Штамм бактерий yersinia рsеudотuвеrсulоsis i серовара, используемый для изготовления протективного антигена

 

Использование: медицинская микробиология , аттенуированный штамм возбудителя псевдотуберкулеза, протективный антиген, псевдомоноз. Сущность изобретения: штамм Yerstnlapseudotuberculosls I ce- ровара Ns 623 KV 9/2 обладает выраженной иммуногенной активностью и протективностьго. Штамм представляет собой аттенуированный двухмаркерный мутант, защищающий экспериментальных животных от развития псевдотуберкулезной инфекции. , Штамм (№ 175) депонирован в коллекцию музея живых культур Государственного НИ- ИСК медицинских биологических препаратов МЗ СССР им. Л.А.Тарасевича.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (2.1) 4912193/13 (22) 19.02.91 (46) 23.02.93. Бюл. М T (71) Ленинградский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера и Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи (72) Г,Я.Ценева, Вик.M.Áîíäaðåíêo, Е.А.Воскресенская и Вл.М.Бондаренко (56) Тимченко H.Ô., Павлова Т.Н., Новикова

О.Д. и др. ЖМЭИ. 1990, N. 11, с. 48-50. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ YERSINIA

PSEUDOTUBERCOL0SlS! СЕРОВАРА, ИСПОЛБЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ

ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА

Изобретение относится к медицинской микробиологии и представляет собой оригинальный аттенуированный штамм возбудителя псевдотуберкулеза наиболее распространенного серовара в качестве протективного антигена.

Цель изобретения — штамм

Y.pseudotuberculosIs I серо вара М 623 К 9/2, обладающий выраженной иммуногенной активностью и протективностью.

Он представляет собой аттенуированный двухмаркерный мутант — кальцийнезависимый вариант, несущий маркеры устойчивости к налидиксовой кислоте (ДНКгираза) и кристаллвиолету (белки наружной мембраны).

„„5U „„1796675 А1 (si)s С 12 N 1/20, А 61 К 39/102 (57) Использование: медицинская микробиология, аттенуированный штамм возбудителя псевдотуберкулеза, протективный антиген; псевдомоноз. Сущность изобретения: штамм Yerstnlapseudotubercutosts t серовара N. 623 KV 9/2 обладает выраженной иммуногенной активностью и протективностью, Штамм представляет собой аттенуированный двухмаркерный мутант, защищающий экспериментальных животных от развития псевдотуберкулезной инфекции.

Штамм (N. 175) депонирован в коллекцию музея живых культур Государственного НИИСК медицинских биологических препаратов МЗ СССР им. Л.А.Тарасевича.

Штамм депонирован в коллекцию музея живых Культур Государственного НИИСК медицинских биологических препаратов М3

СССР, Морфологическая характеристика. Бактерии на мясопептонном arape рН 7,2 при

22 С образуют круглые выпуклые с исчерченным центром колонии, формирующиеся в течение 48 ч. В бульоне — равномерное помутнение, на дне пробирки незначительный осадок. В мазках — грамотрицательные палочки. Бактерии подвижны при выращивании в 0,3-0.5 Р агаре при 22 С. Иерсинии хорошо растут на минимальном aгаре с глюкозой. Формирование колоний наблюдается через 16 — 18 ч при выращивании при 37 С и через 48 ч при 22 С, 1796675

Биохимическая активность. Иерсинии ферментируют глюкозу, галактозу, маннозу, ксилоэу, рамнозу, мальтоэу, маннит и глицерин. Редуцируют нитраты. Уреазопаложительны. Не расщепляют сахароэу, лактозу, раффинозу. дульцит. инозит, сорбит, Не образуют индола и сероводорода, не обладают гемолитическими, плазмокоагулирующими и фибринолитическими свойствами, Не утилизируют цитрат. Не активны в отношении аргинина. лизина иорнитина.

Антигенные свойства. Вступает в реакцию агглютинации с псевдотуберкулезной сывороткой, полученной путем иммунизации кроликов эталонным штаммом Y,pseudotuberculosis I серовара из международной коллекции, Бактерии лизируются паливалентным псевдотуберкулезным бактериофагом, не

20. чувствительны к действию фага Л-413, "С" и Покровской, Генетические особенности. Бактерии утратили плазмиду 47 МД, контролирующую кальцийзависимость и синтез VW-антигенов. Бактерии несут маркеры устойчивости к налидиксовой кислоте и кристаллвиолету, что позволяет дифференцировать их от штаммов естественного происхождения. В некоторых случаях у бактерий может обнаруживаться крупномолекулярная плазмида (криптическая), выявляемая при электрофоретическом излучении профиля плазмидной

Штамм не восстанавливает вирулентных свойств при 10-кратном пассировайии через организм белых мышей, Безопасность штамма генетически обеспечена: отсутствует плазмида 47 МД и связанные с ней некоторые признаки вирулентности— аутоагглютинация и кальцийзависимость.

Бактерии обладают двумя мутациями, свяДНК в 0,7 агарозе.

Патогенные свойства. В отличие от родительского штамм ¹ 623 К V9/2 безвре- 35 ден для лабораторных животных, не вызывает гибели белых мышей, зараженных дозой 1х10 внутрибрюшинно, голодающих морских свинок, зараженных знтерально дозой Зх109. При однократном 40 введении энтерально голодавшим в течение 4 суток морским свинкам 10 бактерий обнаруживаются в области пейеровых бляшек терминальной подвздошной и слепой кишок, вызывая в лимфоидной ткани по- 45 следних и в меэентериальных лимфоузлах гиперплазию и появление специфических для псевдотуберкулезной инфекции эпите;лиоидных гранулем, Однако эти бактерии быстро гибнут, не вызывая даже лейкоци- 50 тарной реакции. занными с аттенуацией (устойчивость к налидиксовой кислоте и кристаллвиолету).

Иммуногенная активность и протективность. При иммунизации кроликов по смешанной схеме 4-х кратно в дозе 14 млрд.м,к.

¹ 623 К v 9/2 формировал выраженный иммунный ответ (средний титр антител

1:3200), У морских свинок значительную концентрацию специфических антител (средний титр 1:800) выявляли после 3-ей иммунизации; на этом сроке отмечен выраженный протективный эффект. Заражение морских свинок 1000 ЛД о вирулентного штамма приводило к выявлению иерсиний в кишечнике в концентрации 2,5х10 на 1 г органа только на 3-и сутки после заражения.

При этом в органах и тканях отсутствовали морфологические изменения, Использование штамма № 623 К ч 9/2 осуществляется следующим образом.

Чистую культуру штамма выращивают на плотной питательной среде (МПА, Хоттингера) при 22 С втечение 48ч. С помощью

0.85% ro раствора хларида натрия смывают клетки с агара и дважды отмывают их в том же растворе путем центрифугирования (5000 об.х15 мин), Затем суспензию используют для иммунизации лабораторных животных в виде живой культуры либо после ее обработки (инактивации) формалином 30%ой концентрации на 5 млрд; м.к. в течение l8-20 ч. Суспензию двукратно отмывают от формалина стерильным 0.85 -ом раствором хлорида натрия путем центрифугирования при 5000 об./мин х 15 мин. Перед использованием концентрацию клеток в суспензии доводят по оптическому стандарту мутности до 10 м.к./мл.

Пример 1, Иммунизацию кроликов проводят по смешанной схеме 4-кратно; l-я иммунизация — внутривенно в дозе 4 млрд. м.к., 2-я — внутримышечно в дозе 2 мл рд. м.к. через четверо суток. 3-я — смешанная в дозе

6 млрд. м,к.(no 2 млрд. м.к. внутривенно, внутримышечно, в область лимфатического узла) через 7 суток. 4-я внутривенно в дозе

2 млрд,м, к. через 7 суток, Через 7 суток после 4-ой иммунизации берут кровь из краевой вены уха кролика и исследуют сыворотку в разведении 1;40—

1:6400 в реакции агглютинации по общепринятой методике, Как правило, выявляется титр специфических антител не ниже 3200. что свидетельствует о выраженной иммуногенности штамма и обосновывает перспективность его использования для конструктирования вакцины.

Пример 2. Иммунизацию морских свинок проводят 3-кратно с интервалами в

7 дней в дозе по 10 м.к. на каждую иммуни

1796675

Формула изобретения

Штамм бактерий Yersinta pseudotubercutosis

l серовара ГИСК N 175, используемый для изготовления протективного антигена, Составитель Г. Ценева

Техред M. Моргентал Корректор Q. Густи

Редактор О. Стенина

Заказ 632 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101 зацию. После 3-ей иммунизации с сыворотками животных ставят реакцию агглютинации по общепринятой методике смешивая по 05 мл культуры штамма (10 м.к./мл) с такими же объемами сыворотки в разаеде- 5 ниях от 1:20 до 1:800. При содержании специфических антител в титре не ниже 1:400 проводят посев 1 заражение высоковирулентным штаммом путем введения энтерально через зонд возбудителя в дозе Зх10 10 м,к. Через 3,6,9,14 суток проводят вскрытие животных и забор проб из органов и тканей.

После их гомогенизации (1 г каждой пробы) в 1 мл физиологического раствора осуществляют посев (по 1 мл) в среду накопления 15

БКД или фосфатно-буферную среду, в которых выдерживают в условиях холодильника.

В сроки — на 3,5,7 сутки осуществляют посев (по 0,1 мл каждой пробы) на плотную питательную среду(МПА или Хоттингера. Через 20

48 ч подсчитывают количество выросших колоний в 1 r исследуемого материала.

Специфическая протективность штамма N- 623 KV 9/2 реализуется тем, что не наступает диссеминации вирулентного штамма в органы и ткани, а высев иерсиний наблюдается из испражнений и кишечника в ранние (не позднее 6 суток) сроки после заражения.

Таким образом, полученный мутант

Y.pseudotubercutosts t 623 KV 9/2 обладает низкой остаточной вирулентностью, выраженной иммунологической специфичностью, защищает экспериментальных животных от развития псевдотуберкулезной инфекции и может быть предложен в качестве перспективного конструирования вакцины.