Способ получения противоракового препарата

 

Использование: микробиология. Сущность изобретения: включает культивирование штамма Bacillus thuringlensls. подготовку культуры и разложение молекул дельта-эндотоксина до полипептидов. Молекулы дельта-эндотоксина до полипептидов разлагают растворением в щелочи, причем растворение осуществляют непосредственное споро-дельта73ндотоксиновой смеси с последующим осаждением полипептидов титрованием концентрированной уксусной кислотой, в качестве растворителя используют едкий натр или едкое кали при соотношении объемов споро-дельта-эндотоксиновой смеси и растворителя соответственно 1:10-1:15, концентрированную уксусную кислоту для осаждения добавляют до достижения рН 4. 2 з.п.ф-лы.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4943837/13 (22) 07.06.91 (46) 23,01.93.Бюл. М 3 (76) Л.К.Каменек (56) Jakojama J. et al,Chemical

pharmacological- Bullet Tokyo,1988, т.36, N

11, р. 4499-4505.

Lamola В. et al. Photochemistry and

photoblology 1985 ч. 41, М 3, р. 361-365, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВОРАКОВОГО ПРЕПАРАТА (57) Использование: микробиология. Сущность изобретения: включает культивирование штамма Bacillus thuringlensls. подготовку культуры и разложение молекул

Изобретение относится к микробиологии, а именно к способу получения препарата на основе штамма Bacillus thurlngiensls, обладающего противораковой активностью.

Известен способ получения препарата на основе штамма Bacillus thuringiensls.

Известный способ включает культивирование штамма, подготовку культуры и разложение молекул дельта-эндотоксина до полипептидов.

Недостатком способа является его сложность и трудоемкость, т,к, разложение молекул дельта-эндотоксина осуществляют после удаления спор из споро-дельта-эндотоксиновой смеси, Разложение молекул дел ьта-эндотоксина до полипептидов осуществляют с помощью щелочи, а осаждение — целлюлозно колоночной хроматографией, Это очень сложный и дорогостоящий процесс. Ы„„1790410 А3 (51)5 А 61 К 35/74, С 12 Р 1/04 дельта-эндотоксина до полипептидов, Молекулы дельта-эндотоксина до полипептидов разлагают растворением в щелочи, причем растворение .осуществляют непосредственнов споро-дельта-эндотоксиновой смеси с последующим осаждением полипептидов титрованием концентрированной уксусной кислотой, в качестве растворителя используют едкий натр или едкое кали при соотношении объемов споро-дельта-зндотоксиновой смеси и растворителя соответственно 1:10-1:15, концентрированную уксусную кислоту для осаждения добавляют до достижения рН 4., 2.з.п.ф-лы.

Известен также способ получения препарата на основе штамма Bacillus

thurlnglensis, обладающего противоопухолевой активностью, наиболее близкий по технической сущности и достигаемому эффекту.

Известный способ включает культивирование штамма Bacillus thurlngiensls, подготовку культуры и разложение молекул дельта-эндотоксина до полипептидов, Недостатком известного способа является его сложность и длительность, т,к. разложение молекул дельта-эндотоксина осуществляют после удаления спор из споро-дельта-эндотоксиновой смеси.

Удаление спор осуществляют флотацией. Однако при этом удаляется около 80% спор, а остальные 20% удаляют путем фазового разделения в двухфазной системе "четыреххлористый углеродсернокислый натрий", что требует дополнительных за1790410 трат и также усложняет способ, увеличивает его длительность, Кроме того, разрушение кристаллической структуры дельта-эндотоксина, при котором происходит разложение молекул до полипептидов, что необходимо для использования препарата, осуществляют облучая дельта-эндотоксин ультрафиолетовыми лучами, что требует специального оборудования и удорожает и усложняет способ.

Цель изобретения — упрощение способа и повышение его экономичности.

Указанная цель достигается тем, что в известном способе получения препарата на основе штамма Вас!Ииэ thurienglensts, обладающего противоопухолевой активностью, включающем культивирование штамма, подготовку культуры и разложение молекул дельта-эндотоксина до полипептидов, согласно изобретению, культивируют штамм Bacillus thuringtensts var. gatterie, молекулы дельта-эндотоксина до полипептидов разлагают растворением в щелочи, причем это растворeíèå осуществляют непосредственно в споро-дельта-эндотоксиновой смеси, с последующим осаждением полипептидов титрованием концентрированной уксусной кислотой.

Целесообразно в качестве растворителя использовать едкий натр или едкое кали при соотношении объемов споро-дельта-эндотоксиновой смеси и растворителя соответственно 1:10 — 1;15, Уксусную кислоту для титрования доба вля ют до достиже н и я р Н 4.

Предлагаемый способ отличается от прототипа тем, что культивируloT штамм . Васйцз xhurlngiensts Var, gaiter!e, молекулы дельта-зндотоксина до полипептидов раз лагают растворением в щелочи, причем рас"творение осуществляют непосредственно в споро-дельта-эндотоксиновой смеси с последующим осаждением полипептидов титрованием концентрированной уксусной кислотой. Способ отличается также тем, что в качестве растворителя используют едкий натр или едкое кали при соотношении обьемов споро-дельта-эндотоксиновой смеси и растворителя соответственно 1:10 — 1:15, а концентрированную уксусную кислоту для осаждения титрованием добавляют до достижения рН 4.

Сущность предлагаемого способа наиболее полно раскрыта в примерах его конкретного осуществления, Пример 1. Культивирование Вас Инэ

thurtngtensts Var. gallerle осуществляли на твердой питательной среде в термостате при 28-30"С в течение 10 дней, После чего культуру промыли дистиллированной во5

55 дой, затем физиологическим раствором и снова дистиллированной водой. При этом споро-дельта-эндотоксиновая смесь освобождается от растворимых токсинов. В смеси остаются в основном споры и кристаллы дельта-зндотоксина, вегетативные клетки.

Для разложения молекул, образующих кристаллы дельта-эндотоксина, до полипептидов, являющихся по сути действующим началом препарата, непосредственно в споро-дельта-эндотоксиновую смесь добавили растворитель — едкий натр, в соотношении объемов 1:10, т,е. на t г споро-дельта-эндотоксиновой смеси — 10 мл едкого натра, и выдержали до растворения кристаллов дельта-эндотоксина, постоянно перемешивая, При этом частично растворяется и белок спор. Причем он разлагается также до полипептидов, сходных с полипептидами, на которые разлагаются молекулы дельтаэндотоксина, Осадок, включающий остатки спор и вегетативных клеток, удалили центрифугированием в течение 20 мин, при скорости вращения ротора 5000 об/мин, Возможно удаление осадка и любым другим способом, например фильтрацией. Для повышения чистоты действующего начала (полипептидов) их осадили титрованием концентрированной уксусной кислотой до рН 4.

Таким образом препарат, обладающий противоопухолевой активностью, на основе штамма Bacillus thurtengiensts Var, gallerle получен без применения специального оборудования, простым переосаждением дельта-эндотоксина, растворенного щелочью непосредственно в споро-дельта-эндотоксиновой смеси, что значительно ускоряет процесс, делает его более простым и экономичным.

Пример 2, Технология аналогична примеру 1, но в качестве растворителя испольэовали едкое кали при соотношении объемов 1:10 (т.е, на 1 г споро-дельта-эндотоксинной смеси — 10 мл едкого кали), Пример 3. Технология аналогична примеру 1, но в качестве растворителя брали едкий натр при соотношении объемов

1, 15.

Пример 4. Технология аналогична примеру 1, но в качестве растворителя использовали едкое кали в количестве 1;15.

Противоопухолевую активность препарата на осНоае штамма Bacillus

thurIngienslst Var. gallerie, полученного предлагаемым способом проверяли на культурах раковых клеток HeLa u leP. Bce операции способа для испытания именно на клетках проводили в стерильных условиях, 1790410 используя стерильные растворы и вещества, Перед использованием, чтобы нейтрализовать возможное цитотоксическое влияние щелочи на клетки, титровали одномолярным раствором соляной кислоты до рН 8. Далее раствор препарата разбавили стерильным буфером следующего соста. ва: 0,8% МаС! + 0.02% KCl + 0.115%

Ма2НРО4 + 0.02% KH2PO4 + НгΠ— остальное, имеющим рН 7,5 до необходимой концентрации (0,025-0,075 мг/мл). В опыте разбавили до концентрации 0,05 мг/мл, В этом же буфере дважды промыли раковые клетки Неба и НеР, Затем указанные раковые клетки инкубировали при 28 С с приготовленнымм белково-дельта-эндотоксиновым раствором. Через 1, 5, 10, 15 и 30 мин, а затем через

1, 2, 3, 6, 9, 12, 24 и 48 часов раковые клетки осторожно промывали и тотчас фиксировали, Обработанные клетки исследовали методами световой. электронной сканирующей и просвечивающей микроскопии, Для световой микроскопии обработанные препаратом раковые клетки промывали

4-6 раз фосфатным буфером рН 7,4, фиксировали в фиксаторе Кар Iya и окрашивали кристаллическим фиолетовым, Просматривали под световыгм микроскопом марки Зргавал (ГДР). Хорошо просматривалось изменение клеток во времени под действием препарата вплоть до их разрушения, При помощи сканирующего микроскопа при увеличении в 5000 раз получены фотографии, показывающие изменение раковых клеток HeLa во времени под действием препарата, полученного предлагаемым способом непосредственно из споро-дельта-эндотоксиновой смеси.

Ясно видна противораковая активность препарата на основе Bacillus Ihurlnglensls

Чаг. galierle, полученного более простым способом непосредственно из споро-дельта-эндотоксиновой смеси, Формула изобретения

1. Способ получения противоракового препарата, включающий культивирование штамма Bacillus

thurlngtensfs с последующим разложением дельта-зндотоксина до полипептидов, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и поБелок спор, при добавлении щелочи частично разлагается на полипептиды, сходные с полипептидами молекул дельта-эндотоксина и не снижает противораковой активности

5 препарата, что установлено экспериментально, Для контроля раковые клетки культур

HeLa и НеР обрабатывали по указанной выше технологии, но раствор препарата заме10 нили раствором щелочи равного объема и концентрации. Изменений в раковых клетках в указанные выше периоды времени не наблюдалось.

При осуществлении способа получения

15 препарата использовать едкий натр или едкое кали нецелесообразно в соотношении меньшем чем 1:10, т,к. в этом случае получится перенасыщенный раствор, в котором не все молекулы дельта-эндотоксина могут

20 разложиться до полипептидов, Соотношение споро-дельта-эндотоксиновой смеси и едкого кали или едкого натра большее чем 1:15 нецелесообразно, т.к, приведет к непроизводительному расходу

25 щелочи. концентрированной уксусной кислоты для титрования, Предлагаемый способ позволяет получить препарат на основе штамма Bacillus

thurfngiensfs Чаг. galierie, обладающий про30 тивоопухолевой активностью, обычным растворением до полипептидов молекул дельта-эндотоксина, составляю.цих его кристаллы, и простым переосаждением действующего начала, т,е, полипептидов

35 титрованием концентрированной уксусной кислотой, что значительно удешевляет и упрощает способ (за счет сокращения числа операций, llo сравнению с прототипом, уменьшения их сложности и трудоемкости, 40 отсутствия специального оборудования), Белок спор, при добавлении щелочи частично разлагается на полипептиды, сходные с полипептидами молекул дельта-эндотоксина и не снижает противо45 раковой активности препарата, что установлено экспсримеIIòàëüíо. вышения его экономичности, из штаммов используют штамм BBCHius йог1пфепэ!э

Чаг. gallerle, разложе I«e дельта-эндотоксина осуществляют щелочью в споро-дельтаэндотоксиновой смеси, после чего полипептиды осаждают концентрированной уксусной кислотой.

1790410

Составитель И.Тареева

Техред М.Моргентал Корректор Н.Ревская

Редактор Т.Иванова

Заказ 357 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что из щелочи используют едкий натр или едкое кали при их соотношении к споро-дельта-эндотоксиновой смеси 10-15:1, 3.Способпопп,1и2,отличающийся тем,что укаэанную кислоту добавляют до достижения рН 4.