Способ определения гиалуронидазной активности

 

Использование: биология, медицина, ветеринария. Сущность изобретения: субстрат-гиалуроновую кислоту, инкубируют с испытуемым образцом, содержащим фермент . Вносят сгусткообразователь - 0,75- 1,25%-ный раствор риванола. Из полученного сгустка экстрагируют риванол 1н. раствором соляной кислоты или смесью равных обьемов 1н. раствора соляной или концентрированной серной кислоты на кипящей водяной бане в течение 5-10 мин. В экстракте определяют концентрацию риванола измерением оптической плотности колориметрическим методом при длине волны 402 нм или флюоресценции при длине волны возбуждения 402 нм и эмиссии -480 нм. По концентрации риванола определяют активность гиалуронидазы. Перед введением риванола в смесь добавляют тритон Х-305 или Х-100 в соотношении 4:1 и инкубируют 5 мин. Возможна точная количественная оценка содержания фермента в пробе в диапазоне рН от 2,2 до 8,0 с субстратом различной степени очищенности. 1 з.п. ф-лы, 8 табл.

союз соВетских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 0 1/34

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССP (ГОСПАТЕНТ СССР) т

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4866804/13 (22) 17.09.90 (46) 07,01,93. Бюл. N. 1 (71) Витебский медицинский институт (72) К,С.Азаренок и И.И.Генералов (56) Biochem. J., 1943, v. 37, р, 169-177. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГИАЛУРОНИДАЗНОЙ АКТИВ НОСТИ (57) Использование: биология, медицина, ветеринария. Сущность изобретения: субстрат-гиалуроновую кислоту, инкубируют с испытуемым образцом, содержащим фермент. Вносят сгусткообраэователь — 0,751,$5%-ный раствор риванола. Иэ полученного сгустка экстрагируют риванол 1н. раствором соляной кислоты или смесью равных обьеИзобретение относится к биологии, медицине, ветеринарии. и может быть использовано для определения гиалуронидазной активности в любых биологических жидкостях и средах (сыворотка, тканевая жидкость, культуральная среда и т,n,), К настоящему времени предложено большое количество способов оценки гиалуронидазной активйости, Их делят на несколько групп:

1) Химические (сюда входят методы по определению конечньг< продуктов распада гиалуроновой кислоты - N-ацетилглюкоза.мина и редуцирующих олигосахаридов);

2) физико-химические, включающие вискозиметрию, турбидиметрию, лазерную нефелометрию, 3) диффузионные и гель-электрофорезные, основанные на помещены гиалуроновой кислоты в различные виды гелей. При послед/ющем внесении гиалуронидазы on„„. Ж„, 1786071 А1 мов 1н, раствора соляной или концентрированной серной кислоты на кипящей водяной бане в течение 5 — 10 мин. В экстракте определяют концентрацию риванола измерением оптической плотности колориметрическим методом при длине волны 402 нм или флюо1 ресценции при длине волны возбуждения

402 нм и эмиссии -480 нь . По концентрации риванола определяют активность гиалуронидазы. Перед введением риванола в смесь добавляют тритон Х-305 или Х-100 в соотношении 4;1 и инкубируют 5 мин. Возможна точная количественная оценка содержания фермента в пробе в диапазоне рН от 2,2 до

8,0 с субстратом различной степени очищенности. 1 з.п. ф-лы, 8 табл.

Ф ределяют эоны расщепления гиалуроновой кислоты с помощью катионных красителей типа акридина оранжевого, а также — толуидина синего, альцианового голубого или — в последнее время — красителя "Staines-аП"; иногда для выявления зон просветления О применяют четвертичные аммониевые сое- Ch динения типа цетилпиридинийхлорида, цетилтриметиламмонийброМида и т.д.; !

4) аффинные, основанные на специфическом взаимодействии с гиалуроновой кислотой гиалуронатсвязывающих белков(ГСБ) из протеогликанов суставов или из ЦНС (протеин гиалуронектин).

Однако до настоящего времени не существует достаточно удовлетворительного метода определения гиалуронидазной активности, который был бы специфичен, прост и чувствителен.

Все вышеперечисленные методы имеют довольно существенные недостатки:

1786071

1) химические методы специфичны, однако занимают значительное время определения (20 — 24 ч), в первоначальных вариантах открывали все ферменты каскада расцепления гиалуроновой кислоты (в том числе бетаглюкуронидаэу и N-ацетилглюкозаминидазу), что потребовало внесения ингибиторов последних; чувствительность методов относительно невелика;

2) физико-химические методы достаточно чувствительны, Тем не менее, турбидиметрический, например, способ громоздок и сложен в исполнении, имеет узкие диапазоны пропорциональности между концентрацией гиалуроновой кислоты и мутностью.

Кроме того, уменьшение мутности проб под влиянием гиалуронидазы наступает лишь при снижении молекулярного веса субстрата до 6-8 тыс,Д, Это не позволяет уловить начальные стадии деградации гиалоруновой кислоты (ГК). Вискозиметрический метод чувствителен несколько больше турбидиметрии, однако временной ийтервал линейной зависимости между концентрацией фермента и вязкостью не выходит за первые 20 мин взаимодействия, метод тре- бует строго соблюдения ряда условий — термостатирования, рН, чистоты реагентов.

Может быть неспецифическое падение вязкости под влиянием белков и электролитов, Лазерная же нефелометрия требуетдорогостоящего оборудования, а чувствительность ее сопоставима с вышеперечисленными методами.

3) диффузионные и гел> -электрофорезные методы весьма чу-сгвительны, однако для достижения такай разрешающей способности (0,0003 МЕ} требуется удлинение инкубэции до 48 ч, В методах используется дорогостоящая аппаратура, в современных модификациях применяются светочувствительные красители, что заставляет проводить сложные методы окрашивания в темноте. Помимо этого, подобные красители (типа "Stains-э!Г)в СССР не производятся.

4) аффинные же методы до настоящего времени все еще не вышли эа пределы лабораторий, е которых были изобретены, Необходимые гиалуронатсвяэывающие белки коммерчески не производятся, требуют вы-. делейия в достаточных количествах перед постановкой реакции из протеогликанов хрящей или мозга человека, Подобное выделение, особенно из пр; теогликанов хряща, громоздко и трудоемко. Наконец, все зти методы основаны на иммунном (радио- или иммуноферментном определении связывания ГСБ с гиалуроновой кислотой. Принимается, что зти белки взаимодействуют с субстратом пропорционально нерасцепленной гиалуроновой кислоте, сохранившейся после действия гиалуронидазы, Однако ранее было показано, что взаимодействие ГСБ с гиалуроновой кислотой мало зависит от длины цепи последней, Связывание может происходить одинаково с олигомерами субстрата. Данные факты ставят под сомнение вышеприведенное положение.

Далее, на определение гиалуронидазы в биологических жидкостях подобными методами значительное влияние будут оказывать другие ГСБ, в частности антитела. Они могут, взаимодействуя с гиалуроновой кис10

15 латой, блокировать сэйты связывания без истинного расщепления субстрата гиалуронидазой и тем самым — искусственно завышать результаты, Наличие "естественно встречающихся" антител, связывающих ги20 алуроновую кислоту, в сыворотках описано даже в норме, не говоря о сыворотках больных. В крови циркулируют также антитела к мономерам гиалуроновой кислоты, в частности, к ацетилглюкозамину. Отсюда можно деленных недостатков

Таким образом, все вышеизложенное свидетельствует о том, что разработка высо30 кочувствительного и воспроизводимого метода определение гиалуронидазной активности (ГА) является по-прежнему актуальной задачей.

Базовым прототипом для предполагаемого способа является метод определения гиалуронидазной активности по предупреждению образования муцинового сгустка, Метод имеет ряд достоинств:

1) он специфичен; 2) величина сгустка

40 пропорциональна количеству и степени расщепления ГК (гиалуроновой кислоты); 3) метод чувствителен, по крайней мере— превышает турбидиметрию, варьируя вреMR инкубации, чувствительность можно повысить; 4) очень прост в постановке, не требует никаких дорогостоящих реагентов, 45 специально обученного персонала и т.n.; 5) позволяет проводить определение гиалуронидазы во всех биологических жидкостях и препаратах.

Основной характер прототипа — полуколичествен н ый характер результатов, т.е.

55 полученные данные могут выть выражены лишь в титрах гиалуронидазы. Метод также не дает возможности точно оценить величину образующихся сгустков, что снижает его чувствительность, основан на субъективном визуальном учете.

25 .заключить, что данная весьма прогрессив,ная группа методов также не лишена опре1786071

15

40

50

Концентрацию ГК оценивают по методу с карбазоловым реактивом по глюкуроно- 55

Наконец, определение гиалуронидазной активности возможно лишь при рН, близких к нейтральному, т,к. при кислом (менее 3,8-4.0) рН гиалуроновая кислота образует сгусток спонтанно до расщепления, Целью изобретения является расширение диапазона рН определения и повышение чувствительности метода с количественным точным определением тиалуронидазы в биологических жидкостях и препаратах.

Цель достигается обнаруженной авторами способностью 2-этокси-6,9-диаминоакридина лактата (риванола) образовывать сгусток с гиалуроновой кислотой обратно пропорционально ее деполимеризации под действием фермента гиалуронидазы при расширенном диапазоне рН (2,2 — 8,0).

Сущность предложения заключается в определении количества хромогена (или флюорогена) риванола в образовавшемся сгустке любым кало- или флюорометрическим методом.

Примеры осуществления способа.

Получение субстрата и стандартизация сгустка.

Гиалуроновую кислоту получают по из.вестным методам. Они заключаются в следующем; пупочные кэнатики новорожденных собирают в достаточном количестве..Пуповины разрезают и отмывают от крови дистиллированной водой. Извлекают сосуды.

Взвешивают полученный материал, Далее препарат отмывают трехкратно большими объемами дистиллированной воды, обсушивают на фильтровальной бумаге и измельча-; ют до кашицеобразного состояния. При повторном взвешивании его масса увеличивается приблизительно в два раза. При необходимости субстрат доводят до двойного объема дистиллированной водой. Оставляют стоять в течение 8-10 ч на холоду при

4ОС. После этого препарат нагревают до кипения и фильтруют через ватный фильтр. К полученному раствору ГК добавляют папаин из расчета 3,5 мг/мл. Обработку проводят в течение 16 ч.при 65 С. Центрифугированием отделяют полученный преципитат (30 мин, 8000 об/мин). Все полученные препараты ГК хранят в замороженном состоянии. Перед постановкой основного опыта их оттаивают и центрифугируют повторно в тех же условиях. вой кислоте. В реакциях используют препа-. рат ГК в интервале 1 — 2,7 мг/мл. Оптимально — 1,5 мг/мл. При проведении реакции в этих условиях оптическая плотность образующихся контрольных сгустков обычно лежит

30 в пределах 0,27 — 0,35, что является оптимальным.

Определение стрептококковой гиалуронидазы.

В ходе выполнения основного эксперимента к 1 объему (0,2 мл) субстрата добавляют 1 объем (0,2 мл) 0,02М фосфатного буферного раствора рН 7,0, с 0,004М ЭДТА и 0,15M NaCI, содержащего 2-кратные разведения фермента (стрептококковая гиалуронидаза производства НИИЭМ им.

Н. Ф, Гамале и).

Смесь инкубируют 2 ч при температуре

37 С. По окончании инкубации в среду добавляют 0,1 мл (1/4 часть объема смеси)

207;-ного раствора Тритона X-305. Встряхивают, оставляют стоять на 5 мин при комнатной температуре. Далее на поверхность проб наслаивают 20 мкл (1/25 часть объема), содержащих 200 мкг риванола. Образцы инкубируют еще 5 мин при комнатной температуре. После этого их встряхивают вторично для образования сгустка. При избыточном содержании фермента сгусток в первых разведениях не образуется. Если начальный сгусток минимален, то для точного дальнейшего определения рекомендуется брать следующее разведение фермента, Та,кие пробы отбирают, центрифугируют при

1000 об/мин в течение 1 мин, надосадок сли- вают, образец однократно отмывают дистиллированной водой. Далее к нему добавляют

0,5 мл соответствующего экстрагирующего раствора и помещают в кипящую водяную баню при 100 С на 5 — 10 мин, При использовании очищенного препарата ГК в качестве экстрагирующего раствора применяют 1н. HCI, при применении неочищенного — смесь из 0;35 мл концентрированной серной кислоты и 0,25 мл раствора 1н, HCI. После этого пробы разводят дистиллированной водой до 3 мл и затем детектируют. Определение проводят либо фотоэлектроколориметрически (3 светофильтр, толщина рабочего слоя кюветы 0,5 см), либо — спектрофотометрически (длина волны — 402 нм, толщина слоя — 1 см), либо флюорометрически (длина волны возбуждения — 402 нм, флюоресценции — 480 нм; в случае использования флюорометра "БИАН" — светофильтры с максимумами 366 и

470 нм, соответственно, объем проб доводят до 5 мл). Измерения проводят против дистиллированной воды или против раствора риванола известной (12,5 мкг в пробе) концентрации при флюорометрии.

Контролем служит гиалуроновая кислота в буфер, Полученные после детекции величины сравнивают с предварительно выстроенной калибровочной кривой по из1786071

30

50 табл,6, вестной гиалуронидазе, Используется стрептококковый фермент. его активность выражается в опытных дозах (ОД), Полученный результат должен попадать на линейный участок калибровочной кривой.

Перед учитыванием результатов необходимо оценить контроль данного эксперимента. Если он отличается от контроля при построении калибровочной кривой не более, чем на 6 — 7% (коэффициент вариации метода), то количество энзима можно прямо выразить в единицах гиалуронидазы. Умножая их на разведение образца, получаем количество опытных доз фермента в пробе (по стрептококковой гиалуронидазе).

B случае, если разница в контролях более значительна, то показатель оптической плотности образца умножают на отношение контролей кривой и образца, а далее сравнивают с калибровочным графиком.

При флюорометрии операции аналогичны, с той лишь разницей, что величину сгустка выражают в мкг риванола в пробе и переводят в единицы активности энзима, Результаты определения гиалуронидазной активности с различными разведениями фермента представлены в табл.1.

Из полученных данных видно, что линейность зависимости оптической плотности от концентрации фермента находится между 0,001 и 0,007 ОД в пробах.

Флюорометрия, Данные, полученные при флюорометричеСком исследовании разведений гиалуронидазы представлены в табл,2, Полученные данные подтверждают линейный характер зависимости между концентрацией фермента и флюоресценцией в диапазоне 0,001-0,007 ОД энзима в пробах.

С целью проверки возможной чувствительности метода инкубацию удлиняли до

24 ч (спектрофотометрия, табл.3).

Из табл.3 видно, что при проведении соответствующего числа измерений можно получить достоверную разницу между контролем и, например, 2-й пробой, что позволяет открыть менее 0,0001 ОД фермента в пробе. Используя эти данные, был подсчитан также коэффициент корреляции r между количеством гиалуронидазы в пробах и оптической плотностью Е, Он оказался равен

0,97.

При исследовании способа на воспроизводимость получены следующие данные (см, табл.4). Прй изучении же воспроизводимости контролей К eað, составил 6,09 Д.

Данйые, подтверждающие возможность применения метода при различных рН (по крайней мере — от 2,2 до 8,0) приведены в табл,5, Максимальная активность фермента была обнаружена в Na-фосфатном буфере. рН 7,0, Определение сывороточной гиалуронидазы.

В ходе выполнения основного эксперимента к 1 объему (0,2 мл) субстрата добавляют 1 объем (0,2 мл) 0,02М ацетатного буферного раствора рН 3,8, с 0,004М ЭДТА и 0,15М NaCI, содержащего сыворотку больных или здоровых лиц, предварительно разведенную в 1000 раз на буфере, 15 Смесь инкубируют 2 ч при температуре

37ОС, По окончании инкубации в среду добавляют 0,1 мл (1/4 часть объема смеси)

20%-ного раствора Тритона Х-305. Встряхивают, оставляют стоять на 5 мин при комнат20, ной температуре. Далее на поверхность проб наслаивают 20 мкл (1/25 часть объема), содержащих 200 мкг риванола. Образцы инкубируют еще 5 мин при комнатной температуре. После этого их встряхивают

25 вторично для образования сгустка. Пробы центрифугируют при 1000 об/мин в течение

1 мин, надосадок сливают, образец однократно отмывают дистиллированной водой, Далее к нему добавляют 0,5 мл соответствующего экстрагирующего раствора и помещают в кипящую водяную баню при 100 С на 5 — 10 мин.При использовании очищенного препарата ГК в качестве экстрагирующего раствора применяют 1н, H CI.

После этого пробы разводят дистиллированной водой до 3 мл и затем детектируют.

Определение проводят либо фотоэлектроколориметрически (3 светофильтр, толщина рабочего слоя кюветы 0,5 см), либо спектрофотометрически (длина волны — 402 нм, толщина слоя — 1 см), либо флюорометрически (длина волны возбуждения — 402 нм, флюоресценции — 480 нм; в случае использования флюорометра "БИАН" — светофильтры с максимумами 365 и 470 нм, соответственно, объем проб доводится до 5 мл). Измерения проводят против дистиллированной воды или против раствора риванола известной (12,5 мкг в пробе) концентрации при флюорометрии.

Полученные после детекции величины сравнивают в предварительно выстроенной калибровочной кривой по стрептококковой гиалуронидазе.

Результаты обследования 12 здоровых доноров (1-12), 3 больных (l. II, II! — соответстненно — ревматоидный артрит, рак печени, системная красная волчанка) представлены в

1786071

30

40

45 ется

2 контроля — буферный раствор, 1 — прогретая до 100 С, разведенная 1/1000 сыворотка больного ревматоидным артритом.

Из табл.6 следует, что уровень гиалуронидазы в сыворотках здоровых доноров составляет 0,139 + 0,0032, больных — 0,0636

0,08 ед. оптической плотности (р < 0,05). В среднем уровень гиалуронидазной активности при патологии выше, чем в норме. Пересчет на содержание фермента в 1 мл пробы проводят, как описано выше.

Наконец, прогревание пробы до 100 С практически полностью ингибирует гиалуронидазную активность (см, контроли в табл.б).

Определение гиэлуронидазной активности в иммуноглобулинах.

В реакции применяют пэпаинизированный препарат ГК.

В ходе выполнения основного эксперимента к 1 объему(0,2 мл) субстрата добавляют 1 объем (0,2 мл) 0,02М фосфатного буферного раствора рН 7,0, с 0,004М ЭДТА и 0,15M NaCI, содержащего иммуноглобилины в концентрации 2 мг/мл. Все пробы и контроль (гиалуроновая кислота и буфер) ставили в триплетах.

Смесь инкубируют 24 ч при температуре

37 С, Для предотвращения микробной контаминации в среду добавляют азид Ма до конечной 0,25%-ной концентрации. По окончании инкубации в смесь вносят 0,1 мл (1/4 часть объема смеси) 20%-ного раствора

Тритона Х-305. Встряхивают, оставляют стоять на 5 мин при комнатной температуре.

Далее на поверхность проб наслаивают 20 мкл (1/25 часть объема), содержащих 250 мкг риванола, Образцы инкубируют еще 5 мин при комнатной температуре. После этого их встряхивают вторично для образования сгустка. Пробы центрифугируют при

1000 об/мин в течение 1 мин, надосадок сливают, образцы однократно отмывают дистиллированной водой. Далее к ним добавляют 0,5 мл 1 í HCI и помещают в кипящую водяную баню при 100 С на 5 — 10 мин.

После этого пробы разводят дистиллированной водой до 3 мл и затем детектируют. Определение проводят либо фотоэлектроколориметрически (3 светофильтр, толщина рабочего слоя кюветы 0,5 см), либо — спектрофотометрически (длина волны — 402 нм, толщина слоя.— 1 см), либо флюорометрически (длина волны возбуждения — 402 нм, флюоресценции — 480 нм; в случае использования флюорометра "БИАН" — светофильтры с максимумами 365 и

470 нм, соответственно, объем проб доводят до 5 мл). Измерения проводят против дистиллированной воды или против раствора риванола известной (12,5 мкг в пробе) концентрации при флюорометрии.

Полученные после детекции величины сравнивают с предварительно выстроенной калибровочной кривой по стрептококковой гиалуронидазе при инкубации в течение 24 ч.

Результаты представлены в табл,7.

Из табл.7 следует, что иммуноглобулины больного с ревматоидным артритом достоверно (р < 0,001) усиливают расщепление гиалуроновой кислоты по сравнению со здо- ровыми лицами и со спонтанным гидролизом субстрата. Построение калибровочной кривой в течение 24 ч (no стрептококковой гиалуронидэзе) позволяет количественно оценить гиалуронидазную активность антител (см, табл.3). Она соответствует приблизительно 0,0005 ОД в 0,1 мл препарата иммуноглобулинов.

Данное приложение способа представляется важным, поскольку энзимоподобное действие иммуноглобулинов является в последнее время предметом повышенного интереса исследователей.

Определение гиалуронидазной активности в микробных культурах, С целью определения гиалуронидазной активности микробных клеток применяли следующую модификацию метода: суточные культуры микроорганизмов выращивали на плотных питательных средах. 1-2 петли материала суспендировали в физиологическом растворе. Мутность взвеси оценивали по поглощению при 600 нм на СФ-26. При необходимости ее доводили до 0,2 физиологическим раствором.

0,1 мл суспензии микробных тел, 0,1 мл физиологического раствора смешивали с 0,2 мл гиалуроновой кислоты (конечная концентрация — 1 мг/мл). Время инкубации 2 ч.

Предварительные эксперименты показали, что при выраженной гиалуронидазной активности культур сгусток в опыте не обраэуПоэтому в дальнейших экспериментах осуществляли 5-кратные разведения исходной взвеси. Результат определения гиалуронидазной активности некоторых штаммов золотистых стафилококков представлен в табл,8 (спектрофотометрия).

Сопоставление чувствительности предлагаемого метода с используемыми в настоящее время.

А. Турбидиметрия.

Исследование проводили по известному методу, Время инкубации 2 ч, при температуре 37 С, Условия эксперимента (рН, ионная сила) соответствовали предлагаемому методу.

1786071

Таблица1

Результаты определейия гиалуронидазной активности с различными разведениями энзима (СФ-метрия), 1 2

0,247 0,19

0.5

С,О

0.091 0,072

0,034

0.129

0,255

Сгустка нет

0,152

Примечание: С- концентрация фермента s пробах в опытных дозах )/1000;

Е- оптическая плотность образцов, Е контролей - 0,27 и 0,276.

При оценке результатов данного опыта выяснилось, что эа 2 ч в турбидиметрии открывается лишь от 0,1 до 0,01 ОД фермента в пробе, что по меньшей мере в 20 раэ ниже чувствительности предлагаемого способа.

В. Вискоэиметрия.

Вискозиметрию проводили в вискозиметре Оствальда с временем протекания контрольного буфера 6.,67 с.

Соотношения реагентов в дайном эксперименте по-прежнему соответствовали данному методу, Вискозиметрически за 2 ч открывалось не более 0,015-0,02 ОД фермента, что также устуйает е чувствительности нашему методу приблизительно йа йорядок, С. Метод муцинового сгустка.

Постановку метода муцинового сгустка проводйли по известным рекомендациям.

Дополнение к условиям заключалось в том. что реакцию проводили на Йа-фосфатном буфере рН 7,0 (как и в данном способе). . В результате оказалось, что муциновый сгусток достоверйо открывает не более 0,02

ОД гиалуронидазы в пробе за 2 ч. Это в 20 раз ниже чувствительности йредлагаемого способа.

О. Определение гиалуронидазы по концевому й-ацетилглюкаэамийу. . Оптимальные условия для стрептококковой гиалуронидазы соответствовалй предлагаемому методу.

Сравниваемый метод открывал за 2 ч

0,005-0,01 ОД гиалуройидаэы; что в 5-10 раэ уступает по чувствительности предлагаемому способу.

Подйтожйвая вышеизложенйое, следует отметить, что предлагаемый метод в 5-20 раз чувствительнее наиболее широко применяемых способов детекции гиалуронидазной активности.

Эффективность метода.

Эффективность способа заключается в том, что он позволяет повысить чувствительность метода, по сравнению с прототипом в

5 10 раз, расширяет диапазон рН определения ферментативной активности гиалуронидазы, дает возможность точной количественной оценки содержания фермента.

Метод пригоден для массовых исследо10 ваний.

Формула изобретения

1. Способ определения гиалуронидазной активности, включающий инкубацию

15 испытуемого образца, содержащего фермент с гиалуроновой кислотой, введение в полученную смесь сгусткообразователя и учет результатов, о т л и ч а ю.шийся тем, что, с целью расширения диапазона рН on20 ределения и повышения чувствительности способа, в качестве сгусткообразователя используют 0,75-1.25 -ный раствор риванола, который добавляют к смеси в соотношении 1:25, после образования сгу25 стка из него экстрагируют риванол 1Н раствором соляной кислоты или смесью равных объемов 1н. раствора соляной и концентрировайной серной кислоты на кипящей водяной бане в течение 5-10 мин, затем в

30 экстракте определяют концентрацию риванола путем измерения оптической плотности экстракта колориметрическим методом при длине волны 402 нм или флюоресценции экстракта при длине волны возбужде35 ния 402 нм и эмиссии 480 нм и по его . концентрации определяют активность гиа луронидазы;

2, Способ по п.1, отличающийся тем, что перед введением риванола в смесь

40 добавляют 20 тритон Х-305 или Х-100 в соотношении 4:1 и инкубируют 5 мин.

1786071

Таблица2

Флюорометрическое определение гиалуронидазы определение проводили на спектрофлюориметре Hibachi, флюоресцентный контроль (12,5 мкг риванола в пробе) постоянен - 50 мкА.

Примечание:

Таблица3

-"С 05 1, 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Е 0,3 0,24 0,212 0,205 0,125 0,119 0,135 0,073 0,049 0,03 0,019

Примечание: С - концентрация стрептококковой гиалуронизады,ОД в пробе/10000; значение контрольных проб - 0,315, 0,294 и 0,304.

Таблица4

Воспроизводимость метода в опыте (0,003 ОД фермента в пробе ) по данным спектрофлюориметрии.

Примечание: флюоресцентный котроль постоянен и равен 50 мкА.

Таблица5

Зависимость активности стрептококковой гиалуронидазы от природы использованных буферов (СФ - метрия ) Зависимость между концентрацией стрептококкового знзима и оптической плотностью при инкубации в течение 24 ч a Na-фосфатном буфере, 1786071

Таблица6

Сыворочнзя гиалуронидазная активность в норме и прн патологии.

10 11 12

3 4

0,12 0,137

0,15 0,155 0,139

0,145 0,145 0,135

0,13

0,135

0.122

0,155

Продолжение табл.6

Таблица7

Гиалуронидазная ьктивностй антител здоровых лиц и больных ревматоидным артритом. ивно

Прймечание; экстинкция койтроля без антител: Е - 0,300, 0,305, 0,28.

Таблица8

Примечание: Е ср, контролей - 0,325.

Редактор Т.Иванова

Заказ 227 Тираж . Подписно»

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственн i-нзу,ательский комбинат "Патент", r. Ужгор)д у .Гагарина, 101

N пробы ет с

То

"оставитель И.Чаплина

Техред М.Моргентал Корректор М.Ткач