Способ получения иммуносорбента для иммуноферментного анализа строфантина к
Использование: биохимия, фармацевтическая промышленность, медицина. Сущность изобретения: мембрану из поликапроамида с дламетром пор 0,2-0,4 мкм обрабатывают водным раствором смеси триэтилентетрамина, диэтиламино-2,3- эпоксйпропана и ди(2,3-эпоксипропилового) эфира в массовом соотношении с мембраной 1:2:2:1. Специфические антитела к строфантину К окисляют периодэтом. Окисленные антитела ковалентно связывают с обработанной мембраной. Образовавшиеся конъюгаты восстанавливают; боргидридом натрия. Изобретение позволяет повысить емкость по антигену до 64.2 мкг/мг сорбента. со с ковалентного связывания специфических антител к определяемому соединению с носителями-биогелем Р-300, целлюлозой и ее модифицированными формами. Недостатком ИС, полученных физической адсорбцией на носителях, является потеря сорбированных белков в процессе их использования . Наиболее близким к предлагаемому является способ получения ИС для иммуноферментного анализа (ИФА) СТР-К путем XIоо о о ю ч
ю4 н
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ
ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ щииюм вв Я Щ е ЩЩЯЩф
ВИВЯИф
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4809678/05 (22) 26.02,90 (46) 23.01.93. Бюл, М 3 (71) Институт биоорганической химии АН
БССР . (72) Д,И.Метелица, М.И.Савенкова, Е.И.Тарун, В.А.Артамонов, В.И.Грачек и Н.B.ÄåMKO (56) Туркова Я. Аффинная хроматография.
М„Мир, 1980, с. 282 386.
LiIly M.D. In Мейсара of Enzymology, Immobilized Enzymes. Ed. К. Mosbach. N-Y.:
Acad Press, 1979, ч. XLlV, р. 46-53.
Enzyme-lmmunoassay. Ed. Е.Т.Maggio, Васа Raton: CRC Press, 1983, р.175-176.
Иммуноферментный анализ./Ред.
Т,Т.Нго, Г.Ленхофф. — M.: Мир, 1988, с, 130133, 177-179, 250-251.
Аффинная хроматография./Ред. П.Дин, У.Джонсон, Ф.Мидл. — М,: Мир, с. 19-22.
66-67.
Савенкова М,И, Химико-фарм. журн., 1989, йг 1, с. 105-111.
Авторское свидетельство СССР .М 1281587, кл. С 08 J 5/18, 1986.
Изобретение относится к области биохимии, а именно, к способам получения иммуносорбейтов (ИС), и может быть использовано в фармацевтической промышленности и медицине.
Биохимическое определение строфантина К (CTP-К) и других сердечных гликозидов и гормонов основано на разделении свободных и связанных с антителами антигенов. Для этого используют ИС, приготовленные путем физической адсорбции или
„„Я2„„1789929 А1 (51)5 G 01 N 33/535, С 08 J 7/12 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСОРБЕНТА ДЛЯ ИММУНОФЁРМЕНТНОГО
АНАЛИЗА СТРОФАНТИНА К (57) Использование: биохимия, фармацевтическая промышленность, медицина. Сущность изобретения: мембрану из ноликапроамида с диаметром пор 0,2-0,4 мкм обрабатывают водным раствором смеси триэтилентетрамина, диэтиламино-2,3эпоксипропана и ди(2,3-эпоксипропилового) эфира в массовом соотношении с мембраной 1:2:2:1. Специфические антитела к строфантину К окисляют периодатом.
Окисленные антитела ковалентно связывают с обработанной мембраной. Образовавшиеся конъюгаты восстанавливают: боргидридом натрия. Изобретение позволя- 3 ет повысить емкость по антигену до 64,2 мкг/мг сорбента.
С: ковалентного связывания специфических антител к определяемому соединению с носителями-биогелем P-300, целлюлозой и ее модифицированными формами. Недостатком ИС, полученных физической адсорбцией на носителях, является потеря сорбированных белков в процессе их использования.
Наиболее близким к предлагаемому является способ йолучения ИС для иммуноферментного анализа (ИФА) CTP-К путем
1789929
45 . ковалентного связывания специфических, тел с АН-агароэой,:.
Недостатком указанного способа является недостаточная емкость получаемого
ИС (7,4 мкг/мг). 5
Цель изобретения — повышение емкости ИС по антигену.
Поставленная цель достигается модификацией поликапроамидной мембраны с диаметром пор О,2-0,4 мкм смесью триэтилентетрамина;"диэтиламино-2,3-эпоксипропана и ди-(2,3-эЪбксйпропилового) эфира, в массовом сбатношении с мембраной
1;2:2:1, обработкой модифицированной мембраны окисленными периодатом специфическими к CTP-К антителами, с последующим восстановлением конъюгатов боргидридом натрия.
Изобретение подтверждается -следую-" . щими примерами, .20
Пример 1. Пленочную мембрайу из поликапроамида с диаметром пор 0,2 мкм полученную по способу, площадью 280 см и весом 1 г йогружают в ванну содержащую в 95 мл воды 1 г триэтилентетрамина, 2 г 25 ди-(2,3-эпоксипропилового) эфира и 2 r диэтиламино-2,3-эпоксипропана на 20 мин.
Мембрану вынимают и сушат при комнатной температуре в течение 4 часов в фиксированном состоянии, после чего 30 термообрабатывают при 110 С в течение 10 мин. Фильтрационные характеристики модифицированной мембраны практически идентичны с характеристиками необработанной мембраны; однако катионная адсор- 35 бционная способность резко возрастает: время прохождения красителя метанилового желтого возрастает с 3 до 47 мин, что свидетельствует о высокой степени модифицирования. 40
1 мл лиофилизированной антисыворотки йротив CTP-К, полученной по известной методике (6), растворяют в 1 мл 0,02 M боФормула изобретения
Способ получения иммуносорбента для иммуноферментного анализа строфантина 50
К на основе полимерного носителя, включающий стэдйЮ"йеридатного окисления специфических к строфантину К антител, их ковалентное-связьгвание с носителем с последующим восстановлением образовав- 55 шихся коньюгатов боргидридом натрия, о т-" ратного буфера с рН 9;5 и осаждают фракцию иммуноглобулинов добавлением 2 мл
3,5 М сульфата аммония, Осадок центрифугируют в течение 10 мин при 10000 об/мин и растворяют в 2 мл 0,1 М фосфатного буфера с рН 6,0, К раствору иммуноглобулинов добавляют 49 мг метапериодата натрия при постоянном перемешивании и ведут реакцию в течение 30 мин, после чего избыток окислителя инактивируют добавлением 0,1 мл этиленгликоля, В раствор вносят модифицированную мембрану в виде дисков с диаметром 6 мм (масса мембраны 0,13 r) и добавляют 18 мл 0,2 М боратного буфера с рН 9,5. Реакцию связывания активированных антител с мембраной ведут 20 ч при 4 С при постоянном перемешивании, после чего добавляют в раствор 60 мг боргидрида натрия и проводят реакцию восстановления образующихся Шиффовых оснований 2 ч при комнатной температуре и постоянном перемешивании, Приготовленные ИС промывают дистиллированной водой, затем поочередно фосфатными буферными растворами с рН
5,5 и 9,2. ИС обрабатывают при перемешивании забуференным физиологическим раствором (ЗФР, 0,1 М фосфатный буфер. содержащий 0,15 M Na Cl с рН 7,4), содержащем также 0,5 / Тритона X-100 и 0,2 дезоксихолата натрия. ИС- промывают дистиллированной водой и хранят в растворе ЗФР при 4 С, Емкость ИС по антителам
64,2 мкг/мг сорбента, .
Пример 2 (сравнительный). 1 мл раствора окисленных иммуноглобулинов, полученных как в примере 1, добавляют к 50 мл суспензии АН-агарозы (производство ин-. ститута химии AH 3CCP) и перемешивают 5 ч при 20 С. Полученные ИС обрабатывают, как в примере 1. Емкость ИС по антителам
7,4 мкг/мг сорбента. л и ч а ю шийся тем, что; с целью повышения емкости сорбента по отношению к антигену, мембрану из поликапроамида с размером пор 0,2-0,4 мкм обрабатывают водным раствором смеси триэтилентетрамина, диэтиламино-2,3-эпоксипропана и ди(2,3-эпоксипропилового) эфира в массовом соотношении с мембраной 1:2:2:1 и используют в качестве носителя.
