Способ получения культуральной жидкости sеrrатiа маrсеsсеns, обладающей хитиназной активностью

 

Использование: биотехнология, касается способа получения культуральной жидкости Serratia mercescens с хитиназной активностью. Хитиназа (К.Ф. 3. 2.1.4) может быть использована для биоконверсии хитинсодержащих отходов в белок одноклеточных дрожжей, борьбы с насекомыми и патогенными грибами, вредителями сельскохозяйственных растений, как биохимический реагент в лабораторной практике. Сущность изобретения: осуществляют культивирование мутантного штамма Serratia marcescens ВКПМ В-4870 на среде, содержащей , г/л: цитрат аммония 5,0; глицерин 5,0; К2НРО« 10,0; MgS04«7H20 0.5; NaCI 0,5; FeO/jO,025; кукурузный экстракт 2,5; рН среды 7,6 в течение 24 ч при 30°С с аэрацией. 1 табл. fe

союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 и 9/42//(С 12 N 9

12 R 1:43) ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4907003/13 (22) 02.01.91 (46) 23,03.93, Бюл. М 11 (71) Казанский государственный университет им, В.И.Ульянова-Ленина и Вышневолоцкий завод ферментных препаратов (72) Д.В.Юсупова, О.В.Порфирьева, P.Á,Ñîколова, Е,В.Трухина, И,П.Тюлина, О,С;Синявина, В.И.Гребеньков и С,Ю.Ожерельев (73) Д.В. Юсупова (56) Чигалейчик А.Г., Пириева Д.А. и Рылкин . С.С., Хитиназа Serration marcescens

ВКМВ-851, — Прикладная, биохимия и микробиология, 1976, Т, 12. вып. 4,:с. 581-586.

Roberts R.l . Cabib Е. Serratia

marcescens Chltinaze: one — step purification

and use for the determination of chitin. Annal.

В iochem, 1982, v. 127, N. 2, р. 402 — 412. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ SERRATIA MARCESCENS, Изобретение относится к биотехнологии и касается получения ферментов хитиназ, в частности хитиназы Serratia

marcescens (К.Ф.3.2.1.4), которая может быть использована для биоконверсии хитинсодержащих отходов в белок одноклеточных дрожжей, борьбы с насекомыми, патогенными грибами и нематодами, вредителями сельскохозяйственных рутений, в качестве биохимического реактива при количественном и качественном определении хитина в составе клеточной стенки грибов и других биологических объектов, для разрушения клеточной стенки грибов, Целью изобретения является повышение активности и упрощение способа, . И«, 1804479 АЗ

ОБЛАДАЮЩЕЙ! ХИТИНАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ (57) Использование: биотехнология, касается способа получения культуральной жидкости Serratia mercescens с хитиназной активностью, Хитиназа (К.Ф. 3. 2.1.4) может быть использована для биоконверсии хитинсодержащих отходов в белок одноклеточных дрожжей, борьбы с насекомыми и патогенными грибами, вредителями сельскохозяйственных растений. как биохимический реагент в лабораторной практике.

Сущность изобретения: осуществляют культивирование мутантного штамма Serratia

marcescens ВКПМ В-4870 на среде, содержащей, г/л; цитрат аммония 5,0; глицерин, 5,0; К2НРО4 10,0; MgS04 7Н20 0,5; NaCi 0,5;

Ее040,025; кукурузный экстракт 2,5; рН сре- Я ды 7,6 в течение 24 ч при 30 С с аэрацией.

1 табл, Поставленная цель достигается тем, что мутантный штамм S. marcescens 28-13 (коллекционный номер ВКПМ В-4870) выращивается на водной питательной среде, содержащей в качестве источника углерода — глицерин. источник азота — цитрат аммония. источника фосфора — калий фосфор н окисл ый двузамещенный, источника витаминов — кукурузный экстракт, а таКже натрий хлористый, магний сернокислый и железо сернокислое, Культивирование проводили на качалке в течение 24 ч при 30 С.

Пример 1. При постановке опытов используют среду следующего состава, г/л: глицЕрин 5,0; цитрат аммония 5,0; К2НР04

10,0; MgS04 7H20 0,5; NaCl 0.5: FeS04 0,025:

1804479

55 кукурузный экстракт 15 (no сухой массе). рН среды 7.6.

Подготовка посевного материала. Культуру S. marcescens 28-13 выращивают в течение суток в пробирках со скошенным мясопептонным агаром при 30 С. Выросшие клетки смывают 0,57ь физиологическим раствором. Полученный таким образом посевной материал засевают в колбы с питательной средой из расчета 0,05 оптических единиц Qmo) на мл среды.

Постановка опыта. Посевной материал засевают в конические колбы с 200 мл питательной среды. Отношение обьема питательной среды к объему колбы 1;5. Посевы выращивают на качалке (200 об/мин) при

30 С в течение 72 ч. Пробы отбирают через каждые 24 ч. Бактериальные клетки отделяют центрифугированием при 16000 g в течение 10 мин. В надосадочной жидкости определяют хитиназную активность и содержание белка по методу Лоури.

Определение хитиназной активности.

Хитиназную активность определяют по количеству образующегося при гидролизе коллоидного хитина N-ацетил-0-глюкозамина с динитросалициловой кислотой согласно методике (1).

Инкубационная смесь объемом 1 мл содержит 0 5 мл 0,1 M фосфатного буфера, рН

6,75; 0,4 мл 1,25 ф> коллоидного хитина, 0,1 мл культуральной жидкости. Реакционную смесь инкубируют при 50 С втечение 30 мин.

Затем пробы разбавляют в 2 раза дистиллированной водой, негидролизованный хитин отделяют центрифугированием при

7000 об/мин в течение 10 мин, а в надосадочной жидкости определяют количество Nацетил-D-глюкозамина, Для этого к пробе 1 мл добавляют равный объем реактива, содержащего динитросалициловую кислоту и нагревают в кипящей водяной бане в течение 15 мин. Пробы охлаждают и измеряют поглощейие при 570 нм. Количество N-ацетил-0-глюкозамина рассчитывают по калибровочной кривой, За единицу принимают количество фермента, которое при гидролизе коллоидного хитина освобождает

1 мкМ N-ацетил-Р-глюкозамина за 1 ч инкубации.

Коллоидный хитин получают согласно известной методике. К 1 г тонко размолотого хитина добавляют последовательно 5 мл ацетона и 30 мл концентрированной соляной кислоты при постоянном перемешивании. Полученную однородную смесь фильтруют через стеклоткань так, чтобы фильтрат поступал в колбу, содержащую 1,5 л

307ь-ного этанола при постоянном переме5

35 шивании. Через 2 ч хлопья коллоидно о хитина отделяют центрифугированием при

3000 g 30 мин и отмывают от кислоты дистиллированной водой до нейтрального рН.

Коллоидный хитин дополнительно гомогенизируют, диализуют в течение суток против воды и используют в опытах.

Уровень хитинаэной активности через

24 ч выращивания равнялся 117 ед, через 48 ч 122 ед. через 72 ч 123 ед. Таким образом, высокий уровень хитиназной активности в культуральной жидкости достигается на 24 ч культивирования и практически не увеличивается в процессе дальнейшего выращивания бактерий в течение 72 ч, Уровень хитинаэной активности. равный 117 — 127 ед на мл культуральной жидкости, в 2,2 раза превышает хитинаэную активность, полученную ранее (прототип).

Сравнительные данные хитинаэной активности S. marcescens, полученные различными авторами при использовании разных способов, суммированы е таблице.

Таким образом. предлагаемый нами способ получения культуральной жидкости

S. marcescens с хитинаэной активностью позволяет на более простой среде, не содержащей хитина, за более короткое время ферментации получить вдвое большее количество хитиназы. Штамм 28-13 внедряется в производство как высокопродуктивный продуцент эндонуклеазы. Предлагаемый способ получения культуральной жидкости с хитинаэной активностью с использованием щтамма 28 — 13 не требует изменений в технологическом процессе при его внедрении в производство.

Формула изобретения

Способ получения культуральной жидкости Serratia marcescens, обладающей хитиназной активностью, предусматривающий культивирование в условиях аэрации и перемешивания штамма продуцента на водной питательной среде, содержащей источники углерода, азота, витаминов. фосфора и сернокислый магний, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения активности и упрощения способа, в качестве продуцента используют штамм Serratia marcescens

ВКПМ B — 4870, культивирование ведут в течение 24 ч на среде. дополнительно содержащей хлористый натрий. сернокислое железо, в качестве источника углерода— глицерин, источника азота — цитрат аммония, источника фосфора — фосфорнокислый двузамещенный калий и источника витаминов — кукурузный экстр, кт.

1804419

П р и м е ч а н и е. N-АГА-N-ацетил-D-глюкозамин.

Редактор.Т, Куркова

Составитель Д. Юсупова

Техред М.Моргентал Корректор Н.Гунько

Производственно-издательский комбинат "Патент"; г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 1071 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж 35, Раушская наб., 4/5