Штамм бактерий рsеudомоnаs рuтidа для получения препарата, используемого для стимуляции роста растений и защиты растений от грибов рода fusаriuм и бактерий erwinia

 

Использование: может быть использован для получения бактериального препарата для стимуляции роста растений и защиты растений от грибов рода Fusarium и бактерий Erwinia. Сущность изобретения: штамм бактерий Pseudomonas putida BKM В-1743Д выделен из ризосферы дикорастущих злаков в Армянской ССР. Хорошо растет на различных средах в том числе синтетических, в условиях аэрации при 30°С, рН 7,0-7,5. Для получения препарата штамм выращивают на МПБ до концентрации 10 кл/мл. Препарат обладает способностью к подавлению роста фитопатогенных грибов рода Fusarium, стимулирует рост растений, обладает способностью растворять минеральные фосфаты. 5 табл.

СОГОЗ СОВЕTt:КИХ

СОЦИАЛИСТ ИВЕ СКИХ

РЕСГ!УБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4843529/13 (22) 26.06.90 (46) 30.03.93, Бюл. Nt 12 (71) Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР (72) В.В.Кочетков, Н.П.Скворцова„А. -I,Äóбейковский и А,M,Áîðîíèí (73) Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (56) Авторское свидетельство СССР № 853846, кл. А 01 N 63/00, 1977, Авторское свидетельство СССР

¹ 11662211550088, кл, С 12 N1/20,,1990. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS

PUTIDA ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА, ИСПОЛЬЗУЕМОГО ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА РАСТЕНИЙ И ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ ОТ

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма бактерий

Рзеиботопаз putida, . который может быть использован для получения бактериального препарата для защиты растений от фитопатогенных грибов рода Fusarium и бактерий рода Erwinla или для стимуляции роста рас, тений, Целью изобретения было получение нового штамма Pseudomonas putida, обладающего способностью к подавлению роста фитопатогенных грибов рода Pseudomonas и бактерий Erwinia и стимуляции роста растений, Штамм Pseudomonas putida BS1380 был выделен из рихосферы дикорастущих. х0 1805849 А3 (я>5 А 01 N 63/00, С 12 N 1/20

ГРИБОВ РОДА FUSARIUM И БАКТЕРИЙ

E RW IN I A (57) Использование: может быть использован для получения бактериального препарата для стимуляции роста растений и защиты растений от грибов рода Fusarlum и бактерий

Erwinia. Сущность изобретения: штамм бактерий Pseudomonas putida ВКМ В-1743Д выделен из ризосферы дикорастущих злаков в

Армянской ССР. Хорошо растет на различных средах в том числе синтетических, в условиях аэрации при 30 С, рН 7,0 — 7,5. Для получения препарата штамм выращивают на МПБ до концентрации 10 кл/мл. Препарат обладает, 9 способностью к подавлению роста фитопатогенных грибов рода Fusarium, стимулирует рост растений, обладает способностью растворять минеральные фосфаты. 5 табл. злаков в Армянской ССР с использованием О селективных сред Кинга В и Sl. Основными критериями отбора служили стимуляция роста растений и подавление роста фитопатогенных грибов рода Fusarium и бактерий ОО рода Erwlnia. Ф

Состав среды Кинга В (г/л); . О пептон — 20 глицерин (мл) — 10

MgS0< х 7Н20 — 1.5

6д агар — 15

Состав среды Sl (г/л) сахароза †. 10 глицерин (мл) — 10 гидролизат казвина — 5

МаНСОз — 1

1805849

М9504 х 7Н20 — 1

KpHP0q — 2,3 саркоэил — 1,2 триметоприм (мг) — 20 агар — 15 5

Штамм Pseudomonas putida BS1380депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при ИБФМ PAH под номером

BKM В-1743Д, Штамм P.putida ВКМ В-11743 обладает следующими свойствами: .

Культурально-морфологические признаки

Клетки палочковидные, размером (2,2—

3,2) х (0,6 — 0,9) мк, подвижные, перитрихи, грамотрицательные, спор не образуют, Размеры клеток даны для односуточной культуры, выращенной на МПА при 30 град, Штамм хорошо растет на следующих средах: МПБ (мясопептонный бульон). Кинга В; пептон — 20 г/л, глицерин — 10 мл/л, MgS0q х Н20 — 1.5 г/л; на.минимальной. синтетической среде М9 следующего состава: KzHP04 — 7 г/л, КН Р04 — 3 г/л, МН4С!—

1 г/л, глюкоза — 1 г/л, На мясопептойном агаре колонии гладкие, блестящие, с ровными краями, В мясопептонном бульоне наблюдается помутнение, осадок и желто-зеленый флуоресцирующий пигмент.

На стандартных средах Кинга продуцирует желто-зеленый флуоресцирующий пигмент, фенаэиновые пигменты не образуют.

Физиолого-биохимические признаки

Облигатный азроб, температурный on- 35 тимум роста 28-30 С, не растет при 41 С, оптимум рН 7,0 — 7,5.

Нитраты редуцирует, желатину не разжижает, молоко we пептонизирует, не использует в качестве источников углерода 40 трегалозу и д-ксилозу, утилизирует этиловый спирт.

Ассимилирует аммонийный и нитратный азот, В качестве источника углерода использует д-глюкозу, д-фруктозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, ацетат, пропинат, бутират. сукцинат, пируват, фумарат, бензоат, лактат, цитрат, катехол, протокатехоат.

Оксидазная реакция положительная.

Аргининдегидролаза присутствует.. 50

Условия хранения штамма:

Штамм бактерий Pseudomonas putida

BKM В-1743Д хранят на чашках. косяках с

МПА, или со средой Кинга В при 5-7 C.

Пересевы на свежие среды — один раз в месяц. Может храниться не менее 1 года в

15 Д глицерине при -20-70"С, в лиофильновысушенном состоянии с сахаро-желатиновым агаром. или в полужидкой агаризованной среде под вазелиновым маслом следующего состава:

Nutrient Broth (0ifco) — 4 г/л

NaCl — 5 г/л агар — 6 г/л рН -6,8

Штамм P.putida ВКМ В-1743Д не патогенен и имеет генетическую метку — устойчивость к рифампицину (100-200 мкгlмл), что позволяет контролировать его приживаемость на корнях растений, Для инокулирования семян используют биомассу клеток штамма F.putida ВКМ В1743Д, выращенную в жидкой среде Кинга

В или в мясопептонном бульоне (МПБ) на качалке при 30 С в течение 16-18 часов. Обработку семян производят из расчета 10 — . б

10 клеток на 1 г семян.

Пример ы 1-3, демонстрирующие антагонизм штамма F.putida ВКМ В-1743Д в отношении фитопатогенных грибов рода .F u sa rium.

Пример 1. Штамм P.putida ВКМ

В-1743Д выращивают на среде МПБ до плотности 10 кл/мл, 1 мл "ночной культуры" осаждают с помощью шприца Miilipore на нитроцеллюлозный фильтр 0,45 мкм

Millipore. Фильтр помещают на чашку с сусло-агаром или средой Чапека, содержащей предварительно внесенный мицелий фигопатогенного гриба Fusarium moniliformi, Чашку инкубируют при комнатной температуре (25 С) s течение 3-4 суток и визуально регистрируют зоны подавления грибного роста вокруг фильтров. Зоны угнетения ро-. ста грибного мицелия штаммом P.Putida

BKM В-1743Д вокруг фильтра составляют от

12 до 17 мм.

Пример 2. Осуществляют аналогично примеру 1, но в качестве индикаторного фитопатогенного гриба используют Pusarium

hetегоsporum, Зоны угнетения роста грибного мицелия F,hetегоsporum штаммом

F.putida BKM В-1743Д составляют от 10 дб

15 мм.

Пример 3. Осуществляют аналогично примеру 1, используя в качестве индикаторного фитопатогенного гриба Fusarium

solani. Зоны угнетения роста мицелия

F,solani штаммом F.putida BKM В-1743Д составляют от 10 до 15 мм, Пример ы 4 — 6, демонстрирующие антагонизм штамма Р.putida ВКМ В-174ЗД в отношении фитопатогенных бактерий рода Erwlnia.

Пример 4. На чашку MllA высевают штрихом штамм P.putida BKM В-1743Д и выращивают при 30 С в течение 24 часов.

Затем на поверхность чашки наносят с помощью пульверизатора сугпенэию клеток

1805849

Через 5 дней роста растений в климатической камере при 25ОС сравнивают размеры- контрольных (необработанных) и опытных растений (рис.4). Высота опытных растений на 5-е сутки составляет в среднем

103+6,5 мм, а контрольных — 50й15 мм.

Пример 9. Осуществляют аналогично примеру 8, используя, в отличие от примера

8, семена капусты сорта "Июньская". Скорость прорастания опытных растений также превышает скорость прорастания контрольных растений, Высота опытных растений на

7 сутки составляет 50 12 мм, э контрольных — 30+8 мм.

Как видно из примеров 8 и 9, предлагаемый штамм Ps, putida ВКМ В-1743Д обладает способностью стимулировать рост редиса и капусты в гнотобиотических условиях, Таким образом, в предыдущих примерах показаны два типа стимуляции роста растений: непрямая или опосредованная стимуляция за счет подавления почвенных фитопатогенов; прямая стимуляция роста растений в.отсутствии фитопатогенов (гнотобиотические условия), по-видимому, за счет непосредственного воздействия штамма на растение, Одним из таких механизмов прямой стимуляции является. по-видимому, способность штамма растворять минеральные фосфаты. Стимуляция роста растений складывается из опосредованной стимуляции (эа счет подавления фитопатогенов) (пример 7) и прямой стимуляции в отсутствие фитопатогенов (пример 8,9).

Пример 10. Демонстрирующий способность штамма P.putida BKM В-1743Д растворять минеральные фосфаты. Используется- метод для идентификации растворения минеральных фосфатов бактериями

Erwinia herbicola, Готовят среду. содержащую 2 очищенного агара (purified agar

Dlfco); 1 глюкозы, 0,1 М9504, 0,1 NaCI и 0,5 NH4CI, В качестве источника нерастворимого фосфата используют гидроксилапатит (ГАП), подготовленный следующим образом, ГАП стерилизуют автоклавированием, отмывают 10 раз стерильной бидистиллированной водой, высушивают и растирают в стерильных условиях до получения гомогенного пудрообразного порошка. К 100 мл минеральной среды добавляют 5 г порошка ГАП, доводят рН до

7,2 (1N NaOH) и по 10 мл этой среды наслаивают в чашки Петри на 10 мл предварительно разлитого 1 очищенного агара. В приготовленной таким образом среде содержание водорастворимых фосфатов составляет менее 1 мм. Культуры в

45 растений на 82 и 63% соответственно. 3ащитный эффект достигается путем эффек50

5

35 стационарной фазе роста высевают на чашки с указанной средой и через 48 часов регистрируют зоны растворения ГАП.

Используемые в качестве положительного контроля 6 штаммов бактерий рода

Erwinia очень слабо растворяют ГАП. Штаммы Е.coll В и P.putida 40а не способны к растворению ГАП и росту на этой среде.

Штамм P.putida ВКМ В-1743Д хорошо растет и на этой среде образует прозрачные зоны растворения ГАП.

Пример 11. Действие препарата на основе штамма Р.putida ВКМ В-1743Д на инфицированные фитопатогенными грибами рода Fusarium растения.

Семена огурцов сорта "Тепличный" и томатов сорта "Черный принц" инокулируют в суспензии штамма, как указано выше.

Предварительно готовят почву, инфицированную фитопатогенными грибами,.В стерильную почву (простерилизованную автоклавированием в течение 1 часа при 1 атм.) вносят гомогенизированную и разведенную в 100 раз смесь 5-суточного мицелия фитопатогенных грибов Fusarium

hetегоsporum, F.moniliforml, F.solani èç расчета 100 мл суспензии на 500 г стерильной почвы.

Семена огурцов и томатов, инокулированные бактериальной суспензией и контрольные — . неинокулированные, высаживались в горшки с инфицированной почвой в 12-ти повторностях. Через 10 — 20 дней роста в климатической камере проводят учет заболевших растений, имеющих типичные признаки корневых гнилей и фузариозного увядания.

Данные этого эксперимента представлены в табл.3.

Как видно из табл,З, обработка семян огурцов и томатов штаммов Р,putida ВКМ

B-1743Д в условиях искусственного фитопатогенного фона уменьшает заболеваемость. тивной колонизации корней растений клетками штамма Р.putida BKM В-1743Д и супрессии этим штаммом грибов рода

Fusarium. Штамм P.putida АКМ В-1743Д показал высокую проживаемость на корнях растений. К концу эксперимента титр штамма составлял в среднем 10 клеток на 1 г

6 корня.

Пример 12, Использование препарата на основе штамма Р,putida ВКМ В-1743Д для защиты капусты в условиях естественного фитопатогенного фона.

Семена капусты сортов "Слава", "Подарок","Дауэрвайс" обрабатывают суспен1805849

15

25

30 вание культуры осуществляют при 30 С на качалке (250 об/мин) в течение 12-16 часов до конечного титра (3-5) х 10 клеток/мл. 50

При необходимости суспензию клеток раз55 (10 кл/мл) фитопатогенных бактерий

Erwlnia carotovor a чаг. carotovora. Г1осле инкубирования чашек в течение 24 часов при

30ОС визуально регистрируют зоны подавления роста фитопатогенных бактерий вокруг штриха штамма P.putida BKM В-1743Д.

На рис.2 представлено подавление роста фитопатогенного штамма бактерий Erw.

carotovora чаг, сагосочога несколькими штаммами-антагонистами из коллекции лаборатории биологии плазмид ИБФМ РАН, в том числе и штаммом P.putlda BKM В1743Д. Зоны угнетения роста фиЪопатогенных бактерий Егч.Carotovora чаг. carotovora штаммом P.ðutida ВКМ В-1743Д составляют

8-12 мм, чтоуказывает на антагонизм LUTaMма Р,putida ВКМ В-1743Д в отношении этого вида фитопатогенных бактерий.

Пример 5. Осуществляют аналогично примеру 4, используя в качестве индикаторных фитопатогенных бактерий штамм

Erw.carotovora чаг.atroseptica. Зоны угнетения роста этих фитопатогенных бактерий штаммом P.putida ВКМ В-1743Дсоставляют

10-13 мм, что показывает антагонистические возможности штамма P.putida ВКМ

В-1743Д в отношении фитопатогенных бактерий Erw.. carotovora var.atroseptica.

Пример 6. Осуществляют аналогично примеру 4, используя в качестве индикаторной культуры фитопатогенные бактерии

Erv.herbicola, Зоны угнетения роста

Erv.herbicola штаммом Р,putida BKM. В1743Д составляет 10-12 мм, что также указывает на антагонизм штамма P.putida ВКМ

В-1743Д в отношении этого вида фитопатогенных бактерий, Пример 7, демонстрирующий способность штамма P.putida BKM В-1743Д подавлять рост фитопатогенов в ризосфере огурцов.

Семена огурцов сорта "Тепличный" инакулируют в суспензии клеток штамма, как указано выше, Суспензию готовят следующим образом; в колбы емкостью 750 мл заливают 250 мл стерильной среды Кинга В или МПБ,,вносят в нее стационарную культуру штамма в количестве 1 — 2 мл. Выращибавляют Na-фосфатным буфером (рН 7,0) или водопроводной водсй, Предварительно готовят почву с естественным фитопатогенным фоном, взятую из очагов гибели огурцов от корневых гнилей. В зараженную почву высевают обработанные и контрольные — необработанные семена. Через 2 недели роста в климатической камере при

25 С сравнивают размеры опытных и конт35

40 рольных растений. Как видна из табл.1, обработка семян клетками штамма P.putida

BKM В-1743Д приводит к двукратному увеличению всех параметров роста огурцов в условиях фитопатогенного фона.

В примере показано, что обработка семян огурцов суспензией клеток штамма приводит к увеличению роста огурцов в условиях фитопатогенного фона, Т,е, показан супрессирующий эффект инокуляции штаммом P.putida ВКМ В-1743Д в естественных условиях, Данная почва показывает при анализе высокий фон фитопатогенных грибов и бактерий с преобладанием грибов роста Fusarium. Инокубированные и неинокулированные семена огурцов сорта

"Тепличный" высевают не только в почву с естественным фитопатогенным фоном, но и в стерильную почву (простерилизованную автоклавированием в течение 1 часа. при 1 атм). При этом получают следующие данные, представленные в табл.2.

Сравнение этих данных с данными табл.1 показывает, что стерилизация почвы приводит к эффекту, сравнимому с эффектом бактеризации семян в условиях фитопатогенного фона, Бактеризация семян в условиях стерильной почвы дает незначительный стимулирующий эффект, Это указывает на то, что основным механизмом стимуляции в этом эксперименте является супрессия почвенных фитопатогенов штаммом P.putida ВКМ-1743Д.

Примеры 8,9 демонстрируют способность штамма P.putida ВКМ В-1743Д стимулировать рост растений в гнотобиотических условиях, Пример 8, Семена редиса сорта

"Тепличный" обрабатывают в течение 30 мин. 10% раствором Hz0z и проверяют на стерильность, выдерживая на чашках с

МПА. Нестерильные семена, образующие на МПА зоны бактериального или грибного роста, выбраковывают. Обработку стерильных семян штаммом P.putlda ВКМ В-1743Д проводят как в примере 7. Семена высевают в пробирку со стерильной средой следую- . щего состава: (на 1 л).

CaClz х 2Hz0 0,44 r

ККОз .1,9 r

Kl 0,83 мг

Са(КО@ х 6НгО 0,036 мг

КНгРО4 0,17 г

КзВОз 6,2 мг

NazMo04 х 2HzO 0,25 мг

MgS04 х 7Н20 0,37 г

MnS04 х 4Hz0 22 гм

CuS04 х 5HzG 0,025 мг

ZnSQ4 х 7Н20 8,6 мг

FeS04 16,5 мг

Маг х ЭДТА 16,7 мг

1805849

Таблица 1

Влияние предпосевной обработки семян огурцов штаммом

P.putida BKM B-1743Д на рост растений зией штамма BKM В-1743Д, как указано выше. В дальнейшем проводят три обработки вегетирующих растений в следующих фазах роста: первая — 5-7 настоящих листьев; вторая — завязывание кочана; третья — средне- 5 го кочана. Обработку проводят суспензией клеток плотностью 10 кл/мл пои средней инокуляционной нагрузке Зх10 клеток на одно растение. Эксперимент проводят в условиях высокого естественного фитопато- 10 генного фона, включающего грибы рода

Fusarium. Результаты эксперимента представлены в табл,4, Обработка семян и вегетирующих рас- 15 тений препаратом штамма приводит к снижению заболевания капусты, в естественных условиях на 17 /, Пример 13. Бактерий рода Erwinla являются основным возбудителем корневой 20 гнили картофеля.

Проверка эффекта обработки картофеля штаммом ВКМ-В1743Д проводилась также в, естественных условиях, т.е. на природном бэзальном фоне почвенных патогенов. 25

Исследования проводились нэ картофеле сорта "Невский". Клубни обрабатывали с использованием рэспылительной установки. Норма расхода бактериальной суспен- 30

1G зии плотностью 10 кл/мл составляла 0,5 л на 1 т посадочного материала. Посадочный материал весом 3,6 т высажен нэ опытном участке площадью 0,4 га.

Конечный показатель — урожай картофеля с опытного участка, Данные сравнения урожая с опытного и контрольного участка той же площади представлены в табл.5.

Таким образом штамм Pseudomonas

putida BKM В-1743Д обладает способностью к подавлению роста фитопатогенных грибов: Fusarium moniiiformi, Fusarium

hetегоsporum, Fusarium solani и бактерий

Erwinla саго очога var. carotovora, Erwlnla

carotovora var. atrosptica, Erwinla herbico1a.

Штамм не токсичен, не патогенен по отношению к растениям, обладает стимулирующим действием на рост растений, снижает заболеваемость при инфекции фитопатогенными грибами родэ Fusorlum,.oáëàäàåò способностью растворять минеральные фосфаты, что позволяет использовать этот штамм для создания íà его основе препарата, предназначенного для стимуляции роста растений и защиты их от грибов рода

Fusarium и бактерий рода Erwinia.

Формула изобретения

Штамм бактерий Pseudomonas putida

ВКМ В-1743 Д для получения препарата, используемого для стимуляции роста растений и защиты растений от грибов рода

Fusarium и бактерий Erwinia, 1805849

12 Таблица 2

Влияние предпосевной обработки семян огурцов штаммом

P.putida ВКМ В-1743Д на рост растений в стерильной почве

Таблица 3

Защитный эффект штамма P, putlda BKM В-1743Д в условиях искусственного фитопатогенного фона

Таблица 4

Защитный эффект штамма P.putida BKM В-1743Д в условиях

I естественного фитопатогенного фона

Таблица 5

Составитель О. Красникова

Редактор А.Павловская Техред M.Ìoðãåíòàë Корректор Л,Филь

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 948 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Штамм бактерий рsеudомоnаs рuтidа для получения препарата, используемого для стимуляции роста растений и защиты растений от грибов рода fusаriuм и бактерий erwinia Штамм бактерий рsеudомоnаs рuтidа для получения препарата, используемого для стимуляции роста растений и защиты растений от грибов рода fusаriuм и бактерий erwinia Штамм бактерий рsеudомоnаs рuтidа для получения препарата, используемого для стимуляции роста растений и защиты растений от грибов рода fusаriuм и бактерий erwinia Штамм бактерий рsеudомоnаs рuтidа для получения препарата, используемого для стимуляции роста растений и защиты растений от грибов рода fusаriuм и бактерий erwinia Штамм бактерий рsеudомоnаs рuтidа для получения препарата, используемого для стимуляции роста растений и защиты растений от грибов рода fusаriuм и бактерий erwinia Штамм бактерий рsеudомоnаs рuтidа для получения препарата, используемого для стимуляции роста растений и защиты растений от грибов рода fusаriuм и бактерий erwinia 

 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при изготовлении экзотоксинсодержащих биологических препаратов средств защиты растений

Изобретение относится к сельскому хозяйству и касается продуктов микроорганизмов, стимулирующих развитие и повышающих урожайность сельскохозяйственных растений
Наверх