молекулярная биология , биотехнология, очистка нуклеотидов. Сущность: использование ион-парной хроматографии на колонках, заполненных октадецилсиликагелем объемом 1,5-2 мл( элюирование линейным градиентом вода - этанол от 0 до 10% за 25 мин, в качестве ион-парного реагента используют триэтмламмонийбикарбонат в конечной концентрации 0,04-0,06 М. 4 ил., 3 табл.

союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 07 F 9/09

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ еЪ !

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4847027/04 (22) 04.06,90 (46) 07.01,93. Бюл. ¹ 1 (71) Хозрасчетное опытное предприятие

"Радиопрепарат" Института ядерной физики АН УЗССР (72) С,А.Кузнецов, В.А.Ли, B,Ф.Осинский, Т.Д.Петренко, И,В,Рабинов, В.А,Рихтер и

Ю.С.Скоблов (56) 1, Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии, Под ред. А.Хеншен и др., М.; Мир, 1988, с, 451 — 488.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии и мо- жет быть использовано для получения нуклеотидов, меченных фосфором-32 и фосфором-33. Указанные соединения широко используются в молекулярной биологии, биохимии и т.д; для исследования первичной структуры нуклеиновых кислот, а также для исследования структуры и функций различ.:ных ферментов.

Известен способ очистки нуклеотидов, меченных радиоактивным фосфором, с использованием ВЭЖХ на колонках, запол.ненных аминопропилсиликагелем (АПС), в градиенте водного триэтиламмонийбикарбоната (ТЭАБ). Этот способ позволяет получать меченые нуклеотиды высокого качества.

В то же время, указанный способ обладает рядом существенных недостатков, а именно: при очистке малых (5-10 мКи) количеств меченых нуклеотидов целевой продукт содержит значительное количество ТЭАБ, т.е.

„„ЯЛ „„1 786034 А1 (54) СПОСОБ ОЧИСТКИ НУКЛЕОТИДОВ, МЕЧЕННЫХ ФОСФОРОМ вЂ” 32 И ФОСФОP0M — 33 (57) Использование: молекулярная биология, биотехнология, очистка нуклеотидов.

Сущность: использование ион-парной хроматографии на колонках, заполненных октадецилсиликагелем объемом 1,5 — 2 мл; элюирование линейным градиентом вода— этанол от 0 до 10% за 25 мин, в качестве ион-парного реагента используют триэтиламмонийбикарбонат в конечной концентрации 0 04 — 0 06 M. 4 ил., 3 табл. не может быть использовано без предварительного упаривания; колонки с АПС обладают малым сроком службы и при разовой загрузке 50-100 мКи подлежат замене йосле 10 хроматографий, что приводит к повышению себестоимости готового продукта и к дополнительному облучению персонала; .для получения продукта с низким содержанием ТЭАБ приходится использовать колонки малого размера, что неудобно при работе в перчаточном боксе; для получения меченых нуклеотидов с высокой объемной активностью (20 — 50 мКи/мл) в водном растворе приходится упаривать готовый продукт для.удаления ТЭАБ, что отрицательно сказывается на его качестве.

Цель изобретения — создание метода очистки меченых нуклеотидов, свободного от перечисленных недостатков. . Цель достигается тем, что для очистки нуккеотидов, меченных радиоактивными изотопами фосфора, используют ион-пар1786034 ную хроматографию на колонках с ОДС в линейном градиенте этанола, а в качестве ион-парного реагента используют ТЭАБ.

С целью оптимизации условий разделения при разработке метода были опробова- 5 ны хроматографические колонки различного размера, При этом выяснилось, что использование колонок малого размера нецелесообразно, так как в этом случае продукт выходит с колонки в малом обьеме 10 (0,03-0,05 мл) и его трудно собрать. Кроме того, с такими колонками неудобно работать в перчаточном боксе. В то же время использование колонок размером 4х150 мм (объем 1,8 мл) позволяет получить продукт в 15 объеме 0,2-0,5 мл. Экспериментально обнару>кено, что использование колонок объемами 1,5-2 мл наиболее рационально для достижения цели.

Дальнейшее увеличение размеров ко- 20 лонки приводит к увеличению обьема выхо.да, что нежелательно, поэтому для массовой очистки меченых нуклеотидов были выбраны колонки с размером 4х150 мм. Было экспериментально установлено, что колон- 25 ка такого размера выдер>кивает 200 — 250 хроматографий при разовой загрузке 50—

100 мКи; т.е. в 20-25 раз больше, чем указано в работе (1). Как было установлено экспериментально, ТЭАБ обеспечивает хо- 30 рошее удерживание нуклеотидов на колонках с ОДС в концентрациях 0,04 — 0,06 М, Столь низкая концентрация соли позволяет избежать разложения соли на колонке и дает возможность получить готовый продукт с 35 высокой обьемной активностью без обессоливания, Снижение концентрации ТЭАБ до

0,025 — 0,03 M существенно снижает время удерживания нуклеотидов и ухудшает воспроизводимость результатов. Увеличение 40 концентрации ТЭАБ до 0,08-0,15 М не дает существенного выигрыша и приводит к дополнительному солевому загрязнению продукта (табл, 1).

Определение концентрации ТЭАБ в го- 45 товом продукте показало, что даже в случае получения последнего в количестве 1-2 мКи она не превышает 0.03 М, такой продукт был пригоден для дальнейшей работы без предварительного упаривания. 50

Примеры конкретного исполнения.

Пример 1. Выделение дезоксиаденозин-5 -(QР Р)трифосфата.

К реакционной смеси объемом 0,5 мл, содержащей 90 м Ки (18 н моль) (а -з2Р)дАТФ, 55

10 мКи (2 нмоль) (а Р)дА1 ЛФ, 3 нмоль

АДФ, 50 нмоль АТФ, 0,1 мг белка. 2 мкмоль

MgClz, 1 мкмоль KCI, 5 мкмоль Tris-HCI, добавляли 0,013 мл 1 M раствора ТЭАБ, затем наносили на колонку Siiasorb Сщ размером

4х150 мм, предварительно уравновешенную 0,05 М ТЭАБ, Элюцию проводили градиентом концентрации этанола от 0 до 10 за 25 мин со скоростью потока 0,5 мл/мин.

Время удерживания дАТФ составляло 19,07 мин, объем фракции, содержащей продукт

0,2 мл, концентрация ТЭАБ в готовом продукте 0,00025 М, На фиг, 1 приведен профиль элюции (aР)дАТФ, ци уами отмечены: 1 — АДФ; 2—

АТФ; 3 — (а- Р)дАМФ; 4 — (а - Р)дАТФ.

Аналогичное выделение 100 мКи (аР)дАТФ позволило получить готовый продукт с объемной активностью 10 — 50 м Ки/мл в водном растворе с концентрацией ТЭАБ

0,002 — 0,02 М без дополнительного обессоливания.

Пример 2. Выделение гуанозин-5 (а - Р)монофосфа, а, К реакционной смеси объемом 0,20 мл, содержащей 80 мКи (16 нмоль) (а - Р)ГМФ, 20 мКи (4 нмоль) (y - Р)АТФ, 100 нмоль Р

-NAD, 40 нмоль АДФ, 5 мкмоль Tris-HCI, 1 мкмоль KCI, 2 мкмоль MgCI2 и 0,1 мг белка, добавляли 0,01 мл 1 М раствора ТЭАБ. затем наносили на колонку Sllasorb Си размером

4х150 мм, предварительно уравновешенную 0,05 M водным ТЭАБ. Монофосфат элюировали градиентом концентрации этанола от 0 до 10% зэ 25 мин, скорость потока 0,5 мл/мин. Время удерживания (a - Р)ГМФ составляло 12,19 мин, объем фракции содержащей ГМФ 0,3 мл, На фиг, 2 приведен профиль элюции (а

Р)ГМФ, цифрой 1 отмечен (а Р)ГМФ, Выделенный таким образом продукт далее подвергался ферментативному фосфорилированию до соответствующего трифосфата с выходом 95-100% без какойлибо дополнительной обработки.

Пример 3. Выделение эденозин-5,(у -з2Р)трифосфата, К реакционной смеси объемом 0,15 мл, содер>кащей 85 мКи (16 нмоль) (у- Р)АТФ, 40 нмоль АДФ, 100 нмоль P-NAD, 5 мкмоль

Tris-HCi, 1 мкмоль KCI, 2 мкмоль MgCI2 и 0,2 мг белка, добавляли 0,01 мл 1 M раствора

ТЭАБ, затем наносили на колонку SIIasorb

С>в размером 4х150 мл, предварительно уравновешенную 0,05 М водным ТЭАБ. Трифосфат элюировэли градиентом концентрации этанолэ от 0 до 10/ за 25 мин, скорость потока 0,5 мл/мин.

Время удерживания у-АТФ составляло

17,74 мин, объем фракции, содер>кащей .уАТФ 0,2 мл, концентрация ТЭАБ в готовом продукте 0,00035 M.

1786034

Таблица 1

Зависимость времени удерживания, химической чистоты нуклеотида и концентрации ТЭАБ в готовом продукте от концентрации ТЭАБ в элюирующем растворе для дезоксиаденозин5 — (а — Р)трифосфата (см. пример 1 ) Концентрация ТЭАБ в готовом продукте, моль/л

Химическая чистота, 7

Время удерживания,мин

КонцентрацияТЭАБ в элюенте, моль/л

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

0,10

0,1 1

0,12 не удерживается

2,14

6,51

10,17

14,31

19,07

20,71

21,11, 22,88

24,32

25,59

27,07

28,38

40

97

98-99

95. 94

93-94

91 — 93

90-92

0,0001

0,00012

0,00018

0,00025

0,00034

0,00048 . 0,00079

0,0012

0,0020

0,0027

0.0034

На фиг. 3 приведен профиль элюции (y

Р АТФ, цифрами отмечены; 1 — АДФ; 2— зг ° (y- Р)АТФ.

Пример 4. Выделение уридин-5,-(а

-зг Р)трифосфата, К реакционной смеси объемом 0,5 мл, содержащей 70 мКи (14 нмоль) (a- Р)УТФ, 10 мКи (а- Р)УМФ, 50 нмоль АТФ, 0,1 мг белка, 2 мкмоль М9С!г, 5 мкмольТг з-НС!, добавляли 0,025 мл 1 M раствора ТЭАБ, затем наносили на колонку Silasorb С в размером 4х150 мм, предварительно уравновешенную 0,05 М ТЭАБ.

Элюцию проводили градиентом концентрации этанола от 0 до 10 за 25 мин со скоростью потока 0,5 мл/мин, Время удерживания (а- Р)УТФ составляло 14,57 мин, объем фракции, содержащей продукт, 0,3 мл, концентрация ТЭАБ в готовом продукте

0,0004 М.

На фиг. 4 приведен профиль элюции (a

Р)УТФ, цифрами отмечены: 1 — (аР)УМФ; 2 — (а Р)УТФ; 3 - АТФ, Время удерживания для других нуклеозид-5 -моно- и трифосфатов, меченных фосфором-32 и фосфором-33, приведено в табл, 2. (Р)-нуклеотиды не отличались от сооветствующих (P)-нуклеотидов по своим . хроматографическим параметрам (время удерживания, ширина пика, объем элюции ,и т.д.).

Химическая чистота и концентрация

ТЭАБ в готовых препаратах приведены в табл. 3. Радиохимическая чистота всех выделенных продуктов составляла 97-99 даже при выделении смеси, содержащей 150 и более мКи меченого соединения, Таким образом, совокупность известных признаков с предложенными сущест5 венными отличиями, а именно использование ион-парной высокоэффективной хроматографии на колонках определенных размеров с определенным наполнителем, а также экспериментально

10 подобранных условий и режимов проведения элюирования обеспечили достижение цели — высокую химическую чистоту; снижение облучения персонала за счет более удобных условий работы в боксе и значи15 тельного увеличения срока службы колонок.

Формула изобретения

Способ очистки нуклеотидов, меченных фосфором-32 и фосфором-33, путем пропу20 скания реакционной смеси через высокоэффективную колонку с производным силикагеля г последующим элюированием нуклеотидов, с использованием триэтиламмоний карбоната, отличающийся тем, 25 что, с целью повышения химической чистоты целевого продукта, увеличения срока службы колонок и повышения безопасности процесса, используют ион-парную высокоэффективную жидкостную хроматографию

30 на колонках, заполненных октадецилсиликагелем, объемом 1,5 — 2 мл, а элюирование проводят линейным градиентом вода — этанол от 0 до 10 Д за 25 мин, причем в качестве ион-парного реагента используют триэти35 ламмонийбикарбонат в конечной концентрации 0,04-0,06 M.

1786034

Продолжение таблицы 1

П р и м е ч а н и е . Химическую чистоту выделенного продукта определяли хроматографически по методике, приведенной в работе(1), с. 464.

Концентрацию ТЭАБ определяли кондуктометрическим методом по калибровочным кривым, Таблица 2

Время удерживания различных нуклеотидов.

П р и м е ч а н и е. Разброс во времени удерживания в различных опытах составлял не более 5 .

1786034

Таблица 3

Сравнение качества препаратов, выделенных методами ионообменной и ион-парной хроматографии

Ионообменная хроматография и ототип

Ион-парная хроматография

Нуклеотид

Химическая чистота, Химическая чистота, Концентрация

ТЭАБ, моль/л

Концентрация

ТЭАБ,моль/л

П р и м е ч а н и е. Ион-парную хроматографию проводили, как в примерах 1-4 . Активность нуклеотида составляла 50мКи. Химическую чистоту выделенного продукта определяли хроматографически по методике, приведенной в работе(1), с,464,Концентрацию ТЭАБ определяли кондуктометрическим методом по калибровочным кривым.

20.00 25.00

5 -АМФ

5 -УМ Ф

5 -ГМ Ф

5 -ЦМФ

5 -дАМФ

5 -ТМ Ф

5 -дГМФ

5 -дЦМ Ф

5 -АТФ

5 -УТФ

5 -ГТФ

5 -ЦТФ

5 -дАТФ

5 -ТТФ

5 -дГТФ

5 - ТФ

91

92

94

93

91

91

94

94, 90

0,008

0,007

0,007

0,009

0,01

0,006

0.004

0,004

0,01

0,01

0.015

0,015 .

0,015

0,015

0,015

0,015

97

96

97

96

99

97

99

96

99

98

98

96

99

98

99

0,0025

0,004

0,001

0,003

0,0006

0,002

0,00065

0,003

0,00035

0,0004

0,0003

0,0009

0,00025

0,0003

0,00025

0,00085

1786034

10.00

5,00

10.00

5.OO

0.00

10 0 00

5.00

Фаг. 4

Составитель Л.Панфилова

Техред М,Моргентал Корректор С.Шекмар

Редактор Е.Хорина

Заказ 225 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Способ очистки нуклеотидов, меченных фосфором-32 и фосфором- 33 Способ очистки нуклеотидов, меченных фосфором-32 и фосфором- 33 Способ очистки нуклеотидов, меченных фосфором-32 и фосфором- 33 Способ очистки нуклеотидов, меченных фосфором-32 и фосфором- 33 Способ очистки нуклеотидов, меченных фосфором-32 и фосфором- 33 Способ очистки нуклеотидов, меченных фосфором-32 и фосфором- 33 

 

Похожие патенты:

Изобретение относится к химии фосфорорганических соединений, в частности к иэобутил-2-(тиметиламмонио)- этилфосфатхлориду, который может быть использован в качестве влагочувствительного материала в датчиках влажности
Изобретение относится к химии фосфорорганических соединений, а именно к улучшенному способу выделения эфиров фосфорной кислоты из отработанных загущенных гидравлических жидкостей

Изобретение относится к способу получения трис--хлоралкилфосфатов общей формулы (СlR)3)P= O, где R-C2C3- алкил, которые находят применение в качестве огнестойких пластификаторов в производстве нитролинолиума, азотнокислых эфиров целлюлозы, пенополиуретанов, полиметилметакрилатов и антипиренов для электроизоляционных лаков

Изобретение относится к новым тиосемикарбазонам формулы I где R4 представляет Н или СН3, R5 представляет CHR, бензил или орто- или паразамещенный бензил, R представляет Н, СН3, СН2СН3, СН2СН2-СН3 или СН(СН3)2, R' представляет остаток фосфорной кислоты, соль фосфорной кислоты или -S-S-R" группу, R'' представляет СН2СН2NHR6, СН2СН2ОН, СН2COOR7, орто- или паразамещенный C1-С3 алкилфенил или орто- или паразамещенный нитрофенил, R6 представляет Н, C1-C4 ацильную группу, трифторацетильную, бензоильную или замещенную бензоильную группу, R7 представляет Н, C1-C4 алкил, фенил, замещенный фенил, бензил или замещенный бензил

Изобретение относится к химии фосфороорганических соединений, конкретно к способу получения эфиров кислот фосфора, которые могут найти применение в качестве пластификаторов, присадок к смазочным маслам и жидкому топливу, добавок к полимерам, а также в качестве экстрагентов и комплексообразователей, гербицидов, инсектицидов и антибластических средств

Изобретение относится к новым фосфорилированным производным фенилуксусной кислоты формулы (II), где R1 означает -СН2ОР(О)(ОН)2 и R2 означает ОН; R1 означает -СН3 и R2 означает -ОР(О)(ОН)2

Изобретение относится к способу получения фенилен- и нафтиленфосфорных кислот, которые могут применяться в качестве экстрагентов урана и цветных металлов, а также инсектицидов и других биологически активных веществ
Наверх