Способ получения протеолитических ферментов для обработки кожевенного сырья
Использование: биотехнология, в частности получение ферментов микробного происхождения и может быть использовано в кожевенном производстве для обработки кожевенного сырья. Сущность изобретения: способ предусматривает выращивание продуцента Streptomyces lavendulae ВКПМ S-910 на ферментационной среде, содержащей кукурузную муку, белковый препарат № 1 /ГОСТ 175-36-82/, сульфат магния и воду при следующем соотношении компонентов, г/л: кукурузная мука 18-20; белковый препарат № 1 7-10; сульфат магния семиводный 0,02-0,04; водопроводная вода до 1 л. Предложенный способ позволяет получить у продуцента коллагеназную активность 4-6 ед, лей/мл, а кератиназнуго активность 0,8-2,0 ед/мл, что превышает такие же активности в известном способе в 40 и 100 раз соответственно и приводит к полному обезволашиванию кожевенного сырья за несколько часов.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛ ИСТИ Ч Е С К ИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ
ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4833211/13 (22) 30.05.90 (46) 15,01.93. Бюл. ¹ 2 (71) Институт микробиологии АН СССР, Научно-производственное объединение, "Центральный научно-исследовательский институт кожевенно-обувной и ром ы шленности", Научно-производственное объединение "Биотехнология" (72) А.А.Имшенецкий, С.В.Лысенко, Н.СДемина, Ф.В,Миронов, Л.В,Белоброва, . Р.Н.Гребешова и Г.А.Молодова (56) 1. Патент СССР № 1001862, кл. С 12 N9/48,,1983.
2. Авт.св. СССР ¹ 1735364, С 12 N 1/14, 1989, Решение о выдаче по заявке
N 4772467/13 от 27.12.90, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ДЛЯ ОБРАБОТКИ
КОЖЕВЕННОГО СЫРЬЯ
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности получения специфических протеолитических ферментов микробного происхождения и может быть использовано в кожевенном производстве для обезволашивания кожевенного сырья.
Известны способы получения активных внеклеточных протеолитических ферментов для обработки кожевенного сырья, которые достигаются с помощью Aspergillus
parasliicus, Asp. orizae, Bacillus subtilis(протосубтилин ГЗх и Г10х), Streptomyces fradia, Streptomyces callgosus.
ЯХ, 1788010 А1 (я)з С 12 N 1/20, 9/58//(С 12 N 1/20, С 12 R 1:56) (57) Использование: биотехнология, в частности получение ферментов микробного происхождения и может быть использовано в кожевенном производстве для обработки кожевенного сырья, Сущность изобретения: способ предусматривает выращивание продуцента Streptomyces lavendulae
ВКПМ S-910 на ферментационной среде, содержащей кукурузную муку, белковый препарат ¹ 1 /ГОСТ 175 — 36-82/, сульфат магния и воду при следующем соотношении компонентов, г/л: кукурузная мука 18 — 20; белковый препарат N 1 7 — 10; сульфат магния семиводный 0,02-0,04; водопроводная вода до 1 л, Предложенный способ позволяет получить у продуцента коллагеназную активность 4-6 ед, лей/мл, а кератиназную активность 0,8 — 2,0 ед/мл, что превышает такие же активности в известном способе в
40 и 100 раз соответственно и приводит к полному обезволашиванию кожевенного сырья за несколько часов.
Недостатком способа получения протеаз с помощью грибных культур является длительность их выращивания и более высокая устойчивость спор к физическим воздействиям по сравнению с культурами актиномицетов. Из-за высокой вариабильности бактериальных продуцентов необходима постоянная селекция активных культур, В обоих случаях используются сложные, дорогостоящие, труднодоступные питательные среды, включающие пищевые компоненты. Кроме того, полученные в результате щелочные протеазы, которые в настоящее время используются в СССР, 1788010 действуют на лицевую мембрану, в результате чего образуется велюрообразное лицо готовой кожи, т.е. происходит частичное разрушение ее поверхности, Наиболее близким к предлагаемому нами является способ, достигаемый с помощью Streptomyces caIIgosus, Недостатком способа-прототипа является длительность выращиванля штамма-продуцента (94 ч), дорогостоящая питательная среда с пищевыми компонентами, недостаточно высокая протеолитическая активность внеклеточных протеаз, а также использование для обработки кожевенного сырья ферментного препарата, а не культуральной жидкоcTM, RTo обуславливает J>onoJJHMTeJibHble затраты на реактивы и усложняет технолоГИ 1О, Целью изобретения является способ получения протеслитических ферментов, используемых для обработки кох<евен ного сы püÿ, пpeä,JñìaTpMÁalou4èé выращивание продуце,та 8<гертогпусеэ lavendulae на ферментационной среде, содержащей источники углерода и азота, а такх<е сульфат магния и воду, с рн 6,4 — 6.8, до дости>1<ения максимальной активности, отличающи1лся тем, что с цел. ю повышенля кератинаэной активности в комплексе протеолитических ферментов и удеи.евления в качестве источнлка углерода и азота используют кукурузную муку 1л белковый препарат N 1 (ГОСТ
1! 7536-82) при следу1ощем соотношении компонентов в г/л; кукурузная мука -- 18-20, белковый препарат N 1 — 7 — 10, MgS04 . 7Н2О—
0,02-0,04; водопроводная вода — до 1 л.
Поставленная цель достигается тем, что актиномицет Streptomyces Iavendulae
ВКПМ-S-910, культивирование которого осуществляют на питательной среде, содер>кащсй (г/л): кукурузную муку — 18-20; белковый препарат № 1 (ГОСТ 17536-82, цена
27 коп/кг) — 7 — 10; Mg(SO 0,04; воду водопроводную, при рН 6,4-6,8, TeMnepaTópå 26-28 С e Te eMMe 48 — 72 ч. Посевной материал выращива1от на питательной среде следу1ощего состава (г/л): кукурузный экстракт — 8,0-10,0; крахмал— 4,0 — 5,0; мел технический — 4,0-5,0; КаО— 4,0 — 5,0; (ИН4)2 SO4 — 4,0 — 5,0; вода водопроводная, рН 6,4-6,8, температура 26-28 С„ время культивирования 24 — 48 ч, на качалке (180 — 200 OG/MMM). Посевной JJaTepMaJ1 вносят в количестве 10 об.7; 0,1, 5 Для определения протеолитической ак-. 55 тивности культуральную жидкость отделяют от мицелия центрифугированием, фильтрованием или сепарированием, Внеклеточную протеолитическую активность определяют по модифицированному методу Кунитца и выражают в ПЕ/мл, Протеолитическая активность культуральной жидкости составляет 40 — 90 ПЕ/мл по Кунитцу. Отличительными признаками данного способа является то, что в качестве продуцента использу1от актиномицет Streptomyces ! avånduIàå ВКПМ вЂ” S — 910 (ИНMÈ-36-Sl) культивирование которого проводят в течение 47 — 72 часов при 26 — 28О, рН 6,4-6,8, на питательной среде, содержаще л (г/л): кукурузную муку — 18-20; белковый препарат ¹ 1 — 7,0-10,0; М9804 — 0.02-0,04; воду водопроводную. При температуре ниже и выше указанных пределов рост культуры замедляется или прекращается. При рН нлже 6,4 и выше 6,8 набл1одается резкое снижение активности. При сокращении (менее 48 часов) или увеличении времени выращивания (более 72 часов) активность также уменьшается, При лабор-торных испытаниях в барабанчиках на 3 л проводят мягче1-:ие шкурок крупного рогатого скота мокросоленого способа консервирования по действующей технологии, Затем вводят культуральную жидкость при рН 6,4 — 6,8 и набл1одают за процессом обеэволашиванля во времени. Изобретение илл1острируется следуlо щими примерами. Пример 1, Берут культуру актиномецета Stãåðtîmóñås lavendulae ВКПМ-S910, В колбы Эрленмейера на 250 мл вносят по 50 мл питательной среды, состоящей (г/л); кукурузной муки — 20, белкового препарата № 1 — 10, MgS04 7Н О вЂ” 0,04, водопроводной воды. Устанавливают рН 6,8. Плтательная среда для посевного материала, который вчосят в колбы в количестве 10% от общего объема, состоит (г/л) из; кукурузного экстракта — 10; крахмала — 5, мела технического — 5; NaCI — 5; (КН 1) — 5, воды водопроводной, рН 6,8. Выращивание ведут при 28 С на качалке (200 об/мин) в течение 48 ч. Выросшую биомассу отделяют центрифугированием и определяют протеолитическую активность культуральной жидкости, Она составляет 62 ПЕ/мл по Кунитцу и 5,7 ед/мл по Ансону. Кул ьтурал ьну1о жидкость используют для обработки кожевенного сырья в лабораторны" условиях, В "àðàáàí÷èêàõ «а 3 л проводят мягчение шкурок крупного рогатого скота мокросоленого способа консервирования по действующей технологии, Отмока 1-я. Температура 30 — 35 С, жидкостной коэффициент (ЖК) = 2,5. Продолжительность 1 час. В барабанчики подают воду (1,5), Вносят сульфид натрия — 1 г/л, ПР,В— 1 г/л и опускают шкурки с волосяным покровом. 1788010 10 25 50 Мягчение. Подают воду (1,5 л), температура 30 С, ЖК = 2,5. Культуральная жидкость из расчета — на 1 г сырья ед/мл ПА (по Ансону). На 600 г сырья вносят 22 мл культуральной жидкости, через 5 часов сливают ванну. Шкурки полностью обезволошены. Шерсть сохранена. Мездра удаляется. Шкурки эластичные, мягкие, с хорошей потяжкой. Лицевая поверхность кожи нешероховатая. Пример 2. Берут культуру актиномицета Streptomyces lavendulae ВКПМ-S-910. В ферментеры с рабочим объемом 6 л внося г по 5 л питательной среды следующего состава (г/л): кукурузная мука — 18, белковый препарат M 1 — 8,0; MgSO< 7Н20 — 0,2; вода водопроводная, рН 6,8. Затем вносят по 10% об, посевного материала, выращенного как в примере 1. Культивирование проводят при 28 С в течение 72 ч с использованием мешалки для аэрации (350 об/мин). Выросшую биомассу отделяют от культуральной жидкости с помощью сепаратора. Протеолитическая активность культуральной жидкости составляет 90 ПЕ/мл по Кунитцу и 8,7 ед/мл по Ансону. Культуральную жидкость используют в полупромышленных условиях для обработки кожи крупного рогатого скота для низа обуви. Промытое сырье подвергают отмоке, мездрению и обработке нейтральной и ротеазой с расходом 0,2% при 38 С, ЖК = 10, в течение 5 ч. После этого дополнительно обрабатывают при ЖК = 0,7, температуре 28 С, составом, содержащим 0,6% сульфида натрия и 1,2% гидроксида кальция, в течение 3 ч. Затем разбавляют водой до ЖК 1,5 и обработка продолжается в течение 8 ч. Последующий порядок проведения процессов операций по технологии производства, кож для низа обуви. Шкурки полностью сохранены, обезволошены, Шерсть сохранена, Шкурки эластичные, мягкие, с хорошей потяжкой, Лицевая поверхность кожи гладкая. Пример 3. Берут культуру актиномицета Streptomyces lavendulae ВКПМ-S-910. В колбы Эрленмейера на 250 мл вносят по 50 мл питательной среды, состоящей (г/л): кукурузной муки — 18; белкового препарата М1 — 7; MgS04 7Н20 — 0,02; воды водопроводной при рН 6,4, температуре 26 С. Питательная среда для посевного материала, который вносят в колбы в количестве 10% от общего обьема, состоит (г/л): кукурузного экстракта — 8,0; крахмала — 4,0; (МН4)2304 — 4,0; воды водопроводной, рН 6,4, температура 26 С. В ы ра щи ва н ие ведут на качал ке (200 об/мин), в течение 48 ч. Выросшую биомассу отделяют центрифугированием и определяют протеолитическую активность культуральной жидкости, Она составляет 40 ПЕ/мл по Кунитцу и 3,7 ед/мл по Ансону. Культуральную жидкость используют для обработки кожевенного сырья в лабораторныхусловиях, как в примере 1, из расчета на 1 г сырья 1 ед/мл ПА (по Ансону). Через 6 ч сливают ванну. Ш курки полностью обезволошены. Шерсть сохранена. Мездра легко удаляется. Шкурки мягкие, нешероховатые, с хорошей потяжкой, П р и и е р 4. Берут культуру актиномицета Streptomyces lavendulae ВКПМ вЂ” S-910, В колбы Эрленмейера на 250 мл вносят 50 мл питательной среды, состоящей (г/n): кукурузной муки — 20, белкового препарата М 1 — 10; MgS0p . 7HzO — 0,4; водопроводную воду, Устанавливают рН 6,8, Температура 28О. Выращивание ведут на качалке (200 об/мин) в течение 72 часов. Посевной материал выращивают на питательной среде следующего состава (г/n): кукурузный экстракт — 10, крахмал — 5, мел технический — 5, КаС! — 5, (MHn)ISO< — 5, вода водопроводная при рН 6,8. Вносят в колбы с ферментационной средой в количестве 10% от общего обьема. Выросшую биомассу отделяют путем сепарирования и определяют протеолитическую активность культуральной жидкости. Она составляет 87 ПЕ/мл по Кунитцу и 7,8 ед/мл по Инсону. Культуральную жидкость используют для обработки кожевенного сырья в лабораторных условиях, как в при- мере 1 и 3, из расчета на 1г сырья 1 ед/мл ПА (по Ансону). Через 8 ч сливают ванну. Шкурки полностью обезволошены, шерсть, сохранена; мездра легко удаляется, шкурки мягкие, эластичные, гладкие, с хорошей потя>ккой, Качество кожи идентично с полученными ранее по традиционной технологии и удовлетворяют требованиям ГОСТа. Протеолитические ферменты, получаемые с помощью предлагаемого способа, могут использоваться при обработке кожевенного сырья как для верха, так и для низа обуви, Ферментативный способ получения кожи для низа обуви предлагается впервые. Применение предлагаемого способа позволяет получать в 2 — 4,5 раза по Кунитцу и в 2,5 раза по Ансону более высокую протеолитическую активность, чем в способе-прототипе, в 2 раза менее продолжительный период выращивания продуцента при использовании дешевой, простой питательной среды, не содержащей пищевые компоненты. Высокая протеолитиче0 1788010 Составитель Н.Демина Техред M.Moðãåíòàë Корректор Н.Ревская Редактор Заказ 49 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101 ская активность дает возможность использовать для обезволашивания и мягчения кожевенного сырья,культуральную жидкость, а не осажденный из нее ферментный препарат, как в способе-прототипе. При использовании культуральной жидкости при рН 6,4-6,8 достигается удешевление и ускореНМе процесса обезволашивания, сокращение обычного цикла отмоко-зольных процессов для кож низа обуви, ускорение процесса диффузии при додубливании органическими растворителями. Снижается расход извести и сульфида натрия, уменьшается загрязненность сточных вод предприятий, Формула изобретения Способ получения протеолитических ферментов, для обработки кожевенного сырья, предусматривающий выращивание продуцента Streptomyces lavendulae ВКПМ-S-910 до достижения максимальной активности на ферментационной среде, со5 держащей источники углерода и азота, сульфат магния и воду, отличающийся тем, что, с целью повышения кератиназной активности и удешевления способа, в качестве источника углерода и азота используют ку10 курузную муку и белковый препарат М 1 при следующем соотношении компонентов, г)л: кукурузная мука 18 — 20; белковый препарат М 1 7 — 10; 15 сульфат магния семиводный 0,02 — 0,04; водопроводная вода до 1 л.
