Устройство для замораживания биологических объектов

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 F 25 0 3/10

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССP (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

k (21) 4943030/13 (22) 05.06.91 (46) 07.02.93. Бюл. М 5 (71) Кооператив "Агроинформатика" по выполнению научно-исследовательских, проектных и внедренческих работ (72) С.Т.Олейник, Г.С.Лобынцева, А.Н.Новиков, И.А.Вояткова, Е.M.Êëèìoâà, В.M.Êóøíàðåâ и

Г.В,Нестеренко (73) Ю,С.Клюкин (56) Заявка ФРГ

hh 3225672, кл. F 25 D 3/10, 1982.

Авторское свидетельство СССР

N. 1143949, кл. F 25 О 3/10, 1985. (54) УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЗАМОРАЖИВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ (57) Использование: изобретение относитсяк холодильной технике и может быть использовано в криобиологии, криомедицине для консервирования биологических объектов

Изобретение относится к холодильной . технике, используемой, в частности, в криобиологий для консервирования биологических объектов при низких температурах.

Известно устройство для криоконсервирования биологических объектов в контейнерах, помещенных в холодильную камеру с хладагентом, у которых, для инициирования кристаллов льда в водной компоненте внеклеточной среды, прикасаются сильно охлажденными предметами к стенкам контейнера.

Недостатком известного устройства является нетехнологичность процесса при массовом замораживании .биообъектов, а также нарушение режима замораживания при открывании крышки холодильной каме,, Ы2,, 1794236 А3 при низких температурах. Сущность: устройство для замораживания биологических объектов содержит корпус, установленный в нем с возможностью расположения на поверхности жидкого хладагента держатель, включающий утолщенный диск с гнездами для контейнеров. снабженный крышкой;установленной с образованием между ним и диском полости. Вдоль вертикальной оси диска расположена трубка с укрепленными на ее концах радиаторами и регулировочными клапаном. У нижнего основания диска размещена камера для образования паров хладагента. Вокруг трубы образован центральный вертикальный канал, связанный посредством капиллярных трубок с зонами размещения каждого контейнера. Верхний радиатор расположен в полости держателя над контейнерами, а нижний — в камере для образования паров хладагента. 1 ил, и ры для инициирования кристаллов льда внутри контейнера в водной компоненте со- О держимого, В результате происходит зара- 4 ь жение микрофлорой зоны замораживания, Я что s совокупностй с нарушением режима (,Д замораживания приводит к снижению со- ( хранности биологических объектов.

Наиболее близким к заявляемому по у технической сущности является устройство для замораживания биологических объектов, содержащее холодильную камеру с теплоизолированным корпусом и крышкой. В холодильной камере на поверхности жидкого хладагента расположен замораживатель в виде утолщенного диска с гнездами йз металла, в дним которых укреплены сменные стержни иэ металла с воэможностью их

1194236

55 контакта с хладагентом. В гнезде вставлены контейнеры для биологических объектов.

Замораживатель выполнен из легкого материала с низким коэффициентом теплопроводности.

Благодаря хорошей теплопроводности металлических стержней и гнезд происходит замораживание биообъектов в контейнерах почти с постоянной скоростью, Однако в объеме эоны замораживания возникает достаточно большой модуль градиента температуры в газовой среде хладагента (т.к. верхняя часть контейнеров находится в парах хладагента, а часть контейнера через теплопроводящие стержни контактирует с жидким хладагентом), что приводит к снижению сохранности биологических обьектов, В известном, устройстве отсутствует возможность инициирования льдообразования во внеклеточной среде, что также снижает сохранность биологических объектов. .Регулировка скорости охлаждения биологического материала в известном устройстве осуществляется за счет смены стержней различного диаметра, т.е. допускается только дискретная регулировка скорости охлаждения. а не плавная.

Целью настоящего изобретения является повышение сохранности биологических объектов в процессе замораживания, путем снижения модуля градиента температуры в зоне замораживания и обеспечения плавной регулировки скорости охлаждения обьектов с инициированием начала льдообразования во внеклеточной среде для снижения начального переохлаждения.

Поставленная цель достигается тем, что в устройстве для замораживания биологических объектов, содержащем выполненные иэ материала с низким коэффициентом теп. лопроводности корпус, контейнеры для биообъекта и установленный в корпусе с возможностью расположения на поверхности жидкого хладагента держатель контейнеров, включающий диск с гнездами для контейнеров, согласно изобретению держатель снабжен крышкой, установленной на диске с образованием между ними полости, расположенной вдоль вертикальной оси диска, трубой с укрепленными на ее концах радиаторами и регулировочным клапаном, установленным s отверстии верхнего конца трубы. При этом диск выполнен утолщенным и имеет вокруг трубы центральный вертикальный канал и расположенную у нижнего основания диска камеру для образования паров хладагента, сообщенную с каналом в диске и с рабочим объемом корпуса ниже предполагаемого уровня хлада5

50 гента в нем, Канал диска связан посредством капиллярных трубок с зонами размещения каждого контейнера для подвода газообразного хладагента к их стенкам.

Верхний радиатор трубы расположен в полости держателя над контейнерами, а нижний — в камере для образования паров хладагента.

Благодаря выполнению держателя контейнеров в виде диска с крышкой, образована полость для замораживания биообъекта в контейнерах с регулируемой клапаном подачей паров хладагента по трубе центрального канала и перемешиванием в этой полости паров хладагента верхним радиатором, B результате значительно снижается модуль градиента температуры во всей полости и, соответственно, во всем объеме каждого из контейнеров с биологическим материалом, Снижение модуля градиента температуры в зоне нахождения каждого из контейнеров с биообъектами повышает их сохранность при криоконсервировании по сравнению с прототипом.

Выполнение капилляров от центрального канала к каждому контейнеру позволяет подвести пары хладагента непосредственно к стенке контейнера и инициировать льдообразование внутри контейнера во внеклеточной среде, Образовавшиеся кристаллы льда являются затравочными для кристаллизации всей воды в контейнере. При этом во всем содержимом контейнера практически исключается переохлаждение, что также способствует повышению сохранности биологических объектов при криоконсервировании, что не достигалось у прототипа.

Нижний радиатор на трубе в расширенной части центрального канала у основания диска держателя контейнеров способствует испарению жидкого хладагента за счет переноса тепла из зоны замораживания от контейнеров и верхнего радиатора.

Количество подаваемых паров хладагента в полость держателя контейнеров плавно регулируется клапаном в верхней части трубы.

При поиске по патентной и научно-технической литературе не выявлены объекты с признаками заявляемого технического решения, на основании чего можно сделать вывод, что оно соответствует критерию "существенные отличия".

На чертеже показан вертикальный раз. рез общего вида устройства для замораживания биологических объектов.

Устройство содержит корпус 1 с крышкой 2, заполненный жидким хладагентом 3. например, азотом, Внутри корпуса 1 на поверхности хладагента 3 расположен держатель в виде диска 4 с утолщенным телом 5 и крышкой 6, образующих полость, расположенную вдоль вертикальной оси диска 4.

B теле 5 диска 4 выполнены гнезда 7, с установленными в них контейнерами 8 для биологических объектов, В теле 5 диска 4 образован по крайне мере один вертикальный центральный канал 9 с расширенной частью у нижнего основания диска 4. образующей камеру 10.

От канала 9 отходят капилляры 11 к зоне размещения каждого контейнера 8.

Внутри канала 9 расположена труба 12, на нижнем и верхнем концах которой установлены радиаторы 13 и 14, соответственно, Нижний радиатор 13 находится в камере

10. Верхний радиатор 14 расположен.в полости держателя над контейнерами 8.

В верхней части трубы 12 установлен регулировочный клапан 15.

Участок трубы 12 между телом 5 диска 4 и радиатором 14 изолирован теплоизоляцией 16.

К нижнему основанию диска 4 с наружной стороны прикреплен балласт 17 с отверстием 18, соосным каналу 9, Корпус 1 с крышкой 2, диск 4 с крышкой

6 и контейнеры 8 выполнены из материала с низким коэффициентом теплопроводности. Радиаторы 13 и 14, а также труба 12 выполнены из высокотеплопроводного материала, например, из алюминия, меди, Пример 1. Использовали цилиндрический корпус 1 с внутренним диаметром

190 мм и высотой 400 мм, в который залили три литра жидкого хладагента 3 (азота).

Цилиндрический диск 4 из пенопласта имел внешний диаметр 170 мм и высоту 150 мм, Полость между телом 5 диска 4 и крышкой 6, образующая рабочую зону охлаждения, имела размеры: диаметр 120 мм и высоту 80 мм.

Пластиковые контейнеры 8 имели наружный диаметр 15 мм с толщиной стенки

1,5 мм и высоту 80 мм.

Для контроля за скоростью охлаждения и начальным переохлаждением внеклеточной среды содержимого кон1ейнеров 8 использовали дифференциальную медь— копелевую термопару с соответствующей регистрирующей аппаратурой (на чертеже не показаны), Измерительный спай термопары располагали в центре объема одного иэ контейнеров 8, Замораживание биологических объектов в контейнерах 8 проводили со скоростью 1 С/мин до -40 С с дальнейшим погружением в жидкий азот.

V!i«i роль зэ температурой в рабочей зоне в полости диска 4 производили в шести точках также термопарами с соответствующей регистрирующей аппаратурой (на чер5 теже не показаны). Каждая из шести точек располагалась на расстоянии 10 мм от поверхности стенки контейнера 8. По высоте измерительные точки располагались на 1/3 и 3/4 высоты контейнеров 8. В плане точки

10 чередовались через 60 угловых градусов.

В контейнеры 8 заливали по 8 мл лейкоконцентрата, полученного из донорской крови человека, разбавленного в соотношении 1;1 криопоотектором — 107,-ным раство15 ром диметилсульфоксида, Контейнеры 8, после заполнения их биологическим объектом, герметично закрывали.

Семь таких контейнеров 8 с положительной начальной температурой при сня20 тых крышке 6 и радиаторе 14 устанавливали в гнезда 7 тела 5 диска 4. Затем закрепляли радиатор 14, регулировочным клапаном 15 устанавливали скорость охлаждения

1 С/мин. После этого закрывали крышку 6 и

25 диск 4 погружали в корпус 1 и закрывали его крышку 2.

Тепло от контейнеров 8, газовой среды в рабочей зоне и радиаторе 14 по трубе 12 и каналу 9 передавалось в камеру 10 к радиа-.

30 тору 13. Благодаря этому теплу жидкий азот в камере 10 закипал, и его пары поступали по трубе 12 через регул ировочный клапан 15 в рабочую зону диска 4, Радиатор 14 способствовал выравниванию температуры во

35 всем объеме полости. С заданной скоростью температура в контейнерах 8 снижалась до криоскопической, Одновременно пары азота из камеры 10 по каналу 9 и капилляры 11 поднимались непосредственно к стенкам

40 контейнеров 8. Локальные воздействия паров азота на стенки контейнеров 8 вызывает внутри них практически в точечном объеме понижение температуры относительно всего объема содержимого контейнеров 8. В

45 результате достигалось локальное охлаждение раствора, достаточное для .образования кристаллов льда из водной компоненты раствора, которые являлись затравочными для кристаллизации водной

50 компоненты всей основной массы внеклеточной среды биологического объекта при переходе воды в лед.

При этом во всем содержимом контейнеров 8 практически исключалось переох55 лаждение (см. результаты измерений), В процессе замораживания при достижении в точке Q 1 контрольных температур, одновременно измеряли температуру в точках N. 2; М 3, М 4, М 5 и М 6.

1794236

Результаты измерений температур в шести точках в период замораживания приведен ы в табл,1 в виде усредненных значений по трем (и = 3) испытаниям, Замеры проводились с интервалом времени (10 + 0,05) мин.

В табл.2 представлены данные о начальном переохлаждении во внеклеточной среде внутри одного из контейнеров 8.

Семь аналогичных контейнеров 8 с тем же биологическим обьектом замораживали в устройстве — прототипе со скоростью охлаждения 1 С/мин до — 40 С с последующим погружением в жидкий азот.

В устройстве — прототипе скорость охлаждения клеточной суспензии и начальное переохлаждение внеклеточной среды контролировали аналогичной термопарой, измерительный спай которой располагали внутри одного из контейнеров.

Так же, как в заявляемом устройстве, контролировали температуру в шести точках рабочей эоны замораживателя.

Результаты измерений приведены в табл,1 и 2, Размораживание клеточной суспенэии лейкоконцентрата в обоих случаях проводили до 0 С на водяной бане с температурой

37 С.

В нативной и размороженной суспензии клеток подсчить|вали общее количество клеток и определяли их жизнеспособность после окраски витальными красителями, В табл.3 представлены полученные результаты. Недостоверность Р количественной оценки жизнеспособности клеток оценивается по условиям эксперимента величиной Р:- 0,.05.

Из анализа результатов измерений, представленных в табл.1, следует, что при охлаждении биологического обьекта в устройстве — прототипе модуль градиента температуры в рабочей зоне варьируется в широких пределах — от 0,4 С до 26,4 С, что приводит к неравномерным условиям охлаждения каждого из контейнеров {верхней их части).

Охлаждение биологического объекта в заявляемом устройстве позволяет снизить варьирование модуля градиента температуры в рабочей зоне в полости диска 4 до (0,5-3,2) С. что примерно в 10 раз меньше, чем у прототипа.

Из табл.2 видно, что в устройстве — про .тотипе при замораживании биологического обьекта имеет место значительное переохлаждение (около 6,3ОС) содержимого кон5 тейнера, а в предлагаемом устройстве переохлаждение практически не наблюдается, т.е, близко к 0 С.

Неравномерность охлаждения каждого из контейнеров, а также большое переох10 лаждение водной компоненты внеклеточной среды при фазовом переходе вода — лед снижает жизнеспособность биологического объекта при замораживании в устройстве— прототипе. Этих недостатков лишено заяв15 ляемое.устройство, что подтверждается табл,3. Жизнеспособность клеток деконсервированной лейкоцитарной массы, замороженной в заявляемом устройстве, на 14 / выше по сравнению с прототипом, 20 Пример 2. В заявляемом устройстве и устройстве-прототипе замораживали гемопоэтические клетки, полученные из эмбриональной печени свиней и разбавленные в соотношении 1:1 защитным раствором, со25 держащим раствор Хэнкса — 90 и диметсул ьфоксид — 10 ь, Подготовленную суспензию разливали по 8 мл в пластиковые контейнеры 8, герметизировали их и помещали в замора30 >киватель заявляемого устройства и устройства-прототипа.

В дальнейшем замора>кивание и отогрев биологических объектов проводили аналогично примеру 1, но уже без контроля

35 температур, т.к. использовали ранее оттарированные устройства, Жизнеспособность нативных и размороженных клеток суспензии определяли после окраски витальным красителем (Me40 тиленовый синий).

Количество клеток в суспенэии подсчитывали в камере Горяева. Недостоверность оценки параметров объектов оценивается, как и ранее, величиной P < 0,05, 45 Результаты представлены в табл.4.

Из данных, приведенных в табл.4, видно, что сохранность клеток, замороженных в устройстве-прототипе (около 14; ), Таким образом, заявляемое устройство

50 за каждый цикл замораживания (1,5-2 ч) позволяет сохранить на 14 больше жизнеспособных клеток биологических объектов, по сравнению с устройством прототипом.

1794236

Таблица 1

С е няя темпе ат а в изме яемых точках, С п=3

Исследуемый объект

00 й025

-10+ 0,25

-20+ 0,25

-30= - 0,25

-40+ 0,25

-3.7 + 3,3

-13,4 +42

-25,1 + 4,8

-38,1 + 6,1

-52,4 + 7,0

+5,7 +3,7

-7,6 + 4,4

-17,3 +5,6

228 й62

-31.3 + 7,3

62 +é39

-17,5 + 5,1

-25 5,9

-40,3 + 6,8

-58,9 + 7.5

+1,7 +3,5

-8,1 4,3

-18,2 «5,1

-27,8 + +6.0

-33,2 +6.2

-42,+ 3,5

-13,7 +4,7

-24,6 + 5.2

-37,5 + 5,7

-54,6 "- 6,0

Устройство по прототипу

+0,2 й0,25

9 6+ 0.6

-19,7+ 1,2

-29.6 ч- 1,9

-39.7 + 2,3

Заявляемое устройство

0,0» 0,25

-10+ 0,25

-20+ 0,25

-30+ 0.25

-40+ 0.25

-0.1 + 0,25

-10,0 + 0,6

-20,6 + 1,2

-30,9 + 1,9

-40,9 + 2,3

-0,25 = - 0,25

-10.0 ++ 0,6

-20,1 + 1,2

-29,3 + 1,9

-40,4 +2,3

-0.75 + 0,25

105 й0,6

-20.5 + 1.2

-30,7 + 1,9

-40,6 + 2,3

-0,1 +0,25

-10,5 + 0,6

-20,4 + 1,2

-30,7 + 1,9

-40,4 + 2,3

Таблица 2

Таблица 3

Иссле емый объект

Жизнеспособность, Количество клеток, шт.

8129 +-.144,6

7224 + 274,2

7940 108,5

95,4 2,0

73,8+ 4,1

85,2 и 1,7

Формула изобретения

Устройство для замораживания биологических объектов, содержащее выполненные из материала с низким коэффициентом теплопроводности корпус, контейнеры для 5 биообъекта и установленный в корпусе с возможностью расположения на поверхности жидкого хладагента держатель контейнеров, включающий диск с гнездами для контейнеров,отличающееся тем,что 10 держатель снабжен крышкой, установленной на диске с образованием между ними полости, расположенной вдоль вертикальной оси диска, трубой с укрепленными на ее концах радиаторами и регулировочным кла- 15

Нативная суспензия клеток

Деконсервированная суспензия клеток, замороженных в устройстве — прототипе

Деконсервированная суспензия клеток, эамо оженных в заявленном ст ойстве паном, установленным в отверстии верхнего конца трубы, при этом диск выполнен утолщенным и имеет образованный вокруг трубы центральный вертикальный канал. расположенную у нижнего основания диска камеру для образования паров хладагента, сообщенную с каналом и с рабочим объемом корпуса ниже предполагаемого уровня хладагента в нем, причем канал связан посредством капиллярных трубок с зонами размещения каждого контейнера для подвода газообразного хладагента к их стенках, верхний радиатор расположен в полости держателя над контейнерами, а нижний — в камере для образования паров хладагента.

1794236

Таблица 4

Составитель В.Кушнеров

Техред M.Mîðãåíòàë Корректор Н.Слободяник

Редактор

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 532 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113635, Москва, Ж-35. Раушская наб., 4/5

Устройство для замораживания биологических объектов Устройство для замораживания биологических объектов Устройство для замораживания биологических объектов Устройство для замораживания биологических объектов Устройство для замораживания биологических объектов Устройство для замораживания биологических объектов 

 

Похожие патенты:

Изобретение относится к средствам индивидуальной защиты человека при работе в среде с высокой температурой или непригодной для дыхания Цель изобретения - уменьшение массы

Криостат // 1768893

Изобретение относится к криогенной технике, а именно к использованию низких температур для длительного (многолетнего) хранения биологических материалов

Изобретение относится к области криогенной техники и предназначено для хранения жидкого гелия в требуемом температурном диапазоне, обеспечивающем работу сверхпроводящего соленоида в части создания и поддержания магнитного поля заданной величины, и может быть использовано при решении ряда научно-технических и прикладных задач, например, для разгрузки накопленного кинетического момента инерционных исполнительных органов (ИИО) системы управления двигателей (СУД) космического корабля (КК)

Изобретение относится к области холодильной технологии

Изобретение относится к области холодильной обработки и хранения пищевых продуктов

Изобретение относится к холодильной технике и предназначено для замораживания продуктов с использованием криогенных жидкостей

Изобретение относится к холодильному технологическому оборудованию, к установкам для замораживания пищевых продуктов путем непосредственного их контакта с жидким азотом

Изобретение относится к области холодильной обработки и хранения пищевых продуктов

Изобретение относится к холодильному технологическому оборудованию и предназначено для замораживания пищевых продуктов при их контакте с криогенной жидкостью
Наверх