Способ определения алкил-динитрофенолов в биологическом материале

 

Использование: в аналитической химии. Сущность изобретения: биологическую пробу измельчают, неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения объединяют и упаривают до сухого остатка, остаток растворяют в гидрофобном растворителе , обрабатывают водно-щелочным раствором, щелочной раствор отделяют, подкисляют до рН 2-3, экстрагируют диэтиловым эфиром, экстрагент испаряют, остаток растворяют в ацетоне и хроматографируют в тонком слое силикэгеля в системе растворителей хлороформ-Гексан (7:4). 4 табл. СО с

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛ ИСТИЧ Е СКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 6 01 N 31/00, 30/90

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИ4ЕТЕЛЬСТВУ

Ф

1 ) о (21) 4884097/04 (22) 19.11.90 (46) 07.01.93. Бюл. М 1 (71) Курский государственный медицинский институт (72) В.К.Шорманов и А.B,Íåñòåðîâà (56) 1. Швайкова М.Д. Токсикологическая химия, М.; Медицина, 1975, с.119 — 123.

2. Крамаренко В.Ф. Химико-токсикологический анализ, К,: Вища школа, 1982, с,123 — 124.

3, Лабораторные исследования в ветеринарии. Химико-токсикологические методы. ред, Б,И.Антонова, М,; Агропромиздат, 1989, с,167. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛКИЛДИНИТРОФЕНОЛОВ В БИОЛОГИЧЕСКОМ

МАТЕ РИАЛ Е

Изобретение относится к биологии и токсикологической химии, а именно к способам определения алкилдинитрофенолов в биологическом материале, и может быть использовано в практике санэпидемстанций, химико-токсикологических и ветеринарных лабораторий. Способ относится к числу массовых.

Известен способ определения органических веществ в биологическом материале путем измельчения исследуемого биологического объекта, неоднократного настаивания с этанолом (каждый раз в течение 1 сут), объединения вытя)кек. сгущения объединенного извлечения, осаждения в нем белков абсолютным этанолом, фильтрования, упаривания фильтрата анализируемых соединений органическим растворителем сначала из кислого, а затем из щелочного раствора. Ыц» 1786426 А1 (57) Использование: в аналитической химии.

Сущность изобретения: биологическую пробу измельчают, неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения объединяют и упаривают до сухого остатка, остаток растворяют в гидрофобном растворителе, обрабатывают водно-щелочным раствором, щелочной раствор отделяют, подкисляют до рН 2 — 3, экстрагируютдиэтиловым эфиром, экстрагент испаряют, остаток растворяют в ацетоне и хроматографируют в тонком слое силикагеля в системе растворителей хлороформ-гексан (7;4). 4 табл.

Способ трудоемок, требует значительных затрат времени на его осуществление, характеризуется низкой степенью извлечения алкилдинитрофенолов и малой селек-, ти Вностью.

Известен способ определения органических веществ кислого характера (к которым относятся и алкилдинитрофенолы) в биологическом материале, заключающийся в измельчении биологического объекта, обработке водным раствором гидроксида натрия, центрифугировании, обработке центрифугата вольфраматом натрия в кислой среде при кипячении на юдяной бане, отделении осадка центрифугированием в течение получаса, экстракционном выделении анализируемых соединений из центрифугата эфиром с последующим подщелачиванием центрифугата и повторной экстракции эфиром.

1786426

С пособ малоселективен, отличается низкой степенью извлечения алкилдинитрофенолов, Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемым результатам является способ определения алкилдинитрофенолов (каратана) в биологических объектах путем измельчения биологической ткани, неоднократной ее обработки порциями гексана каждый раз в течение 30 мин, отделения гексановых извлечений, их объединения и упаривания до сухого остатка с последующим растворением остатка в легколетучем органическом растворителе, хроматографированием в тонком слое силикагеля в системе растворителей гексан-ацетон (4:1).

Способ характеризуется недостаточно высокими чувствительностью и селективностью, Цель достигается предлагаемым способом, который заключается в том, что биологическую ткань (например, ткань печени) измельчают, неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения объединяют и упариваютдо сухого остатка, остаток растворяют в гидрофобном растворителе, обрабатывают водно-щелочным раствором, щелочной раствор отделяют, подкисляют до рН 2-3, экстрагируют диэтиловым эфиром, экстрагент отгоняют, остаток растворяют в ацетоне и хроматографируют в тонком слое силикагеля в системе растворителей хлороформ-гексан (7:4).

Сопоставительный анализ предлагаемого решения и прототипа показывает, что предлагаемый способ отличается от известного тем, что биологическую ткань обрабатывают ацетоном, сухой остаток растворяют в гидрофобном растворителе, обрабатывают щелочным раствором, щелочной раствор отделяют, подкисляют до рН 2 — 3, экстрагируют диэтиловым эфиром, экстрагент испаряют, остаток растворяют в ацетоне и хроматографирование осуществляют в системе растворителей хлороформгексан при их объемном соотношении 7:4, Сравнение предлагаемого решения не только с прототипом, но и с другими техническими решениями в данной области техники не позволяет выявить в них признаки, отличающие предлагаемое техническое решение от прототипа, что позволяет сделать вывод о соответствии предлагаемого технического решения критерию существенных отличий.

Способ осуществляется следующим образом. Биологическую ткань, содержащую алкилдинитрофенолы, измельчают, трижды настаивают с ацетоном (каждый раз в течение получаса), ацетоновые извлечения тделяют от твердых частиц биоматериала объединяют, ацетон испаряют, сухой ос аток растворяют в гидрофобном раствори еле, экстрагируют водно-щелочным раств ром, щелочнои раствор отделяют, подкисляют до рН 2 — 3, экстрагируют диэтиловым эфиром, ют в лое

10 оро2-метил-4,6-динитрофенола, тщательн ремешивают биологическую ткань с ве вом и оставляют на 1 сут при 18 — 20 истечении этого времени смесь зал в

20 100 мл ацетона и выдерживают 0,5 ч, одически перемешивая, Извлечение от ют и операцию настаивания повторяю дважды. Ацетоновые вытяжки объединя испаряют до сухого остатка в токе во д при комнатной температуре. Остаток растворяют в 50 мл хлороформа. Получе ный раствор трижды экстрагируют щело ным буферным раствором с рН 9,5 (порция и по

50 мл каждая), Щелочные экстракты от елярас2 — 3 эфичения аток сят в ят до аноской пластины типа Силуфол UV-254 и хрома ографируют в системе растворителей хлоро ормгекса н (7:4). 2-Метил-4,6-ди н итро енол проявляется на хроматограмме в вид желтого пятна с Вг=0,42, Для определения количества извлеченного 2-метил-4,6-динитрофенола и ст пени извлечения участок хроматографич ской пластины с пятном вещества выреза, обрабатывают 5 мл диметилформам да и фильтрую образующийся окрашенны раствор в спектрофотометрическую к вету.

Оптическую плотность раствора изм ряют на спектрофотометре СФ-26 при длин волны 435 нм. Измерения проводят на фоне раствора, полученного в контрольном опы50

55 те. Количественное содержание 2-метил4,6-динитрофенола определяют по уравнению калибровочного графика и Inepeнную ка

45 экстрагент отгоняют, остаток раствор ацетоне и хроматографируют в тонком силикагеля с системе растворителей х форм-гексан (7:4).

Пример 1, Определение 2-мети динитрофенола в ткани печени, К 50 г мелкоизмельченной ткани св трупной печени человека прибавляют ют, объединяют, подкисляют 24%-ны твором хлороводородной кислоты до р и экстрагируют порциями диэтиловог ра трижды по 100 мл. Эфирные извле объединяют, эфир испаряют. Сухой ос растворяют в ацетоне, раствор перен мерную колбу объемом 50 мл и довод метки ацетоном. 0,1 мл этого раствора сят на линию старта хроматографич считывают на навеску вещества, внесе в биологический материал.

Построение калибровочного граф жей

5мг пеест. По ают ериеляеще ют, уха

1786426

На линию старта хроматографической пластины типа Силуфол UV-254 наносят

0,05, 0,10, 0,20, 0,40, 0,80, 1,20, 1,60 мл

0,005 / раствора 2-метил-4,6-динитрофенола в ацетоне и осуществляют хроматографирование в системе растворителей хлороформ-гексан (7:4). 2-Метил-4,6-ди н итрофенол обнаруживается на хроматограмме в виде желтых пятен с Rf=0,42. Участки пластины с находящимися на них пятнами вещества вырезают и элюируют каждое пятно 5 мл диметилформамида в течение 5 мин, Извлечения фильтруют непосредственно в спектрофотометрические кюветы через бумажный фильтр, оптическую плотность измеряют при 435 нм на спектрофотометре, Раствор сравнения — элюат, полученный при проведении контрольного опыта. По результатам измерений строят график зависимости оптической плотности растворов от концентрации определяемого вещества.

Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение калибровочного графика, которое в данном случае имеет вид

D=0,08495 С+0,0005, где D — оптическая плотность;

С вЂ” концентрация окрашенного раствора, мкг/мл.

Результаты определения 2-метил-4,6динитрофенола в ткани печени представлены в табл,1.

Пример 2. Определение 2-втор-октил4,6-динитрофенола в ткани печени.

К 50 г мелкоизмельчен ной ткани свежей трупной печени человека прибавляют 26 мг

2-втор-октил-4,6-динитрофенола, тщател ьно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на 1 сут при 1820 С. По истечении этого времени смесь заливают 100 мл ацетона и выдерживают

0,5 ч, периодически перемешивая. Извлечение отделяют и операцию настраивания повторяют еще дважды, Ацетоновые вытяжки объединяют. испаряют до сухого остатка в токе воздуха при комнатной температуре.

Остаток растворяют в 50 мл гексана. Полученный раствор трижды экстрагируют щелочным раствором (универсалbíый буфер с рН 11,98, разбавленный водой в четыре раза) порциями по 50 мл. Щелочные экстракты отделяют, объединяют, подкисляют 24/ным раствором хлоповодородной кислоты до рН 2 — 3 и экстрагируют порциями диэтилового эфира трижды по 100 мл. Эфирные извлечения объединяют, эфир испаряют.

Сухой осlаток растворяют в ацетоне, раствор переносят в мерную колбу объемом 50 мл и доводят до метки ацетоном, 0,1 мл этого раствора наносят на линию старта хроматографической пластины типа Силу25

55 фол UV-254 и хроматографируют в системе растворителей хлороформ-гексан (7;4), 2втор-Октил-4,6-динитрофечол проявляется на хроматограмме в виде желтого пятна с

Rf=0,76, Для определения количества извлеченного 2-втор-октил-4,6-динитрофенола и степени извлечения участок хроматографической пластины с пятном вещества вырезают, обрабатывают 5 мл диметилформамида и фильтруют образующийся окрашенный раствор в спектрофотометрическую кювету. Оптическую плотность раствора измеряют на спектрофотометре

СФ-26 при длине волны 445 нм. Измерения проводят на фоне раствора, полученного в контрольном опыте. Количественное содержание 2-втор-октил-4;6-динитрофенола определяют по уравнению калибровочного графика и пересчитывают на навеску вещества, внесенную в биологический материал.

Построение калибровочного графика.

На линию старта хроматографической пластины типа Силуфол UV-254 наносят

0,025, 0,05, 0,10, 0,20, 0,30, 0,40, 0,50, 0,60, 0,70, 0,80, 0,90, 1,00 мл 0,0057ь-ного раствора 2-втор-октил-4,6-динитрофенола в ацетоне и осуществляют хроматографирование в системе растворителей хлороформ-гексан (7:4). 2-втор-Октил-4,6-динитрофенол обнаруживается на хроматограмме в виде желтых пятен с Rf=0,76. Участки пластины с находящимися на них пятнами вещества вырезают и элюируют каждое пятно 5 мл диметилформамида в течение 5 мин. Извлечения фильтруют непосредственно в спектрофотометрические кюветы через бумажный фильтр, оптическую плотность измеряют при 445 гм на спектрофотометре. Раствор сравнения — элюат, полученный при проведении контрольного опыта, По результатам измерений строят график зависимости оптической плотности растворов от концентрации определяемого вещества, Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение калибровочного графика, которое в данном случае имеет вид

D=0,05545 С+0,00504, где D — оптическая плотность;

С вЂ” концентрация окрашенного раствора, мкг/мл.

Результаты определения 2-втор-октил4,6-динитрофенола в ткани печени приведены в табл.2.

Пример 3. Определение 4-втор-октил2,6-динитрофенола в ткани печени.

К 50 г мелкоизмельчен ной ткани свежей трупной печени человека прибавляют 25 мг

4-втор-октил-2,6-динитрофенола, тщател ь1786426 пени извлечения . участок хроматографической пластины с пятном вещества вырезают, обрабатывают 5 мл диметилформамида и фильтруют образующийся

35 окрашенный раствор в спектрофотометре

СФ-26 при длине волны 490 нм; Измерения проводят на фоне раствора, полученного в контрольном опыте. Количественное содержание 4-втор-октил-2,6-динитрофенола определяют по уравнению калибровочного графика и пересчитывают на навеску вещества, внесенную в биологический материал.

Построение калибровочного графика, На линию старта хроматографической пластины типа Силуфол UV-254 наносят

0 02, 0 04, 0 08, 0,16, 0 32, 0 48, 0 64, 0 80 мл

0,005Д-ного раствора 4-втор-октил-2,6-динитрофенола в ацетоне и осуществляют хроматографирование в системе растворителей хлороформ-гексан (7:4). 4втор-Октил-2,6-динитрофенол обнаруживается на хроматограмме в виде желтых пятен с Rf=0,70. Участки пластины с находящимися на них пятнами вещества вырезают и элюируют каждое пятно 5 мл диметилформамида в течение 5 мин, Извлечения фильтруют непосредственно в спектрофотометрические кюветы через бу45

55 но перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на 1 сут при 18—

20 С. По истечении этого времени смесь заливают 100 мл ацетона и выдерживают 0,5 ч, периодически перемешивая, Извлечение 5 отделяют и операцию настаивания повторяют еще дважды, Ацетоновые вытяжки объединяют, испаряют до сухого остатка в токе воздуха при комнатной температуре. Остаток растворяют в 50 мл гексана. Полученный 10 раствор трижды экстрагируют щелочным раствором (универсальный буфер с рН

11,98, разбавленный водой в четыре раза) порциями по 50 мл. Щелочные экстракты отделяют, объединяют, подкисляют 24 - 15 ным раствором хлороводородной кислоты до рН 2 — 3 и экстрагируют порциями диэтилового эфира трижды по 100 мл. Эфирные извлечения объединяют, эфир испаряют, Сухой остаток растворяют в ацетоне, рас- 20 твор переносят в мерную колбу объемом 50 мл и доводят до метки ацетоном. 0,1 мл этого раствора наносят на линию старта хроматографической пластины типа Силуфол UV-254 и хроматографируют в системе 25 растворителей хлороформ-гексан (7:4). 4втор-Октил-2,6-динитрофенол проявляется на хроматограмме в виде желтого пятна с

Rf=0,30.

Для определения количества извлечен- 30 ного 4-втор-октил-2,6-динитрофенола и стемажный фильтр, оптическую плотность измеряют при 590 нм на спектрофотоме ре, Раствор сравнения — элюат, получен ый при проведении контрольного опыта. По результатам измерений строят график завйсимости оптической плотности растворо от концентрации определяемого вещес ва.

Методом наименьших квадратов рассч тывают уравнение калибровочного граф ка, которое в данном случае имеет вид

0=0,02576 С+0,00482, где 0 — оптическая плотность„

С вЂ” концентрация окрашенного рас вора, мкг/мл.

Результаты определения 4-втор-ок ил2,6-динитрофенола в ткани печени прив дены в табл.3.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом повышает степень извлечения алкилдинитрофенолов из ткани печени 2,5 раза и чувствительность определения в 4 раза, В отличие от прототипа предлагае ый способ более селективен и позволяет о ределять алкилдинитрофенолы в присутс вии различных классов органических соед нений; производных тропана (тропино ого эфира d,l-траповой кислоты, скопино oro эфира 1-траповой кислоты), пиперидина (1,2,5-триметил-4-пропионилокои-4-фен ллпиперидина), хинуклидина (3-ацетокс хинуклидина), хинолина (P -äèýòèëàìèío тиламида-2-бутоксицинхониновой кисл ы), 4-(1 -метил-4 -ди этил а ми но)-7-хлорхинол и на, 2-(4 -н итр ости рил)-4-(1 -метил-4 -диэтиламинобутиламино)-6-метоксихинолина, 6 -ме оксихинолил-(4Я5-вин ил хинукл ид и л -(2 ) )карбинола), фенотиазина(2-хлор-10-(3 -д метиламинопропил)-фенотиазина), 10-(3 диметиламинопропил)-фенотиазина, 10-(2 -диметиламиноп ропил)-фенотиазина, хинолизидина(а-спартеина), пирролизидина (платифиллина), изохинолина (6,7-диме токси-1(3,4 -диметоксибензил)-изохинолина), ! фенантренизохинолина (морфина, ко еина), имидазола (пилокарпина).

Сравнительная характеристика пре лагаемого и известного способов предста лена в табл.4.

Формула изобретения

Способ определения алкилдинитр фенолов в биологическом материале путе измельчения пробы обработки органиче ким растворителем, упаривания, растворения полученного сухого остатка и хроматографирования раствора в тонком слое сил кагеля,отл ичающийс ятем, что,c це ью повышения чувствительности и селекти но1786426

Таблица 1

Результаты определения 2-метил-4,6-динитрофенола в ткани печени

Таблица 2

Результаты определения 2-втор-октил-4,6-динитрофенола в ткани печени

Таблица 3

Результаты определения 4-втор-октил-2,6-динитрофенола в ткани печени сти способа, в качестве органического растворителя используют ацетон, сухой остаток растворяют в гидрофобном растворителе, обрабатывают щелочным раствором, щелочной раствор отделяют, подкисляютдо рН 2 — 3, экстрагируютдиэтиловым эфиром, экстрагент испаряют, остаток растворяют в ацетоне и хроматографирование осуществляют в системе растворителей хлороформ — гексан при их

5 объемном соотношении 7;4.

1786426

Та блица 4

Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов (на примере 2-метил-4,6-динитрофенола) 1

Предлагаемый способ

Известный способ

Показатель

28, 834

81,304

Степень извлечения, 4

Чувствительность, мг в

50 г печени

0,5

Селективность

Составитель В. Шорманов

Техред М,Моргентал Корректор B

Редактор

Заказ 245 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открыти

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, Позволяет селективно определять алкилдинитрофенолы в присутствии производных тропана (тропинового эфира d, 1-троповой кислоты, скопинового эфира

1-троповой кислоты); пиперидина (1, 2, 5-триметил-4-пропионилокси-4-Фенилпиперидира); хинуклидина (3-ацетоксихинуклидина, 3-бензоилоксихинуклидина); хинолина (ф-диэтиламиноэтилами> та-2-бутоксицинхониновой кис( лоты), 4-(1 -метил-4 -диэтиламинобутиламино)-7-хлорхинолина, 2-(4 -нитростирил)-4-(1 ( метил-4 -диэтиламинобутилами"

I но) -6-метоксихинолина, 6 -метоксихинолил-(4 ) --(5-винилхинуклидил) -(2g -карбинола); фенотиазина L2-хлор-10-(3 -ди" метиламинопропил)-фенотиазина, 1 0-(3 -диметиламинопропил)фенотиазина, 10-(2 -диметиламинопропил)-фенотиазина хинолизидина (<"cïàðòåèíà); пирролизидина (платифиллина); изохинолина 6,7-диметокси-!(3,4 -диметоксибензил)-изоt хинолина; Фенатренизохинолина (морфина, кодеина); имидазола (пилокарпина) Не позволяет селективно определять алкилдинитрофенолы в присутствии производных тропана (тропинового эфира d, 1-троновой кислоты, скопинового эфира

1-троповой кислоты); пиперидина (1,2,5-триметил-4-пропионилокси-4-фенилпиперидина); хинуклидина (3-ацетоксихинуклидина, 3-бензоилоксихинуклидина); хинолина ()1-диэтиламиноэтиламида-2-бутоксицинхониновой кислоты), 4-.(1 -метил-4--диI ( этиламинобутиламино)-7-хлорхинолина 2-(4 -нитростирил)7

4-(1 "метил-4- диэтиламинобутил амино)-6"метоксихинолина;

6 -метокскхинолил-(4 )-(5-винилхинуклидил-(2) -карбинола фенотиазина f2-хлор-10-(3 -диметиламинопропил)-фенотиазина), 10 -(3 -диметиламинопропил)-Фенотиазине, 10-(2 -диметиламиноl пропил) -Фенотиазина .; хинолизидина (ю(-спартеина); пирролизидина (платифиллина); изохинолина (6, 7-диметокси-1- (3,4I диме то ксибенз ил) -изохино лина ; фенантренизохинолина (морфина, кодеина); имидазола (пилокарпина)