Способ культивирования штамма bacillus аuтrасis

 

Использование: микробиологическая промышленность, производство вакцин. Сущность изобретения: штамм бактерий Bac.antracls 55-ВНИИВВиМ выращивают на водной питательной среде, содержащей {на 1 л) : кислотный гидролизат говяжьего мяса 60-80 мл; аммоний сернокислый 1,5- 2,5 г; калий фосфорнокислый двузамещенный 3,0-12,0 г; натрий лимоннокислый 0,8-1,2 г; магний сернокислый 0,15-0,25 г; полипропиленгликоль 0,08-0,12 мл, в течение 46-50 ч при аэрации, при этом первые 27-29 ч скорость растворения кислорода в среде поддерживают 3,5 ±0,2 ммоль на 1 л среды в 1 ч.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ., Я ." ;. ., К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ." д„, 1 (21) 3199979/13 (22) 23.05.88 (46) 30.01.93. Бюл. М 4 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии (72) И.А,Бакулов, В.А.Гаврилов, Ю.В.Числов, M,È.Êàëàáåêîâ, Н.Б,Матвеева, В.B,Ñåливерстов и А.В.Никитин (56) Авторское свидетельство СССР

N 980431, кл, С 12 N 3/00, 1981, Авторское свидетельство СССР

N256571,,кл. А 61 К 39/10, 1983. (54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ШТАММА BACIL1US ANTHRAC IS

Изобретение относится к микробиологии, в частности к биотехнологии вакцин ных препаратов, и может быть использовано при изготовлении вакцин.

В настоящее время в СССР применяют две живые споровые вакцины против сибирской язвы: вакцину из штамма 55-ВНИИВВиМ и вакцину иэ штамма СТИ-1.

Известен способ культивирования возбудителя сибирской язвы в жидкой среде с питательной основной из дрожжевого экстракта, Он позволяет за 1,5-2 су1ок получйть в реакторе споровый материал для изготовления вакцины из штамма СТИ-1.

Однако его невозможно применить при производстве биопрепарата из штамма 55ВНИИВВиМ, т.к. указанный штамм обладает биологическими особенностями и не образует споры в жидкой дрожжевой среде, Это является одной из основных характеристик невозможности получения

„„5U „„1791449 А1 (si)s С 12 Й 3/00, А 61 К 39/10 (57) Использование: микробиологическая промышленность, производство вакцин.

Сущность изобретения: штамм бактерий

Вас,antгacls 55-ВНИИВВиМ выращивают на водной питательной среде, содержащей (на 1 л): кислотный гидролизат говяжьего мяса 60 — 80 мл; аммоний сернокислый 1,5—

2,5 г; калий фосфорнокислый двузамещенный 3,0 — 12,0 r; натрий лимоннокислый

0,8-1,2 г; магний сернокислый 0 15 — 0,25 г; полипропиленгликоль 0,08-0,12 мл, в течение 46-50 ч при аэрации, при этом первые

27-29 ч скорость растворения кислорода в среде поддерживают 3,5 +0,-2 ммоль на 1 л среды в 1 ч. вакцины из штамма 55-ВНИИВВиМ в реакторе по указанному способу, Вакцину из штамма 55-ВНИИВВиМ изготавливают в 3-литровых бутылях на картофельно-пептонном агаре. Для получения спорового материала на одну серию вакцины необходимо проделать следующие операции: подготовить 200-400 штук

3-литровых бутылей {вымыть их, залить расплавленным агаром, простерилиэовать, обкатать, выдержать на стерильность), засеять эти бутыли матричной расплодкой вакцинного штамма, поставить на инкубирование, иэ 10-20 бутылей приготовить мазки для контроля спорообразования, смыть с партии из 200 — 400 бутылей споровой материал и профильтровать его. На получение спорового материала необходимо 6-7 суток, не считая времени на подготовку посуды и питательных сред. Все вышеуказанные операции выполняются вручную. Кроме того. в

1791449 процессе работы часть стеклопосуды бьется, а биопредприятия испытывают трудности в обеспечении специальной стеклопосудой.

Целью изобретения является сокращение времени на получение спорового материала.

Это достигается тем, что в известном способе изготовления вакцины против сибирской язвы, включающем выращивание микроорганизмов при температуре 3637 на питательной среде, культивирование осуществляют в реакторе с использованием разработанной нами и апробированной жидкости споруля ционно. ростовой среды следующего состава: кислотный гидролизат говяжьего мяса 60 — 80 мл аммоний сернокислый (ГОСТ 3769-78) t,5 — 2,5 r калий фосфорнокислый двузамещенный (ГОСТ 2493-75) 3,0 — 12,0 г натрий лимоннокислый (ТУ 6-09-2248-77): 0,8-1,2 г магний сернокислый. (ГОСТ 4523-77) 0,15 — 0,25 r полипропиленгликоль (ТУ 6-09-10-1244-77) 0,08 — 0,12 мл дистиллированная вода (ГОСТ 6709-72) до 1000 мл рН 7,2 + 0,2.

Другое отличие заключается в иных ус-ловиях культивирования; выращивание проводят s течение 46-50 часов. В первые

27 — 29 часов культуру штамма аэрируют воздухом путем барботирования без перемешивания мешалкой, уровень аэрации составляет 3,5 0,2 ммоль растворенного кислорода на 1 л среды в 1 час, затем аэрирование прекращают и культуру выдерживают 19-21 час до завершения спорообразования.

Накопление биомассы завершается через 12 часов после посева. Спустя 27-29 часов 95-100,4 выросших клеток образуют споры, которые находятся на разных стадиях созревания. Б последующие 19-21 час инкубирования происходят созревание спор и полный лизис вегетативного материала. На завершающем этапе выращивания культура состоит из зрелых светопреломляющих спор, количество которых в 1 мл составляет 100-300 млн.

Способ получения спор разработан на

5-литровом ферментере "Бромма" (фирма

ЛКБ, Швеция) и воспроизведен в 63-литровом реакторе. У азанный способ может быть осуществлен в сосудах для культивирования различного обьема, но для этого необходимо знать массообменные по кислороду характеристики используемых сосудов. Массообмен по кислороду можно определить по сульфитному методу, разра5 ботанному Купером и усовершенствованному во ВНИИВВиМ Бакуловым И.А, с соавторами (Тез.докл,научн.-теоретич.конф. ВНИИВВиМ 14 — 16 ноября 1983 г., с,178 — 180, r.Ïîêðoâ), 10 Пример 1. Определение массообмена по кислороду в 63-литровом реакторе, выращивание культуры штамма 55-ВНИИВВиМ и получение спор.

Определение массообменна.

15 В реактор заливают 39 литров дистиллированной воды, в ней растворяют порошок сульфита натрия в количестве 240,0 г. Отдельно в 1 литре дистиллированной воды растворяют кристаллы сернокислой меди в

20 количестве 10,0 г. Раствор сернокислой меди заливают в реактор и получают 40 литров смеси растворов с содержанием сульфита натрия 6,0 г/л и сернокислой меди 0,25 г/л, Из реактора с помощью шприца обье25 мом 5 мл и присоединенных к нему 2 пипеток с узким канальцем набирают 5 мл раствора (1-я проба до аэрации), которые переносят в колбу с 70 мл свежеприготовленного 0,01 N раствора йода. В шприце с

30 пробой не должно быть пузырьков воздуха. з

Подают сжатый воздух в количестве 0,5 дм /л воды/мин или 20 дм /40 л воды/мин, з

Фиксируют время аэрации, Оттитровыввают 1-ю пробу (до аэрации)

35 в растворе йода добавлением 0,01 N раствора гипосульфита натрия до перехода жидкости из коричневого в желтый цвет, Затем добавляют 3 — 4 капли 0,5 -ного раствора крахмала, Цвет жидкости становится темно40 синим. Продолжают добавлять раствор гипосульфита натрия до полного обесцвечивания жидкости, Например, на титрование пробы потребовалось 6,2 мл раствора гипосульфита на45 трия, Шприц с пипетками и колбу для титрования промываютдистиллированной водой, По истечении времени аэрации (30 минут) воздух отключают, отбирают 2-ю пробу

50 (аэрация 0,5 дм /д/мин) и оттитровывают ее з так же, как и 1-е пробу.

Например, на титрование пробы потребовалось 8,6 мл раствора гипосульфита натрия.

55 По формуле определяют уровень аэрации;

Т1 — То х 2,5 ммоль х 1 час, где:

Врх5мл

1791449 х 1 час-2,4 ммоль Ор/л/час, 1час=

=4,4 ммоль Oz/л/час

1 час=

= 6,6 ммоль Oz/л/час где To — количество гипосульфита натрия, израсходованного на титрование пробы до аэрации;

Т вЂ” -"- -"- после аэрации;

Вр — время аэрации (час);

5 мл — объем пробы;

2,5 ммоль — один литр 0,01 N раствора гипосульфита связывает 2,5 ммоль 02.

Например т,е. при подаче 0,5 дм воздуха/л/мин в реакторе создается уровень аэрации, равный 2,4 ммоль 02/л/час.

Сразу после отбора 2-й пробы вновь подают сжатый воздух для барботирования в количестве 1 дм /л/мин. По истечении

30-минутного аэрирования воздух отключают отбирают 3-ю пробу (аэрирование 1 дм /л/мин), оттитровывают ее, определяют уровень аэрации по формуле, причем в этот же раз То будет служить Т> из предыдущего расчета, Например, на титрование 3-й пробы было израсходовано 13 мл раствора гипосульфита натрия. Определяют уровень аэрации:

Сразу после отбора 3-й пробы вновь подают сжатый воздух для барботирования в количестве 1,5 дм /л/мин.-После 30-минутного аэрирования воздух отключают, отбирают 4-ю пробу (аэрация 1,5 дм /л/мин}, оттитровывают ее, определяют по формуле уровень аэрации, причем То будет Т> из предыдущего расчета.

Например, на титрование 4-й пробы было израсходовано 19,6 мл раствора гипосульфита натрия. Определяют уровень аэрации:

После каждого отбора пробы и ее титрования шприц, пипетки и колбу тщательно промывают дистиллированной водой.

Таким образом, получают числовые значения 3-х измерений, которые используют для построения графика.

Полученный график позволяет определить скорость растворения кислорода (уро5

55 вень аэрации) при подаче известного количества воздуха для барботирования среды и, наоборот, количество воздуха, которое потребуется для создания необходимого уровня аэрации, Выращивание культуры штамма 55ВНИИВВиМ и получение спор.

В реакторе объемом 63 литра приготавливают 40 литров споруляционно-ростовой среды по прописи (см.выше). Реактивы растворяют в той же последовательности, в которой они написаны. Устанавливают рН среды 7,2+0,2 добавлением 20 g,-ного раствора гидроокиси калия. Среду стерилизуют при 121 С в течение 45 минут и охлаждают до 30 — 35 С, В реактор с питательной средой заливают через пробоотборник посевной материал — споровую суспензию штамма

55-ВНИИВВиМ в количестве 2 — 10х10 жизнеспособных спор, что составляет 0,52,5х10 спор на 1 мл среды. Весь посевной

6 материал должен содержаться в объеме

0,5 — 2,0 л.

Устанавливают температуру инкубирования 37 С, в питательную. среду подают сжатый воздух через барботер в объеме 0.8 дм /л/ среды, что по графику массообмена з соответствует уровню аэрации 3,5 ммоль 0>/л/час. Культивируют 27 часов, Следующие 21 час культуру инкубируют при той же температуре, но без аэрирования.

Через 27 и 48 часов культивирования иэ реактора отбирают пробы культуры, исследуют их на чистоту роста и спорообразование.

Культура вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ, выращенная в этих условиях, состоит из зрелых жизнеспособных спор, количество которых в 1 мл составляет 100300 млн.

Использование предлагаемого способа получения споровой формы вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ возбудителя сибирской язвы обеспечивает следующие преимущества: позволяет получать в реакторах большие объемы cnopoaoro материала для изготовления вакцины против сибирской язвы: значительно снижает затраты труда на изготовление вакцины против сибирской язвы, ликвидирует тяжелый ручной труд, позволяет механизировать производственный процесс; сокращает. время на получение спорового материала в 3-4 раза.

Формула изобретения

Способ культивирования штамма

ВасИЬэ anthracis 55-ВНИИВВиМ на пита1791449

Составитель И. Вишняков

Техред М.Моргентал Корректор С.Патрушева

Редактор С. Кулакова

Заказ 134 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 тельной среде, содержащей органический источник азота до максимального образования спор, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени на получении спорового материала, в среду 5 дополнительно вводят калий фосфорнокислый двузамещенный, натрий лимоннокислый, магний сернокислый, полипропиленгликоль и воду, а в качестве источника азота используют кислот- 10 ный гидролизат говяжьего мяса и аммоний сернокислый, при этом указанные компоненты вводят в следующем соотношении: кислотный гидролизат говяжьего мяса -60-80 мл; аммоний сернокислый — 1,5-2,5 г; калий фосфорнокислый двузамещенный — 3,0-12,0 г; натрий лимоннокислый — 0,8-1,2 r; магний сернокислый — 0,15-0,25 г; полипропиленгликоль — 0.08-0,12 мл; вода— до 1000 мл,при этом культивирование осуществляют в течение 46 — 50 ч, из них первые 27-29 ч при аэрации, поддерживая скорость растворения кислорода в среде 3,510.2 ммоль на 1 л среды s 1 ч.

Способ культивирования штамма bacillus аuтrасis Способ культивирования штамма bacillus аuтrасis Способ культивирования штамма bacillus аuтrасis Способ культивирования штамма bacillus аuтrасis 

 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу пот лучения ферментов с помощью микромицетов - грибов рода Aspergillus

Изобретение относится к микробиологии , а именно к способам окрашивания спор бактерий

Изобретение относится к микробиологической промьшшенности и может быть использовано для количественного определения жизнеспособных спор микроорганизмов в различных препаратах , в частности энтомопатогенных

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения конъюгированного термостабильного энтеротоксина кишечной палочки

Изобретение относится к ветеринарной биотехнологии и может быть использовано для получения бруцеллезной вакцины из штамма 82

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к акушерству, и может быть использовано для прогнозирования послеродовых заболеваний у свиней

Изобретение относится к биотехнологии и мс^кет быть использовано при приготовлении препаратов для диагностики бруцеллеза

Изобретение относится к области медицины, а именно, к области стимуляции активной нейроэндокринной клеточной системы и продукции пептидных гормонов
Наверх